JPH10500844A

JPH10500844A - 改良されたバチルス・チューリンギエンシスδ−内毒素

Info

Publication number: JPH10500844A
Application number: JP7528999A
Authority: JP
Inventors: マーク．トンプソン; ジョージイー．スクワブ; エイチアーネスト．シュンフ; ブライアン．ストックホッフ
Original assignee: マイコーゲンコーポレーション
Priority date: 1994-05-06
Filing date: 1995-05-05
Publication date: 1998-01-27
Also published as: AU2461195A; US5932209A; US5593881A; CA2187534A1; EP0759989A1; WO1995030752A1; AU699752B2

Abstract

(57)【要約】改良されたバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）(B.t.)デルタ-内毒素を、該毒素をコードする遺伝子を改変して作出した。天然のプロ毒素部分を別のプロ毒素部分で置き換えて、キメラ毒素遺伝子を構築することによって、B.t.毒素の毒性が向上した。

Description

【発明の詳細な説明】改良されたバチルス・チューリンギエンシスδ−内毒素発明の背景土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）(B.t.) は、グラム陽性で、胞子を形成する細菌であり、パラ胞子的(parasporal)な結晶性蛋白質の封入体を特徴とする。これらの封入体は、しばしば、特殊な形状の結晶として顕微鏡で見ることができる。この蛋白質は、病原生物に対して非常に毒性が強く、特異的な毒素活性を示すことがある。ある種のB.t.毒素遺伝子が単離されて配列が決定されており、組み換えDNAによるB.t.産物が製造され、使用が認められている。さらに、遺伝子工学技術を用いてこれらのB.t.内毒素を農業環境に取り入れさせるために、害虫抵抗性に関する内毒素遺伝子を用いて遺伝子工学的に改良した植物を用いたり、安定化した微生物細胞そのものをB.t.内毒素の運搬体として用いることを含む、新しい方法が開発中である(Gaetner，F.H.，L ．Kim［1988］TIBTECH 6:S4-S7)。このように、単離されたB.t.内毒素が、商業上の価値を持ちつつある。 10年前まで、B.t.農薬の商業的な利用は、鱗翅目(毛虫)の害虫に対してだけという、狭い範囲に大きく制限されていた。バチルス・チューリンギエンシス・クルスタキ亜種（Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki）から調製された胞子および結晶が、長い間、鱗翅目(毛虫)用の殺虫剤として商業的に用いられてきた。例えば、B.チューリンギエンシス・クルスタキHD-1変種（B．thuringiensis v ar．kurstaki HD-1）は、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を示すδ-内毒素の結晶を産生する。しかし、近年になって、研究者たちは、ずっと広い範囲の害虫に特異性をもつ B.t.農薬を発見した。例えば、別のB.t.種、すなわち、イスラエレンシス（isra elensis）およびテネブリオニス（tenebrionis）(B.t.M-7、B.t．san diegoとしても知られている)が、それぞれ、双翅目とコルコプテラ（Colcoptera）目の昆虫を抑制するために商業的に用いられている(Gaetner，F.H.,[1989] 作物防御剤の制御的輸送「殺虫蛋白質の細胞内運搬系：生存微生物と非生存微生物」（"C ellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Livin g Mi croorganisms"，in Controlled Delivery of Crop Protection Agents）、R.M.W ilkins，ed.，Taylor and Francis，New York and London，1990，pp.245-255) 。また、「Couch，T.L.（1980）"バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変種の蚊に対する病原性（Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuring iensis var.israelensis）",Developments in Industrial Microbiology 22:61- 76」、「Beegle，C.C.(1978)”農業環境系における昆虫に発生する細菌の利用（ Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems）”Developments in Indust rial Microbiology 20:97-104」も参照のこと。「Krieg，A.，A.M．Huger，G.A. Langenbruch，W．Schnetter(1983)Z．ang．Ent．96: 500-508」は、バチルス・チューリンギエンシス・テネブリオニス変種（Bacillus thuringiensis var．te nebrionis）について述べ、これが鞘翅目の２種の甲虫に対して活性があることを報告している。それらは、コロラド・ジャガイモ甲虫のレプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）およびアゲラスチカ・アルニ（Agela stica alni）である。最近、新しいB.t.の亜種が同定され、活性δ内毒素に関連する蛋白質をコードする遺伝子が単離された(Hofte，H.，H.R．Whiteley［1989］Microbiological R eviews 52(2):242-255)。ヘフテ（Hofte）およびウィトリー（Whiteley）は、B. t.結晶蛋白質遺伝子を４種類に大別した。これらは、CryI(鱗翅目特異的)、CryI I(鱗翅目および双翅目特異的)、CryIII(鞘翅目特異的)、およびCryIV(双翅目)である。他の害虫に特異的に有毒な菌株が発見されたことも報告されている(Feite lson，J.S.，J.Payne，L．Kim［1992］Bio/Technology 10:271-275)。 B.t.結晶蛋白質遺伝子の大腸菌におけるクローニングおよび発現が、発表文献に開示されている(Schnepf，H.E.，H.R．Whiteley［1981］Proc．Natl．Acad．S ci．USA 78:2893-2897)。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号はいずれも、B.t.結晶蛋白質の大腸菌における発現を開示している。毒性を強化し、標的害虫に対する宿主範囲の拡大を示すハイブリッドB.t.結晶蛋白質が作成されている。米国特許第5,238,130号および第5,055,294号を参照のこと。米国特許第4,797,276号および第4,853,331号は、さまざまな環境で鞘翅目を抑制するために用いることができるB.チューリンギエンシス（B．thuringiensis）テネブリオニス（tenebrionis）株(M-7、B.t．san diegoとしても知られている)を開示している。米国特許第4,918,006号は、双翅目に対する活性をもつB.t.毒素を開示している。米国特許第4,849,217号は、アルファルファ・ゾウムシ（alfalfa weevi l）に対して活性をもつB.t.単離物を開示している。米国特許第5,208,077号は、活性バチルス・チューリンギエンシス単離物を開示している。米国特許第5,151, 363号および米国特許第4,948,734号は、線虫に対する活性をもつB.t.単離物を開示している。多くの研究と資源の投入の結果、新しいB.t.単離物およびB.t.単離物の新しい利用に関する他の特許が発行されている。しかし、新しいB.t.単離物の発見および既知のB.t.単離物の新しい利用は、依然として経験に依存する予測不可能な技術である。バチルス・チューリンギエンシスのδ-内毒素結晶蛋白質分子は、二つの機能部分からなる。