JP3979447B2 - バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ内毒素のＣｒｙＩＦキメラおよびＣｒｙＩＡ（ｃ）キメラを含む殺虫薬組成物 - Google Patents
バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ内毒素のＣｒｙＩＦキメラおよびＣｒｙＩＡ（ｃ）キメラを含む殺虫薬組成物 Download PDFInfo
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Description
発明の背景
土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.）は、グラム陽性で、胞子を形成する細菌であり、パラ胞子的（parasporal）な結晶性蛋白質の封入体を特徴とする。これらの封入体は、しばしば、特殊な形状の結晶として顕微鏡で見ることができる。この蛋白質は、病原生物に対して非常に毒性が強く、特異的な毒素活性を示すことがある。ある種のB.t.毒素遺伝子が単離され、配列が決定されており、組み換えDNAによるB.t.産物が製造され、使用が認められている。さらに、遺伝子工学技術を用いてこれらのB.t.内毒素を農業環境に取り入れさせるために、害虫抵抗性に関する内毒素遺伝子を用いて遺伝子工学的に改良した植物を用いたり、安定化した微生物細胞そのものをB.t.内毒素の運搬体として用いることを含む、新しい方法が開発中である（Gaetner, F.H., L. Kim［1988］TIBTECH 6:S4-S7）。このように、単離されたB.t.内毒素が、商業上の価値を持ちつつある。
10年前まで、B.t.農薬の商業的な利用は、鱗翅目（毛虫）の害虫に対してだけという、狭い範囲に大きく制限されていた。バチルス・チューリンギエンシス・クルスタキ亜種（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）から調製された胞子および結晶が、長い間、鱗翅目（毛虫）用の殺虫剤として商業的に用いられてきた。例えば、B.チューリンギエンシス・クルスタキHD-1変種（B.thuringiensis var.kurstaki HD-1）は、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を示すδ-内毒素と呼ばれる結晶を産生する。
しかし、近年になって、研究者たちは、ずっと広い範囲の害虫に特異性をもつB.t.農薬を発見した。例えば、別のB.t.種、すなわち、イスラエレンシス（israelensis）およびテネブリオニス（tenebrionis）（B.t.M-7、B.t.san diegoとしても知られている）が、それぞれ、双翅目とコルコプテラ（Colcoptera）目の昆虫を抑制するために商業的に用いられている（Gaetner,F.H.,（1989）、作物防御剤の制御的輸送「殺虫蛋白質の細胞内運搬系：生存微生物と非生存微生物」（Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins:Living and Non-Living Microorganisms,in Controlled Delivery of Crop Protection Agents）、R.M.Wilkins,ed.,Taylor and Francis,New York and London,1990,pp.245-255）。また、「Couch,T.L.（1980）、バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変種の蚊に対する病原性（Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var.israelensis）、Developments in Industrial Microbiology 22:61-76」、「Beegle, C.C.（1978）、農業環境系における昆虫に発生する細菌の利用（Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems）、Developments in Industrial Microbiology 20:97-104」も参照のこと。「Krieg,A.,A.M.Huger,G.A.Langenbruch,W.Schnetter（1983）Z.ang.Ent.96:500-508」は、バチルス・チューリンギエンシス・テネブリオニス変種（Bacillus thuringiensis var.tenebrionis）について述べ、これが鞘翅目の２種の甲虫に対して活性があることを報告している。それらは、コロラド・ジャガイモ甲虫のレプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）およびアゲラスチカ・アルニ（Agelastica alni）である。