プロテアーゼ抵抗性コア毒素が第一の部分で、蛋白質分子の前方の約半分に相当する。cryIIIA B.t.δ-内毒素のコア部分の三次元構造が明らかにされており、すべての関連毒素が同じ全体構造をもつと云われている(Li，J. ，J．Carroll，D.J．Ellar［1991］Nature 353:815-821)。この分子の後ろの半分が第二の部分である。本願のため、本明細書において、この第二の部分を「プロ毒素分節」と呼ぶことにする。プロ毒素分節は、毒素の結晶形成に関与すると考えられている(Arvidson，H.，P.E．Dunn，S．Strand，A.I．Aronson［1989］M olecular Microbiology 3:1533-1534; Choma，C.T.，W.K.Surewicz，P.R．Carey ，M．Pozsgay，T．Raynor，H．Kaplan［1990］Eur．J.Biochem．189:523-527)。全長毒素分子は、昆虫の腸の中でプロテアーゼにより速やかに処理されて、抵抗性コア分節になる。このように、プロ毒素分節は、毒素分子をプロセシングするプロテアーゼを減少させ、コア部分が昆虫に接近しにくくすることによって(Hai nder，M.Z.，B.H．Knowles，D.J．Ellar［1986］Eur．J．Biochem.156:531-540) 、または毒素の可溶性を低下させることによって(Aronson，A.I.，E.S．Han，W ．McGaughey，D．Johnson［1991］Appl．Environ．Microbiol.57:981-986)、毒素に対する昆虫の特異性を部分的に担っているのかもしれない。毒素ドメインで結合したキメラ蛋白質が、CryICとCryIA(b)の間で報告されている(Honee，G.，D．Convents，J．Van Rie，S．Jansens，M．Perferoen，B．Vi ss er[1991]Mol．Microbiol．5:2799-2806)が、これらのキメラ蛋白質の活性は、適当な昆虫に対するCryICと較べると、非常に低いか、検出できないほどである。ハニーら(Honee，G.,W．Vriezen，B．Visser［1990］Appl．Environ．Microbi ol．56:823-825)はまた、CryICおよびCryIA(b)の毒素ドメインを直列に連結することによるキメラ融合蛋白質の作出を報告した。その結果できた蛋白質は、各毒素の活性を組み合わせた活性に相当する、広い活性スペクトルを示した。しかし、そのキメラの活性は、標的昆虫のいずれに対しても増加しなかった。発明の概要本発明は、天然のプロ毒素のアミノ酸を別のプロ毒素の配列で置き換え、キメラ毒素を得ることにより、バチルス・チューリンギエンシス(B.t.)δ-内毒素の活性を実質的に改良することができるという発見に関する。本発明の特別な態様において、キメラ毒素は、cryIA(b)プロ毒素分節の全部または一部を、天然のcr yICプロ毒素分節の全部または一部で置換することによって組み立てられている。cryIC/cryIA(b)キメラ毒素は、天然の遺伝子によって産生されるcryIC/cryIC 毒素よりも強い毒性を示す。本発明の一つの面は、利点の多いキメラ毒素をコードする遺伝子に関する。特別な例としては、キメラ毒素のN末端側のcryICコアの毒素部分をコードするDNA と、毒素のcryIA(b)C末端側のプロ毒素部分をコードするDNAとを含む遺伝子である。さらに、本発明は、鱗翅目の害虫を抑制する方法における、キメラ毒素の利用、またはキメラ毒素をコードする遺伝子を含む微生物の利用に関する。本発明はまた、本請求の範囲の毒素をコードするキメラ遺伝子の利用を含む。キメラ遺伝子は、広範囲の微生物または植物の宿主に導入することができる。本発明の、鱗翅目活性のある毒素を産生させるために、キメラ遺伝子を発現する形質転換宿主を用いることができる。形質転換した宿主は、殺虫毒素を産生するために用いることができ、また、毒素を産生するよう形質転換された植物細胞では、植物が害虫の攻撃に対して抵抗性になる。またさらに本発明は、本発明のキメラ毒素を産生する、実質的に完全な組み換え細胞を処理することを含む。実質的に完全な細胞を標的害虫の環境に適用する際、鱗翅目に対する活性の期間を伸ばすために細胞を処理する。この処理は、選択した方法が殺虫剤の性質に有害な影響を及ぼさず、細胞の殺虫因子を保護する機能を奪わない限り、化学的方法によっても、物理的方法によっても、化学的方法と物理的方法とを組み合わせた方法によってもよい。処理された細胞は、殺虫毒素の保護外被の作用をする。毒素は、標的昆虫に摂取されて活性化する。図面の簡単な説明図１−pMYC1050からBamHI部位を除去して、クレノウポリメラーゼで平滑化し、プラスミドpMYC1050△BamHIを作成する。クローニングを効率的に行うため、毒素のオープンリーディングフレームの大部分を含むNsiI DNA断片をpGEM5中にクローニングする。得られるプラスミドをpGEMtoxと名付ける。C＝ClaI、H＝Hin dIII。図２−スプライス・オーバーラップ伸長反応(SOE)技術によって、毒素DNAにBa mHIおよびPvuIクローニング部位を導入した。新しい部位をもつDNA断片をpGEMto xの相同なDNA断片に置き換えるために用いる。得られるプラスミドは、pGEMtoxB amHIまたはpGEMtox Pvulである。矢印の下のAからGの文字は、本文中のオリゴヌクレオチドプライマーに相当する。縦線の上の文字は、制限酵素部位に相当する。B＝BamHI、C＝ClaI、H＝HindIII、P＝PvuI、S＝SacI。図３−pGEMtox PvuIの相同配列と入れ換えるため、BamHI変異を含むDNA断片を用いる。得られる両方のクローニング部位をもつプラスミドを、pGEMtox BamHI/ PvuIとする。発現プラスミドを作成するために、毒素を含むNsiI断片を切り出して、広範な宿主域をもつベクターpTJS260中にクローニングする。B＝BamHI、C＝ ClaI、H＝HindIII、P＝PvuI。図４−新しい制限酵素部位をもつ、NsiI毒素を含む断片を、pMYC1050△BamHI 由来のベクターを含むDNAにライゲーションしてpMYC2244を得る。得られるキメラをpMYC2238と名付ける。B＝BamHI、C＝ClaI、H＝HindIII、N＝NsiI、P＝PvuI 。図５−本発明のキメラ遺伝子をもつプラスミドの制限酵素地図。図６−本発明のキメラ毒素に対する一文字アミノ酸コード(保存配列)と、特異的な残基に対する置換アミノ酸とを示す。配列の簡単な説明配列番号１は、オリゴヌクレオチド・プライマー「A」である。配列番号２は、オリゴヌクレオチド・プライマー「B」である。配列番号３は、オリゴヌクレオチド・プライマー「C」である。配列番号４は、オリゴヌクレオチド・プライマー「D」である。配列番号５は、オリゴヌクレオチド・プライマー「E」である。配列番号６は、オリゴヌクレオチド・プライマー「F」である。配列番号７は、オリゴヌクレオチド・プライマー「G」である。配列番号８は、オリゴヌクレオチド・プライマー「L」である。配列番号９は、オリゴヌクレオチド・プライマー「N」である。配列番号10は、オリゴヌクレオチド・プライマー「O」である。配列番号11は、本発明のキメラ毒素に対するアミノ酸配列を示す。配列番号12は、本発明のキメラ毒素に対する置換アミノ酸配列を示す。配列番号13は、cryI毒素の特徴的な配列である。この配列は、配列番号11の61 6番目の残基で終わる。発明の詳細な開示本発明は、非常に活性が強いバチルス・チューリンギエンシス毒素の発見に関する。これらのキメラ毒素は、全長B.t.毒素の天然のプロ毒素分節の全部または一部を別のプロ毒素分節で置き換えることにより作出される。好ましい態様において、キメラ毒素は、cryIA(b)C末端側のプロ毒素部分およびcryICコアN末端毒素部分を含む。本明細書において用いられるように「コア」毒素部分とは、毒素の殺虫活性に関係するプロ毒素以外の全長B.t.毒素の部分のことをいう。本発明による有用なプラスミドを保有するバチルス・チューリンギエンシスの菌株およびその他の細菌は、以下の通りである。寄託物の利用可能性は、本発明を実施するための実施権の一部を構成し、行政行為によって認可された特許権を減損するものではないと理解されるべきである。図１〜４のフローチャートは、本発明にしたがって実施できるベクター構築の一般的な概観である。スプライス・オーバーラップ伸長反応(SOE)というPCR技術を用いた突然変異誘発によって(Horton，R.M.，H.D．Hunt，S.N．Ho，J.K．Pull en，L.R．Pease［1989］Gene 77:61-68)、BamHIおよびPvuIクローニング部位をc ryIA(c)/cryIA(b)キメラ毒素遺伝子に導入して、pMYC2224を作成した。pMYC394 などのcryICを含むプラスミドから採ったcryIC遺伝子の領域をPCRによって作成して、pMYC2224のcryIA(c)/cryIA(b)遺伝子のBamHI-PvuI断片と置き換えることができる。この方法で作出されたプラスミドpMYC2238は、毒素/プロ毒素分節の接続部位にcryICが続くcryIA(c)の短い分節を含んでいた。プロ毒素分節は、pMY C1050由来のcryIA(b)であった。プラスミドpMYC2238の断片とプラスミドpMYC119 7とプラスミドpMYC394のcryIC部分をライゲーションして、本発明の毒素をコードするキメラ遺伝子を作成した。このキメラ遺伝子は、cryICコアN末端の毒素部分と、天然のcryIC毒素に較べ鱗翅目に対する活性を高めたcryIA(b)C末端のプロ毒素部分を含む、請求の範囲の毒素をコードしている。本発明のキメラ毒素は、B.t.毒素のN末端の全コア毒素部分を含み、この蛋白質は、毒素部分の終点を越えたある部位で、異種のプロ毒素配列に移行する。毒素/プロ毒素接続部位付近で異種のプロ毒素分節への移行が起こるようにしてもよく、または異種プロ毒素への移行をもっと下流で起こすようにして天然のプロ毒素の一部(毒素部分を越えて延びる部位)を維持してもよい。例として、本発明のキメラ毒素の一つは、cryICの全毒素部分(アミノ酸1〜616)、天然のcryICのプロ毒素の一部(アミノ酸617から655)、および異種のプロ毒素の一部(アミノ酸656 からC末端まで)をもつ。好ましい態様において、プロ毒素の異種部分は、cryIA( b)毒素に由来する。当業者は、B.t.毒素の、毒素部分からプロ毒素部分へ移行するまでの長さや正確な位置は、たとえcryICなどの一定のクラス内においても、ある程度は異なっていることを認識するであろう。典型的には、cryIA(b)毒素およびcryIC毒素は、およそ1150アミノ酸から1200アミノ酸の長さである。毒素部分からプロ毒素部分への移行は、典型的には、毒素全長の約50％から60％の間で起こる。本発明のキメラ毒素は、このN末端側のコア毒素部分の全範囲を含む。したがって、キメラ毒素は、全長B.t.毒素の少なくとも約50％を含む。これは、典型的には少なくとも約600アミノ酸である。プロ毒素部分に関しては、cryIA(b)プロ毒素部分の全範囲が、毒素部分の終わりから分子のC末端まで延びている。この部位の終わりの100から150アミノ酸を、本発明のキメラ毒素に含ませることが最も重要である。本明細書において特に例示されたキメラ毒素において、cryIA(b)分子の、少なくともアミノ酸の1085からC末端までが利用されている。したがって、少なくとも、全B.t.蛋白質の末尾の約5％から10％が、本発明のキメラ毒素に含まれる異種DNA(cryIFコアN末端毒素部分と比べて)を含まなければならない。このように、本発明の好ましい態様は、長さ1150アミノ酸から1200アミノ酸のキメラB.t. 毒素において、このキメラ毒素が、全cryIC分子の約50から60％以上で、全分子の約90から95％を超えない、cryICのコアN末端毒素部分を含むものである。キメラ毒素は、さらに、cryIA(b)分子の少なくとも約5％から10％を含むcryIA(b)プロ毒素のC末端部位を含む。したがって、cryIC配列からcryIA(b)配列への移行は、分子全体に対して、約50％と95％の間の、プロ毒素分節の中(または毒素分節とプロ毒素分節の接続部位)で起きる。本明細書において提供された特別な例において、cryIC配列からcryIA(b)配列への移行は、キメラ毒素のアミノ酸1085より前方で起きる。本発明の特別な態様は、配列番号11のキメラ毒素である。本明細書において提供された開示によって利益を受ける当業者が、別の構築物を作成し、使用するかもしれない。cryI蛋白質のコア毒素分節は特徴的な末端の配列、Val/Leu Tyr/Il e Ile Asp Arg/Lys Ile/Phe Glu Ile/Phe Ile/Leu/Val Pro/Leu Ala/Val Glu/Th r/Asp(配列番号13)をもち、配列番号11の616番目の残基で終わる。さらに、cryI 毒素のプロ毒素分節(配列番号11の616残基目以降)は、毒素分節よりも配列類似性が高い。この配列類似性によって、当業者は、cryIC配列とcryIA(b)配列との間でキメラ蛋白質を作るために、プロ毒素分節の移行部位を容易に判定することができる。CryI遺伝子の部分的な蛋白質分解に関するデータを調べると、cryIプロ毒素の保存的配列、図６の1077〜1084位または配列番号12(または配列番号11 の1050〜1057位)の後部に、異種の、保存性が低いアミノ酸領域が見られる。したがって、本発明のキメラ毒素は、全cryIC毒素と、毒素分節(上で定義されている)の終わりとほぼ1084位の間の部位で対応するcryIA(b)配列に移行するcry ICプロ毒素の一部を含んでいてもよい。好ましくは、1085位から1190位に相当するアミノ酸(図６または配列番号12；配列番号11の1058〜1163位)は、cryIA(b)配列、またはそれと同等の配列を含む。 CryIC毒素およびこれらの毒素をコードする遺伝子は、当業者によく知られている。CryIC遺伝子および毒素は、例えば米国特許第5,188,960号(81IB2と命名された遺伝子)、「Honee et al.,（1988）Nucleic Acids Res．16:6240」、および「Sanchis et al.（1988）Mol．Microbiol．2:393」で説明されている。また、さまざまなcryIA(b)毒素が当業者によく知られている。cryIA(b)遺伝子および毒素は、例えば「Hoefte et al.（1986）Eur．J．Biochem．161:273」、「Geiser et al.（1986）Gene 48:109」、および「Haider et al.（1988）Nucleic Acids Res. 16:10927」で説明されている。本明細書に包含される開示示の利益を受ける当業者は、cryIC分子のN末端毒素部分およびcryIA(b)毒素のC末端側プロ毒素部分をコードするDNAを容易に同定し用いることができるであろう。図６は、本発明の毒素において用いられうるアミノ酸置換の例を提供している。毒素の活性を変えることなく、さまざまな突然変異を毒素の配列中に作出することができることも当業者によく知られている。さらに、遺伝子コードの縮退により、一つの毒素をコードするさまざまなDNA配列を用いることもできる。当業者は、本発明にしたがって、このような代替的なDNAおよびアミノ酸配列を用いることができる。本発明のプロ毒素置換技術は、活性が上昇した、または活性の範囲が拡大した活性毒素部分を得るため、他の種類のB.t.内毒素を用いて、全長毒素のプロセシングを促進することができる。この技術は、配列番号13に示された特徴的な配列を有する、他のB.t.毒素に対して最も応用性が高いであろう。本発明は、新規なキメラ毒素およびそれらの毒素をコードする遺伝子を含むだけでなく、これら新規な毒素および遺伝子の利用をも含む。例えば、本発明の遺伝子は、宿主細胞の形質転換に用いることができる。遺伝子を発現し、キメラ毒素を産生するこれらの宿主細胞は、殺虫用組成物に用いることができ、または形質転換された植物細胞の場合には、形質転換細胞それ自体に害虫抵抗性を与えるために用いることが可能である。遺伝子および毒素本発明による有用な遺伝子および毒素には、開示された全長配列だけでなく、本明細書において特に例示された毒素の殺虫活性特性を保持しているこれらの配列の断片、異型、および変異体も含まれる。本明細書において用いられるように、遺伝子の「異型」または「変異」という語は、同じ毒素をコードするヌクレオチド配列、または同等の殺虫活性をもつ毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において用いられるように「等価的毒素」という語は、標的害虫に対して、請求の範囲の毒素と同じか、または本質的に同じ生物学的活性をもつ毒素を意味する。いくつかの方法を用いて、活性毒素をコードする遺伝子を同定し得ることができることは、当業者に明らかであろう。