最近、新しいB.t.の亜種が同定され、活性δ内毒素に関連する蛋白質をコードする遺伝子が単離された（Hofte,H.,H.R.Whiteley（1989）Microbiological Reviews 52（2）:242-255）。ヘフテ（Hofte）およびウィトリー（Whiteley）は、B.t.結晶蛋白質遺伝子を４種類に大別した。これらは、CryI（鱗翅目特異的）、CryII（鱗翅目および双翅目特異的）、CryIII（鞘翅目特異的）、およびCryIV（双翅目）である。他の害虫に特異的に有毒な菌株が発見されたことも報告されている（Feitelson,J.S.,J.Payne,L.Kim（1992）Bio/Technology 10:271-275）。
B.t.結晶蛋白質遺伝子の大腸菌におけるクローニングおよび発現が、発表文献に開示されている（Schnepf,H.E.,H.R.Whiteley（1981）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2893-2897）。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号はいずれも、B.t.結晶蛋白質の大腸菌における発現を開示している。毒性を強化し、標的害虫に対する宿主範囲の拡大を示すハイブリッドB.t.結晶蛋白質遺伝子が構築されている。米国特許第5,128,130号および第5,055,294号を参照のこと。米国特許第4,797,276号および第4,853,331号は、さまざまな環境で鞘翅目を抑制するために用いることができるB.チューリンギエンシス（B. thuringiensis）サンディエゴ（san diego）株（M-7、B.t.tenebrionisとしても知られている）を開示している。米国特許第4,918,006号は、双翅目に対する活性をもつB.t.毒素を開示している。米国特許第4,849,217号は、アルファルファ・ゾウムシ（alfalfa weevil）に対して活性をもつB.t.単離物を開示している。米国特許第5,151,363号および米国特許第4,948,734号は、線虫に対する活性をもつB.t.単離物を開示している。
多くの研究と資源の投入の結果、新しいB.t.単離物およびB.t.単離物の新しい利用に関する他の特許が発行されている。しかし、新しいB.t.単離物の発見および既知のB.t.単離物の新しい利用は、依然として経験に依存する予測不可能な技術である。
バチルス・チューリンギエンシスのδ-内毒素結晶蛋白質分子の大半は、二つの機能部分からなる。プロテアーゼ抵抗性コア毒素が第一の部分で、蛋白質分子の前方の約半分に相当する。cryIIIA B.t.δ-内毒素のコア部分の三次元構造が明らかにされており、すべての関連毒素が同じ全体構造をもつと云われている（Li,J.,J.Carroll,D.J.Ellar（1991）Nature 353:815-821）。この分子の後ろの半分が第二の部分である。本願のため、本明細書において、この第二の部分を「プロ毒素分節」と呼ぶことにする。プロ毒素分節は、毒素の結晶形成に関与すると考えられている（Arvidson,H.,P.E.Dunn,S.Strand,A.I.Aronson（1989）Molecular Microbio logy 3:1533-1534;Choma,C.T.,W.K.Surewicz,P.R.Carey,M.Pozsgay,T.Raynor,H.Kaplan（1990）Eur.J.Biochem.189:523-527）。全長130 kDの毒素分子は、昆虫の腸の中でプロテアーゼにより速やかに処理されて、抵抗性コア分節になる。このように、プロ毒素分節は、毒素分子をプロセシングするプロテアーゼを減少させ、コア部分が昆虫に接近しにくくすることによって（Hainder,M.Z.,B.H.Knowles,D.J.Ellar（1986）Eur.J.Biochem.156:531-540）、または毒素の可溶性を低下させることによって（Aronson,A.I.,E.S.Han,W.McGaughey,D.Johnson（1991）Appl.Environ.Microbiol.57:981-986）、毒素に対する昆虫の特異性を部分的に担っていると考えられる。
毒素ドメインで結合したキメラ蛋白質が、CryICとCryIA（b）の間で報告されている（Honee,G.,D.Convents,J.Van Rie,S.Jansens,M.Perferoen,B.visser（1991）Mol.Microbiol.5:2799-2806）が、これらのキメラ蛋白質の活性は、適当な昆虫に対するCryICと較べると、非常に低いか、検出できないほどである。