本発明による有用なcryICおよびcryIA(b )特異的遺伝子(または毒素またはプロ毒素ドメインをコードするその一部)は、上記の培養細胞寄託機関に寄託されている組み換え単離物から得てもよい。また、これらの遺伝子、またはその一部もしくは変異体を、例えば遺伝子合成機を用いて合成して作成することもできる。遺伝子の変異体は、点突然変異を作出する標準的な技術を用いて、容易に構築することができる。また、標準的な手順にしたがって、市販のエクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて、これらの遺伝子の断片を作成することもできる。例えば、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを規則正しく切り出すBal31のような酵素を用いることができる。または、部位特異的突然変異誘発を用いることができる。また、さまざまな制限酵素を用いて、活性断片をコードする遺伝子を得ることもできる。これらの毒素の活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いてもよい。例示された毒素の殺虫活性を保持している断片および等価物も、本発明の範囲内にある。また、上でも述べたように、遺伝子コードの縮重のため、さまざまな異なるDNA配列が、本明細書に開示されたアミノ酸配列をコードすることができる。同じ毒素、または本質的に同じ毒素をコードする代替DNA配列を作成することは、当業者の技術の範囲内に当然含まれる。これらの変異DNA配列は、本発明の範囲内にある。本明細書において用いられるように「本質的に同じ」配列という語は、アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を有する、殺虫活性に実質的に影響しない配列を意味する。殺虫活性を保持している断片もまた、この定義に含まれる。本発明による有用な毒素および遺伝子をさらに同定するための、さらに別の方法は、オリゴヌクレオチド・プローブを用いることによる。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適当な標識によって検出可能にすることができ、また、国際出願WO93/16094号で開示されているように、最初から蛍光を発するようにしてもよい。当業者にはよく知られているように、プローブ分子および核酸試料が、二分子間で強い結合を形成することによりハイブリダイズすれば、プローブおよび試料は実質的に相同であるということが合理的に推定できる。好ましくは、例えば「Keller，G.H.，M.M．Manak（1987）DN A Probes，Stockton Press，New York，NY.,pp.169-170」で述べられているような、当技術分野において公知の技術によって、厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行なう。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起きたか否かを既知の条件で判定するための方法を提供する。このようなプローブ解析は、本発明による有用な、毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。好ましくは、このような遺伝子は、本発明によるキメラ遺伝子を作出するために、そのコア毒素をコードするN末端部位が、cryIA(b)プロ毒素をコードするC 末端側部位とともに用いられるcryIC遺伝子であろう。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチド分節は、DNA合成機を用いて、標準的な手順で合成することができる。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして用いることもできる。本発明の一定のキメラ毒素が、本明細書において特に例示されてきた。本発明が、例示されている毒素と同じか、または類似した殺虫活性をもつ変異体毒素または等価的毒素(および等価的毒素をコードするヌクレオチド配列)を含むことは、いうまでもなく明らかであろう。等価的毒素には、例示されている毒素に対するアミノ酸相同性があるであろう。このアミノ酸相同性は、典型的には75％を超え、好ましくは90％を超え、最も好ましくは95％を超える。生物学的活性の原因となるか、または最終的に生物学的活性に関係する三次元構造の決定に関与する、重要な毒素領域で、アミノ酸の相同性が最も高い。この点に関して、活性に対して重要ではない領域にあるか、分子の三次元構造に影響しないような保存的アミノ酸の置換である場合には、そのようなアミノ酸置換は受容され、期待される。例えば、アミノ酸は、次のように分類できよう。すなわち、非極性、非荷電性、塩基性、および酸性。同じ分類の中の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、置換によって化合物の生物学的活性が実質的に変化しない限り、本発明の範囲に含まれる。表１に、それぞれの分類に属するアミノ酸の例を列挙する。場合によっては、非保存的な置換が行われることもある。重要な要素は、これらの置換によって、毒素の生物学的活性が有意に損なわれてはならないということである。組み換え宿主本発明のキメラ毒素をコードする遺伝子は、広い範囲の微生物または植物の宿主に導入することができる。毒素遺伝子を発現させると、殺虫性のキメラ毒素が、直接的または間接的に細胞内に産生され、維持される。例えば、シュードモナス菌などの適当な微生物宿主を用いて、該微生物を害虫のいる場所に適用し、そこで増殖させ、摂取させることができる。その結果、害虫を抑制できる。または、毒素遺伝子を宿している微生物を、毒素活性を持続させながら、細胞を安定させる条件の下で処理することができる。処理された細胞は、毒素活性を保持しており、それから標的害虫の環境へと適用することができる。キメラ毒素をコードする遺伝子を適当なベクターによって微生物宿主に導入し、該宿主を生きたままの状態で環境中に適用する際には、一定の宿主微生物を用いることが重要である。一つまたは複数の目的の作物の「植物圏(phytosphere) 」(葉面、葉圏、根圏および/または根面)に居住することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境(作物および他の昆虫の生育場所)の中で、野生型の微生物とうまく競合でき、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定した維持と発現を提供し、そして好ましくは、周囲の環境の作用による分解および不活化から殺虫剤をよりよく保護できるように選択される。多数の微生物が、さまざまな重要作物の葉表面(植物の葉の表面)および/または根圏(植物の根の回りの土)に生息していることが知られている。これらの微生物には、細菌、藻類、および菌類が含まれる。特に興味深い微生物は、例えば、細菌では、シュードモナス（Pseudomomas）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、キサントモナス（Xant homonas）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、メチロフィリウス（Methylop hilius）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アグロバクター（Agrob acter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、アースロバクター（Arthroba cter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、ロイコノストック（Leuconostoc ）属、およびアルカリジェネス（Alcaligenes）属、また菌類では、特に酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus ）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、スポロボロミセス（Sporobolomy ces）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、およびオウレオバシディウム（Aureob asidium）属である。