ハニーら（Honee,G.,W.Vriezen,B.visser（1990）Appl.Environ.Microbiol.56:823-825）はまた、CryICおよびCryIA（b）の毒素ドメインを直列に連結することによるキメラ融合蛋白質の作出を報告した。その結果できた蛋白質は、各毒素の活性を組み合わせた活性に相当する、広い活性スペクトルを示した。しかし、そのキメラの活性は、標的昆虫のいずれに対しても増加しなかった。
毒素または生物学的活性剤を混合すると、それによってできる混和剤の生物学的活性に、いくつかの面で影響が表れることがある。できた混和剤の生物学的活性は、各毒素の活性の総和であると考えられる。混和剤の生物学的活性は、各薬物の活性の総和より少ない、または各薬物の活性の総和よりも大きいと考えられる。
特定のB.t.系統によって産生されるβ外毒素のヌクレオチドが、鱗翅目の害虫であるスポドプテラ・エキシグア（Spodoptera exigua）に対する活性を上昇させるよう、B.t.変種クルスタキ（kurstaki）のδ内毒素蛋白質と協働作用することが分かった（Moar,W.J.,W.L.A.Osbrink,J.T.Trumble（1986）J.Econ.Entomol.79:1443〜1446）。B.t.変種イスラエレンシス（islaelensis）に由来する27 kDaと65または130 kDaの蛋白質とを混合させると、蚊の幼虫に対する毒性を強化することができる（Chilcott,C.N.,D.J.Ellar（1988）J.Gen.Microbiology 132:2551〜2558;Yu et al.,1987;Wu D.,F.N.Chang（1985）FEBS 190（2）:232〜236）。B.t.変種イスラエレンシス由来のCryIVAおよびCryIVB毒素もともに用いられてきた（Angsuthanasomat,C.,N.Crickmore,D.J.Ellar（1992）FEMS Microbiol.Lett.94:63〜68）。
発明の簡単な概要
本発明は、２つのバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus Thuringiensis）（B.t.）のδ内毒素蛋白質を組み合わせることにより、鱗翅目害虫に対する効果的で強化された作用の発見に関する。より特定すると、CryIFキメラ毒素は、CryIA（c）キメラ毒素と組み合わせると、鱗翅目害虫に対して予想以上に強い毒性を示すように、協働作用することである。
本発明に係る協働作用的効果は、毒素蛋白質の一つを産生する菌株を混合物として組み合わせることにより達成される。本発明に係る２つの毒素を発現するように操作した組み換え宿主も協働作用的効果を呈するために用いることができる。適当な組み換え宿主には、原核生物及び下等真核生物並びに植物が含まれる。
本発明で有用なキメラCryIF遺伝子を、天然のcryIFプロ毒素部分の全部または一部を異種生物のプロ毒素部分で置き換えて構築することもできる。特に、天然のcryIF毒素のプロ毒素をコードする領域の全部または一部を、CryIA（b）遺伝子のプロ毒素コーディング領域の全部または一部で置き換えて用いることができる。同様に、cryIF毒素のプロ毒素をコードする領域の全部または一部を、cryIA（c）/cryIA（b）キメラ遺伝子のプロ毒素の全部または一部をコードするDNAで置き換えたキメラ遺伝子を構築することができる。特異的な態様において、cryIA（c）/cryIA（b）キメラ遺伝子とは、436と表示されているもので、米国特許第5,128,130号に記載されているものである。この遺伝子は、P.フルオレセンス（P. fluorescens）MR436のプラスミドから得られる。
広範な微生物または植物を宿主として、キメラ遺伝子を導入することができる。キメラ遺伝子を発現するように形質転換した宿主は、本発明に係る、鱗翅目に活性な毒素を産生させるために用いることができる。形質転換された宿主は、殺虫性毒素を産生するために用いることができるが、毒素を産生させるために植物細胞を形質転換した場合には、植物体が昆虫の攻撃に対して耐性になるはずである。本発明は、さらに、キメラ毒素またはキメラ毒素をコードする遺伝子を含む宿主を、鱗翅目害虫を制御する方法において利用することに関する。さらにまた、本発明には、実質的に無処理のB.t.細胞を組み合わせたもの、または遺伝子を発現して、本発明の毒素を産生する組み換え細胞が含まれる。標的害虫がいる環境に、実質的には無処理の細胞を施用するときには、殺虫剤活性が持続するよう、細胞を処理することができる。このような処理には、化学的手段もしくは物理的手段によるもの、または化学的手段と物理的手段とを組み合わせたものとがありうるが、この技術は、殺虫剤の協働作用特性に有害な影響を及ぼしたり、殺虫成分を保護する細胞の能力を低下させたりしないものであることが必要である。処理細胞は、殺虫性毒素を保護する被膜として機能する。この毒素は、標的害虫が摂食したときに、毒素として働くように利用できるようになる。