特に興味深い植物居住性細菌の種は、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas Syringae）、シュードモナス・フローレセンス（Pseudomo nas Fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodo pseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas ca mpestris）、リゾビウム・メリオチ（Rhizobium melioti）、アルカリジェネス・エントロファス（Alcaligenes entrophus）、およびアゾトバクター・ビンランディ（Azotobacter vinlandii）であり、植物居住性酵母の種は、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、R.グルチニス（R．glutinis）、R.マリナ（R ．marina）、R.アウランチアカ（R．aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、C.ディフルエンス（C．diffluens）、C.ラウレンティ（C．laurentii）、サッカロミセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、S .プレトリエンシス（S.pretoriensis）、S.セレビシエ（S．cerevisiae）、スポロボロミセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、S.オドラス（S．odorus）、クルイベロミセス・ベロネ（Kluyveromyces veronae）、およびアウレオバシディウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）である。特に重要なのは、色素性細菌である。遺伝子の維持および発現を安定させる条件の下で、キメラ毒素をコードする遺伝子を、微生物の宿主の中に導入するために、さまざまな方法が利用できる。これらの方法は、当業者によく知られており、例えば、米国特許第5,135,867号に開示されており、これは本明細書に参照として包含される。細胞の処理上述したように、毒素活性の持続期間を延ばし、細胞を安定化させるために、本発明のキメラ毒素を産生する組み換え細胞を処理することができる。生成される殺虫剤の微小カプセルは、細胞構造内にB.t.毒素を含む。細胞構造は、安定化され、微小カプセルが標的害虫の環境に適用された際に毒素を保護する。適当な宿主細胞には、原核生物も真核生物も含まれるが、通常、哺乳類などの高等生物に毒性がある物質を産生しない細胞に限定される。しかし、毒性物質が不安定であるか、または適用されるレベルが非常に低いため哺乳類宿主に対して毒性をもつ可能性がないときには、高等生物に毒性がある物質を産生する生物が用いられることもある。宿主として特に重要なのは、原核生物、および菌類などの下等真核生物である。処理を行うとき、場合によっては胞子が用いられることもあるが、通常は胞子状態ではなく、完全な状態の実質的に増殖できる形態にある細胞が用いられる。例えば、本発明のキメラ毒素をコードする遺伝子を含む微生物など、微生物細胞の処理は、毒素の性質を損なうような効果を与えたり、毒素を保護する細胞の能力を失わせたりしない限り、化学的方法、物理的方法、または、化学的および /または物理的方法を組み合わせた方法により行うことができる。化学薬品の例は、ハロゲン化試薬で、特に原子番号17〜80のハロゲンである。より特定すると、ヨウ素を用いて、穏やかな条件の下で十分な時間をかければ、所望の結果を得ることができる。他の適当な技術には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、塩化ゼフィラン、塩化セルピリジニウムなどの抗感染薬、イソプロピルおよびエタノールなどのアルコール類、ルゴールヨウ素、ブワン固定液、さまざまな酸、ヘリー固定液（Helly's fixatives）などの組織固定剤(Humason，Gretchen L. ，動物組織技術(Animal Tissue Techniques)、W.H．Freeman and Company，1967 )、または細胞を宿主の環境に与えたとき、細胞で産生される毒素の活性を保護し活性期間を引き延ばす、物理的(熱による)薬剤と化学的薬剤との組み合わせなどがある。物理的方法の例としては、ガンマ線照射およびX線照射などの短波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥などがある。微生物細胞の処理に関する方法は、米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されており、これらは、本明細書に参照として包含される。細胞は、通常、環境条件に対する抵抗性を増すように、構造的な安定性を強化できる。殺虫剤は前駆体で存在しているため、細胞処理方法は、標的病原害虫によって前駆体をプロセシングして、成熟した殺虫剤の形態になるのを阻害しないようなものを選択すべきである。例えば、ホルムアルデヒドは、蛋白質を架橋させてしまうために、ポリペプチド殺虫剤前駆体のプロセシングを阻害する可能性がある。処理方法は、少なくとも毒素の生物学的利用能または生物活性の実質的な部位を保持するものでなければならない。宿主細胞を作出するという目的で宿主を選択するに当たって、特に重要な特性には、宿主への遺伝子導入の容易さ、発現系の利用可能性、発現効率、宿主中での殺虫剤の安定性、および補助的な遺伝的因子の存在が含まれる。殺虫用微小カプセルとして用いらるための重要な特性には、厚い細胞壁、色素形成、細胞内パッケージングまたは封入体形成などの殺虫剤を保護する特質、水中環境でも生存すること、哺乳類に対する毒性がないこと、害虫が摂食に誘引されること、毒素を損なうことなく殺菌しやすく固定しやすいことなどが含まれる。他の考慮すべき事項には、処方および取り扱いの容易性、経済性、貯蔵安定性などが含まれる。細胞の増殖本発明のキメラ毒素をコードする遺伝子を含む細胞性宿主は、組み換え遺伝子をもつ細胞のすべて、または実質的にすべてを選択できるような選択培地を提供して、DNA構造物が選択において優位性をもつような都合のよい栄養培地中で増殖させてもよい。次に、これらの細胞を従来からの方法に従って回収する。または、回収前に細胞を処理してもよい。処方本明細書に開示されたキメラ毒素をコードする遺伝子を含む組み換え微生物は、餌用の顆粒にして土に撒くことができる。処方した産物は、種子の被覆または根の処理剤として利用することもでき、また、作物の生活史のもっと後の段階で全植物体を処理するときに用いることもできる。植物および土壌処理剤は、無機質(葉珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など)または植物性物質(粉末にしたトウモロコシの穂軸、イネの籾殻、クルミの殻など)などのさまざまな不活性物質と混ぜて、可溶性の粉末、顆粒、または粉剤の形で用いられる。この処方剤には、展着増強剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤、または界面活性剤が含まれていてもよい。液体処方薬は、水性でも非水性でもよく、泡状、ゲル状、懸濁液、乳化濃縮液などの形で用いられる。成分には、流動剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤、またはポリマーが含まれていてもよい。当業者にはよく認識されているように、殺虫効果をもつ濃度は、それぞれの処方の性質によって大きくに異なり、特に、濃縮して用いるか、直接用いるかによって異なる。殺虫剤は、重量にして1％以上であるが、重量にして100％のこともある。乾燥処方剤では、殺虫剤が重量にして約1〜95％あるが、液体処方剤では、一般的に、水相中の固体の重量で1〜60％である。処方剤は、一般的に、約10² から約10⁴細胞数/mgである。これらの処方剤を、１ヘクタール当たり約50mg(液体か乾燥重で)から１kg以上散布する。処方剤は、例えば、土壌および葉などの害虫のいる環境に、噴霧や粉末散布、散水などによって散布することができる。材料および方法電気溶出したDNAの精製には、NACS(ベセスダ研究所（Bethesda Research Labs ）、メリーランド州ゲティスバーグ)カラムクロマトグラフィーを用いた。精製は、結合緩衝液を0.5XTBE/0.2 M NaClに、溶出緩衝液を0.5XTBE/2.0 M NaClに修正した点を除いては、製造業者の指示に従って行なった。 DNAの³²Pによるランダムプライマー標識は、製造業者の指示に従って、キット (ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochem icals）、インディアナ州インディアナポリス)を用いて行なった。ゲル精製とは、選択したDNA断片について、アガロース-TBEゲル電気泳動、電気溶出、およびNACSカラムクロマトグラフィーを連続して行うことを云い、これらの方法は当業者に周知のものである。 DNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅は、パーキン-エルマー社(コネティカット州ノーウォーク)のサーマルサイクラーで、以下のサイクル変数に従って25サイクル行なった。すなわち、94℃で1分間、37℃で2分間、72℃で3分間(72 ℃のサイクルのときは、それぞれ5秒間の伸長時間を設ける)。PCR産物は、クローニング効率を上げるためにプロテアーゼKで処理した(Crowe，J.S.，Cooper，H .J.，Smith，M.A.，Sims，M.J.，Parker，D.，Gewert，D.［1991］Nucl．Acids Res．19:184)。オリゴデオキシリボヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)を、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）(カリフォルニア州フォスター・シティー)のモデル381ADNA合成機で合成した。必要に応じて、製造業者の指示に従ってネンソーブ（Nensorb）カラム(ニューイングランドヌクレア-デュポン社（New E ngland Nuclear-Dupont）、デラウエア州ウィルミントン)で精製を行なった。以下は、本発明を実施するための最良の形態を含む実験方法を例示した実施例である。これらの実施例は、本発明を制限するものではない。別記されない限り、すべてのパーセントは重量比であり、溶液の割合は容量比である。実施例１−スプライスオーバーラップ伸長による発現ベクターの改変クローニングベクターを、RSF1010(pTJS260は、U.C.サンディエゴ校のドナルド・ヘリンスキー博士（Dr．Donald Helinski）から入手可能)由来の、広範な宿主域を有するプラスミドpMYC1050を基本として構築することができる。ベクター構築に用いられる系の例は、EPO特許出願0 471 564の中に見られる。pMYC1050プラスミドDNAは、最初、キメラ毒素遺伝子cryIA(c)/cryIA(b)を持っていた。この遺伝子にコードされている毒素は、米国特許第5,055,294号に開示されている。pMY C1050は、毒素遺伝子およびpM3,130-7(米国特許第5,055,294号に開示されている )を、当技術分野において周知の方法によって、pMYC467(米国特許第5,169,760号で開示されている)などのpTJS260から作ったベクターに再クローニングして構築された。特に、pM3,130-7プロモーターおよび毒素遺伝子をBamHI-NdeI断片として得て、この断片を同じ部位(12100塩基目付近のBamHIと8000塩基目付近のNdeI) に結合した断片と入れ換えて、pMYC467プラスミドの中に入れることができる。改良ベクターは、理想的には1個だけBamHIクローニング部位をもつ。プラスミドのBamHI部位はtacプロモーター(ptac)の上流にあるが、クレノウ酵素で平滑末端化し、ライゲーションし直すことによって除去することができる(図１)。この部位がなくなったことを、制限酵素消化によって確認した。この手順に従って作出したプラスミドをpMYC1050△BamHIと呼ぶ。構築物には、SOE突然変異誘発によって、BamHI部位をプラスミドに付け加える。SOE突然変異誘発は、プラスミド由来の、毒素を含むNsiIで切断したDNA断片を、選抜マーカーとしてbla遺伝子をもつ、より小さなベクターpGEM5（Promega Corp.，Madison，WI）中にサブクローニングすることによって効率的に行うことができる(図１)。断片は制限酵素消化によって方向性を決定することができる。このような処理によって作成されたプラスミドをpGEMtoxと名付けた。毒素をコードする領域のDNAに、PCRを介在させたSOE技術によって、図２に示したような制限酵素クローニング部位を導入するための突然変異を起こさせた。プライマーとして用いられたオリゴヌクレオチドを下に示す。プラスミドpMYC1050のDNAを、プライマーセットA/B、C/D、E/D、およびF/Gを使用するPCR増幅のための鋳型に用いた。増幅したDNA断片をAB、CD、EDおよびFG と名付けた。増幅したDNAは、アガロース-TBEゲル電気泳動、電気溶出、およびN ACSカラムクロマトグラフィーによって精製した。精製した鋳型DNAを、２回目の PCR反応に用いた。断片ABおよびCDを混合し、プライマーAおよびDで増幅した。別の反応において、断片EDとFGを混合して、プライマーEおよびGを用いて増幅した。増幅されたDNAをアガロース-TBEゲル電気泳動によって解析し、対応するようにサイズが増加した断片を切り出し、電気溶出して精製した。増幅されたDNA 断片は、参照のためにADまたはEGと呼ばれる。新しい制限酵素部位をもつDNA断片ADまたはEGを、いくつかのサブクローニング実験によって毒素を含むDNAの中に取り込んだ(図２および３)。pGEMtoxをClaI またはHindIIIで制限酵素消化した。ベクターおよび毒素を含むDNAをゲル精製した。断片ADをClaI消化して、ClaI消化したpGEMtoxベクターDNAとライゲーションした。断片EGをHindIIIで制限酵素消化して、HindIII消化したpGEMtoxベクターD NAにライゲーションした。ライゲーション混合液で大腸菌株NM522を形質転換した。単離されたコロニー由来のプラスミドDNAを制限酵素消化して、正しく構築された構築物を同定した。新しいBamHI部位をもつプラスミドをpGEMtoxBamHIと名付けた。新しいPvuI部位をもつプラスミドをpGEMtoxPvuIと名付けた。プラスミドpGEMtox BamHI由来のBamHI部位をもつClaI断片を、pGEMtox PvuI由来のClaI 部位で切断したベクターを含む断片をフォスファターゼ処理したものとライゲーションした。ライゲーション混合液で大腸菌株NM522を形質転換した。プライマーセットC/D によるPCR解析および制限酵素消化によって、正しく構築された構築物を同定した。新しい制限酵素部位をもつプラスミドをpGEMtox BamHI/PvuIと名付けた。 pGEMtox BamHI/PvuI由来の挿入配列とpMYC1050△BamHI由来のベクターを構築して発現ベクターを完成した(図３および４)。ゲル精製した挿入配列を、(混入したベクターを除去するため)NsiI消化およびScaI消化して、pGEMtox BamHI/Pvu Iから調製した。これを、NsiIで消化したベクターを含むpMYC1050△BamHI DNAをゲル精製したものにライゲーションした。ライゲーション混合液で大腸菌株NM52 2を形質転換し、形質転換混合液を、テトラサイクリンを12μg/mlの濃度で含むL B寒天培地に塗布した。NsiI挿入配列を含むコロニーを、コロニーハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィーによって同定した。NsiIクローニング部位の両側に位置するプライマーセットA/Dを用いて、PCRによって挿入配列の方向を決め、アガロース-TBEゲル電気泳動をした。正しく構築されたプラスミドを pMYC2224と名付けた。ラクトースで誘導できるP.フローレセンス（P.fluorescen s）の菌株に正しく構築されたプラスミドをエレクトロポレーションした。形質転換混合液を、テトラサイクリンを20μg/mlの濃度で含むLB寒天培地に塗布した。次のクローニング実験に用いるために、P.フローレセンス（P.fluorescens）からプラスミドDNAを調製した。