【図面の簡単な説明】
図１−pMYC1050からBamHI部位を除去して、クレノウポリメラーゼで平滑化し、プラスミドpMYC1050△BamHIを作成する。クローニングを効率的に行うため、毒素のオープンリーディングフレームの大部分を含むNsiI DNA断片をpGEM5中にクローニングする。得られるプラスミドをpGEMtoxと名付ける。C＝ClaI、H＝HindIII。
図２−スプライス・オーバーラップ伸長反応（SOE）技術によって、毒素DNAにBamHIおよびPvuIクローニング部位を導入した。新しい部位をもつDNA断片をpGEMtoxの相同なDNA断片に置き換えるために用いる。得られるプラスミドは、pGEMtox BamHIまたはpGEMtox PvuIである。矢印の下のAからGの文字は、本文中のオリゴヌクレオチドプライマーに相当する。縦線の上の文字は、制限酵素部位に相当する。B＝BamHI、C＝ClaI、H＝HindIII、P＝PvuI、S＝SacI。
図３−pGEMtox PvuIの相同配列と入れ換えるため、BamHI変異を含むDNA断片を用いる。得られる両方のクローニング部位をもつプラスミドを、pGEMtox BamHI/PvuIとする。発現プラスミドを作成するために、毒素を含むNsiI断片を切り出して、広範な宿主域をもつベクターpTJS260中にクローニングする。B＝BamHI、C＝ClaI、H＝HindIII、P＝PvuI。
図４−新しい制限酵素部位をもつ、NsiI毒素を含む断片を、pMYC1050△BamHI由来のベクターを含むDNAにライゲーションしてpMYC2244を得る。cryIF毒素を含むBamHI-PvuI PCR由来のDNA断片をpMYC2244の同等の断片と置換する。得られるキメラをpMYC2239と名付ける。B＝BamHI、C＝ClaI、H＝HindIII、N＝NsiI、P＝PvuI。
図５−プラスミドpMYC2244を作成するために、pMYC2047のApaI DNAの小断片で、pMYC2239の相同領域を置換する。このキメラには毒素領域のcryIFと、プロ毒素領域のcryIA（b）とが含まれる。C=ClaI、H=HindIII、N=NsiI、P=PvuI。
図６−SOEによって、サイレントなコドン置換をcryIF毒素に導入する。置換させた、SpeI-KpnI PCR DNA断片で、pMYC2047の相同な毒素を含む断片を置き換える。その結果得られるプラスミドはpMYC2243である。矢印の下のHからKまでの文字は、本文中のオリゴヌクレオチドプライマーに相当する。
図７−pMYC2243のApaI DNAの小断片で相同な断片を置換して、pMYC2244にサイレントなコドン置換を導入する。最終的にできるプラスミドはpMYC2523である。P=PvuI。
図８−PCRで作成したPvuI-BstEIIプロ毒素DNAで、pMYC2523の相同領域を置き換えて、436プロ毒素を含むキメラ毒素を構築する。最終的にできるプラスミドはpMYC2254である。矢印の下のF及びMの文字は、本文中のオリゴヌクレオチドプライマーに相当する。
図９−cryIF/cryIA（b）キメラ蛋白質の配列と残基毎の置換を示す。「Cons」行は、cryIF/cryIA（b）のキメラ配列を示している。「Alt」行は、436蛋白質、cryIA（b）変異蛋白質およびCryIFプロ毒素に見られる置換を残基毎に示している。
配列の簡単な説明
配列番号：１は、オリゴヌクレオチド・プライマー「A」である。
配列番号：２は、オリゴヌクレオチド・プライマー「B」である。
配列番号：３は、オリゴヌクレオチド・プライマー「C」である。
配列番号：４は、オリゴヌクレオチド・プライマー「D」である。
配列番号：５は、オリゴヌクレオチド・プライマー「E」である。
配列番号：６は、オリゴヌクレオチド・プライマー「F」である。
配列番号：７は、オリゴヌクレオチド・プライマー「G」である。
配列番号：８は、オリゴヌクレオチド・プライマー「L」である。
配列番号：９は、オリゴヌクレオチド・プライマー「N」である。
配列番号：１０は、オリゴヌクレオチド・プライマー「O」である。
配列番号：１１は、オリゴヌクレオチド・プライマー「H」である。
配列番号：１２は、オリゴヌクレオチド・プライマー「I」である。
配列番号：１３は、オリゴヌクレオチド・プライマー「J」である。