実施例２−cryIC超可変領域のpMYC2224へのサブクローニングプライマーCおよびD(それぞれバチルス・チューリンギエンシスDNA(例えば、P S81I)由来の配列番号3および4)か、cryICを含むクローン化されたDNA(例えば、p MYC394)を用いて、cryIC遺伝子の超可変領域を含むDNA断片が得られる。この結果できたPCR断片を制限酵素BamHIおよびPvuIで切断した後、アガロースゲル電気泳動によって精製した。tetAR遺伝子は多数のPvuI部位を含むため、二つの別々の断片から、ベクターを含むDNAを単離する必要がある。第一の断片を得るため、pMYC2224をBamHIおよびBstEIIで消化して、tetARプロモーターの遺伝子座複製機能をもつ大きなDNA断片をゲル精製した。第２の断片を得るために、pMYC2224 をBstEIIおよびPvuIで消化して、ベクター-プロ毒素部分を含むDNA断片をゲル精製した。3つの断片のライゲーションが行われ、大腸菌株NM522が形質転換に用いられた。大腸菌を形質転換した後、制限酵素消化によって、挿入配列が正しく入った大腸菌を回収した。正しいプラスミドをpMYC2238と名付けた。このプラスミドは、アミノ末端がcr yIA(c)、毒素/プロ毒素接続部までがcryIC、プロ毒素部分がcryIA(b)から成る。実施例３−天然のcryICおよびキメラcryIC/cryIA(b)プロ毒素発現プラスミドの構築以下のように、3断片ライゲーションを用いて、cryIC遺伝子をもつ発現プラスミドを作製することができる。(1)pMYC394(NRRL B-18500より)をHindIIIで消化した後、cryIC遺伝子をもつ約4600bpの断片を精製し、(2)SacI(塩基214)からNot I(塩基1674)までを欠失した(EP 0 471 564 A2に開示されている)pTJS260をEcoRI およびHindIIIで消化して、その後プラスミドの複製開始部位を含む約6300bpの断片を精製し、(3)pMYC1197(EP 0 471 564 A2に開示されている)をEcoRIおよびS peIで消化してから、テトラサイクリン抵抗性遺伝子およびptacプロモーターを含む約4200bpの断片を精製する。3つの断片を一緒にライゲーションし、エレクトロポレーションを用いて、ラクトースで誘導できるP.フローレセンス（P.fluo rescens）を形質転換する。この結果できるテトラサイクリン抵抗性のコロニーをスクリーニングして正しい構造をもつプラスミドを選抜する。 cryIC/cryIA(b)キメラ遺伝子をもつ発現プラスミドは、pMYC2238をBgIIおよび IBstEIIで消化し、3200bpの断片を精製して構築される。2番目の断片は、上記の cryIC発現プラスミドを同じ酵素を用いて消化してから、約12000bpの断片を精製して作製することができる。断片を一緒にライゲーションし、エレクトロポレーションを用いて、ラクトースで誘導できるP.フローレセンス（P.fluorescens）に形質導入する。この結果できるテトラサイクリン抵抗性のコロニーを、制限酵素消化およびアガロースゲル解析によって、図５に示す構造をもつプラスミドについてスクリーニングする。米国特許第5,169,760号は、p.フローレセンス（P.fluorescens）が、β-ガラクトシドで誘導できるプロモーターを制御できるようにする方法を開示している。この特許およびEP 0 471 564 A2は、これらの遺伝子がP.フローレセンス（P.f luorescens）で発現する条件を開示している。実施例４−キメラ毒素のスポドプテラ・エキシグア（Spodoptera exigua）に対する活性米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されている方法によって安定化した組み換えシュードモナス・フローレセンス（Pseudomonas fluorescens ）を連続希釈したものを、修正USDA大豆粉末昆虫食餌(技術公報1528、合衆国農務省)に混ぜた。この混合物を、3mlの穴に仕切ったプラスチックの皿(Nutrend C ontainer Corporation，Jacksonville，FL)に入れた。水を、毒素蛋白質を食餌に導入するための賦形剤としてだけでなく、対照としても用いた。第２齢のスポドプテラ・エキシグア（Spodoptera exigua）の幼虫を、一匹ずつ食餌混合物の上に置いた。そして、鋲鉄を用いて、穴をMYLARシート(ClearLam Packaging，IL )で封鎖し、空気を交換できるよう、各穴にピンでいくつかの細孔を開けた。幼虫を連続光の下、25℃または29℃で維持し、それぞれ6日または4日後に死亡率を調べた。標準的なログ-プロビット解析(POLO-PC、LeOra Software，1987)によって、LC₅₀を決定した。cryICおよびcryIC/cryIA(b)キメラを同時に調べた。以下にその代表的な結果を示す。実施例５−キメラ毒素をコードする遺伝子の植物への挿入本発明の一つの面は、殺虫性毒素をコードする遺伝子で植物を形質転換することである。形質転換された植物は、標的害虫による攻撃に対して抵抗性になる。本明細書に開示されているように、当技術分野においてよく知られているさまざまな技術を用いて、キメラ毒素をコードする遺伝子を植物細胞に導入することができる。例えば、高等植物に外来遺伝子を挿入するための調製物として、大腸菌における複製系および形質転換細胞の選抜を可能にするマーカーを含む、多数のクローニングベクターが利用できる。ベクターには、例えば、pBR322、pUC系、 M13mp系、pACYC184などが含まれる。それぞれに応じて、B.t.毒素をコードする配列を、適当な制限酵素部位でベクターに挿入することができる。できたプラスミドを、大腸菌の形質転換に用いる。大腸菌の細胞を適当な栄養培地で培養してから、回収して、溶菌する。プラスミドを回収をする。配列解析、制限酵素解析、電気泳動、その他の生化学-分子生物学的方法が、解析方法として一般的に行われる。各操作の後、用いたDNA配列を切断して、次のDNA配列につなげる。それぞれのプラスミドの配列は、同じプラスミドまたは別のプラスミド中にクローニングすることができる。目的の遺伝子を植物に挿入する方法によっては、別のDN A配列が必要になることもある。もし、例えば、TiまたはRiプラスミドを植物細胞の形質転換に用いるのであれば、TiまたはRiプラスミドT-DNAの少なくとも右側の境界配列、多くの場合左右の境界配列を、挿入される遺伝子に隣接して結合しておかなければならない。植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用が、熱心に研究され、EP 0 120 516 に十分に開示されている。Hoekema（1985）In: バイナリー植物ベクター系(The Binery Plant Vector System)，Offset-durkkerij Kanters B.V.,Alblasserdam ，Chapter5；Fraley et al.，Crit．Rev．Plant Sci．4:1-46; An et al.，(198 5)EMBO J．4:277-287。挿入DNAは一旦ゲノムに取り込まれると、通常、比較的安定に存在し、再び出てくることはない。普通、挿入DNAは、殺生剤または抗生物質、とりわけ、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、またはクロラムフェニコールなどに対する抵抗性を形質転換した植物細胞に付与する選抜マーカーを持っている。よって、それぞれの場合に用いられるマーカーは、挿入DNAを持たない細胞を選抜するのではなく、形質転換細胞を選抜できるものでなければならない。 DNAを植物宿主細胞に挿入するために、多数の技術が利用できる。これらの技術には、形質転換体としてアグロバクテリウム(アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes))を用いるT-DNAによる形質転換、細胞融合、インジェクション、またはエレクトロポレーションが含まれ、その他の方法も可能である。形質転換にアグロバクテリウムを用いるのであれば、挿入されるDNAを特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクター中にクローニングしなければならない。中間ベクターは、T-DNA中の配列に相同な配列によって起こる相同的な組み換えにより、TiまたはRiプラスミドの中に組み込まれることができる。また、TiまたはRiプラスミドには、T-DNAの移行に必要なvir領域が含まれている。中間ベクター自体は、アグロバクテリウムの中で複製することはできない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドという手段(接合)でアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の中に移行して行くことができる。バイナリーベクターは、それ自体、大腸菌でもアグロバクテリウムの中でも複製することができる。バイナリーベクターは、選抜マーカー遺伝子およびT-DNAの左右の境界領域によって区切られるリンカーまたはポリリンカーを含む。バイナリーベクターは、アグロバクテリウムを直接形質転換することができる(Holsters et al.,［1987］Mol．Gen．Genet．163:181-187)。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウムは、vir領域をもつプラスミドを含むはずである。vir領域は、T-DNAが植物細胞に移行するのに必要とされる。付加的なT-DNAが含まれていてもよい。このようにして形質転換された細菌が、植物細胞の形質転換に用いられる。植物細胞にDNAを移行させるために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）とともに培養するには、植物の外植片が都合がよい。そして、選抜のための抗生物質ないし殺生剤を含む適当な培地中で、感染した植物材料(例えば、葉の切片、茎の分節、根、さらにプロトプラストまたは懸濁培養細胞)から全植物体を再生することができる。つぎに、このようにして得られた植物体に挿入DNAが存在することを調べることができる。インジェクションおよびエレクトロポレーションの場合には、プラスミドに特別に必要とされる条件はない。例えば、pUC誘導体などの通常のプラスミドを使用することが可能である。形質転換された細胞は、植物体の中で通常の方法で成長する。それらは、生殖細胞を形成し、後代植物に形質転換した形質を伝達することができる。このような植物を通常の条件で成育させ、同じように形質転換された遺伝的因子をもつ植物または他の遺伝的因子をもつ植物と交配することができる。その結果できる雑種個体はそれぞれに対応する表現形質をもつ。本発明の好ましい態様において、コドン使用が植物にとって最適化されている遺伝子で植物を形質転換する。また、短縮毒素をコードする植物を用いる方が有利である。短縮毒素は、典型的には、全長毒素の約55％から約80％をコードする。植物で用いるための合成遺伝子を作出する方法は、当技術分野において知られている。実施例６−キメラ毒素をコードする遺伝子の昆虫ウイルスへのクローニング多くのウイルスが昆虫に感染することが知られている。これらのウイルスには、例えば、バキュロウイルス（baculoviruses）およびエントモポックスウイルス(entomopoxviruses)が含まれる。本発明の一つの態様において、殺虫性毒素をコードする遺伝子を本明細書に開示されているようにして、昆虫ウイルスのゲノムの中に入れることができ、それによってウイルスの病原性を高めることができる。キメラ毒素遺伝子をもつ昆虫ウイルスを構築する方法については、よく知られており、当業者が容易に実施することができる。これらの実験手順については、例えば、メリーウェザーら(Merryweather，A.T.，U．Weyer，M.P.G．Harris， M.Hirst，T.Booth，R.D．Possee（1990）J．Gen．Virol.71:1535-1544)およびマルテンスら(Martens J.W.M.，G．Honee，D．Zuidema，J.W.M．van Lent，B．Vis ser，J.M．Vlak（1990）Appl．Environmental Microbiol.56(9):2764-2770)により開示されている。本明細書に開示された実施例および態様は、具体例を示すことのみを目的とするものと理解されるべきであり、これらを考慮すれば、当業者はさまざまな修正や変更を思いつくはずであるが、それらも本願の本旨および範囲に含まれ、添付の請求の範囲に含まれるものと理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者シュンフエイチアーネスト. アメリカ合衆国カルフォルニア州サンディエゴハンデルコート 7954 (72)発明者ストックホッフブライアン. アメリカ合衆国カルフォルニア州サンディエゴストーニーピークドライブ 11743

Claims

【特許請求の範囲】１．バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）毒素をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子であって、該バチルス・チューリンギエンシス毒素がcryICのコアN末端毒素部分およびcryIA(b)のC末端プロ毒素部分を含むキメラ毒素である、単離されたDNA分子。２．約1150アミノ酸から約1200アミノ酸のキメラバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）毒素をコードするヌクレオチド配列を含む、請求の範囲１記載の単離されたDNA分子において、該毒素が約600アミノ酸以上かつ約1100アミノ酸以下のcryICのコアN末端側配列を含み、該コアN末端側配列の末端からキメラ毒素のC末端までのアミノ酸配列がcryIA(b)配列である、単離されたDNA分子。３．請求の範囲２記載の単離されたDNA分子において、コア毒素部分がcryIC毒素の最初の約616アミノ酸を含み、プロ毒素部分が配列番号11の約1058位からcry IA(b)毒素のC末端までのアミノ酸を含む、単離されたDNA分子。４．配列番号11に示されているアミノ酸配列から本質的になる毒素をコードする、請求の範囲３記載の単離されたDNA分子。５．図６に示されているアミノ酸配列から本質的になる毒素をコードする、請求の範囲１記載の単離されたDNA分子。６．請求の範囲１記載の単離されたDNA分子において、cryIC配列からcryIA(b) への移行が、配列番号13に示された配列の後方で、かつ配列番号11の1050位から 1057位に相当する配列の前方で起きる、単離されたDNA分子。７．cryICのコアN末端毒素部分およびcryIA(b)のC末端プロ毒素部分を含む、実質的に純粋なキメラバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiens is）毒素。８．約600アミノ酸以上かつ約1100アミノ酸以下のcryICのコアN末端側配列を含み、約1150個から約1200個のアミノ酸を有する、請求の範囲７記載のキメラB. t.毒素において、該コアN末端側配列の末端からキメラ毒素のC末端までのアミノ酸配列がcryIA(b)配列である、キメラB.t.毒素。９．コア毒素部分がcryIC毒素の最初の約616アミノ酸を含み、プロ毒素部分が配列番号11の約1058位からcryIA(b)毒素のC末端までのアミノ酸を含む、請求の範囲８記載の毒素。 10．図６に示されているアミノ酸配列から本質的になる、請求の範囲７記載のキメラB.t.毒素 11．cryIC配列からcryIA(b)への移行が、配列番号13に示された配列の後方でかつ配列番号11の1050位から1057位に相当する配列の前方で起きる、請求の範囲７記載のキメラB.t.毒素。 12．配列番号11に示されているアミノ酸配列から本質的になる、請求の範囲７記載の毒素。 13．請求の範囲１記載のDNA分子を含む組み換えDNA輸送ベクター。 14．請求の範囲７記載の毒素を発現するように形質転換された組み換え宿主。 15．標的昆虫がいる環境に適用された際に殺虫活性期間が長くなるような条件の下で処理されている、細胞内毒素を含む実質的に完全な細胞であって、該毒素が鱗翅目害虫に対して活性を有する毒素をコードするバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）遺伝子の発現産物であり、該毒素が請求の範囲１記載のDNA分子によってコードされるものである、処理された実質的に完全な細胞。 16．環境における殺虫活性期間を長くするための化学的方法または物理的方法によって処理されている、請求の範囲15記載の細胞。 17．鱗翅目害虫を抑制するのに有効な量の請求の範囲７記載の毒素に該害虫を接触させることを含む、鱗翅目害虫を抑制する方法。