配列番号：１４は、オリゴヌクレオチド・プライマー「K」である。
配列番号：１５は、オリゴヌクレオチド・プライマー「P」である。
配列番号：１６は、オリゴヌクレオチド・プライマー「Q」である。
配列番号：１７は、オリゴヌクレオチド・プライマー「M」である。
配列番号：１８は、pMYC2224において毒素をコードするDNA配列を示す。
配列番号：１９は、pMYC2224によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２０は、pMYC2239において毒素をコードするDNA配列を示す。
配列番号：２１は、pMYC2239によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２２は、pMYC2244において毒素をコードするDNA配列を示すが、これはcryIF/cryIA（b）キメラ毒素をコードしている。
配列番号：２３は、pMYC2244によってコードされるcryIF/cryIA（b）キメラ毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２４は、pMYC2243において毒素をコードするDNA配列を示す。
配列番号：２５は、pMYC2243によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２６は、pMYC2523において毒素をコードするDNA配列を示すが、これはコドンを再加工したcryIF/cryIA（b）キメラ毒素をコードしている。
配列番号：２７は、pMYC2523によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２８は、pMYC2254において毒素をコードするDNA配列を示すが、これはcryIF/436キメラ毒素をコードしている。
配列番号：２９は、pMYC2254によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：３０は、cryI毒素に特徴的な配列である。この配列は、配列番号：23の601残基目で終わっている。
配列番号：３１は、配列番号：２３におけるアミノ酸1043の前の８個のアミノ酸である。
配列番号：３２は、天然のcryIF/cryIA（b）毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３３は、天然のcryIA（b）毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３４は、cryIA（c）/cryIA（b）毒素のアミノ酸配列を示す。
発明の詳細な開示
本発明は、CryIFキメラ毒素とCryIA（c）キメラ毒素とを組み合わせることによってもたらされる予想外に増強した殺虫活性に関する。この組み合わせは、鱗翅目害虫に対する活性を驚くほど上昇させた。この２つのキメラ毒素を産生する菌株を組み合わせた調製物を、本発明を実施するために用いることができる。B.t.遺伝子で形質転換したシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluoresence）の細胞を、本発明の毒素の供給源の一つとして用いることができる。例えば、CryIF/CryIA（b）毒素をコードする遺伝子を含む、ラクトースで誘導できるシュードモナス・フルオレセンス（P.fluoresence）系統と、CryIA（c）/CryIA（b）キメラ毒素をコードする遺伝子を含むシュードモナス・フルオレセンス（P.fluoresence）MR436とを、本発明を実施するために用いることができる。これら２つのシュードモナス菌株は、殺虫活性の効果的な強化を示すよう、物理的に混合して組み合わせることができる。単一の宿主が有利な効果をもたらす２つの毒素を産生するよう、適当な宿主を形質転換するために、本発明に係る毒素をコードしている遺伝子を用いることができる。
本発明により有用となるプラスミドを有するバクテリアは以下の通りである。
寄託菌が入手可能であることは、行政行為にって付与された特許権を制限して、本発明を実施するための許可を構成する要件ではないと理解されるべきである。
本発明による、２つのキメラ毒素を含む製剤は、製剤を施用するに当たって、必要な全蛋白質含量が少量であるため、これを使用する者にとっては非常に経済的である。単独の毒素に対しては弱い感受性しか示さない昆虫ほど、本発明の毒素を組み合わせることによって一層強い影響を受け、２つの毒素を含む製剤の効き目は、一つの毒素しか含まない製剤の効き目より強くなる。さらに、害虫は、２つの毒素を含む製剤に対しては単独の毒素を含む製剤に対してよりも、すぐに耐性を生ずる可能性が低い。
本発明で説明する毒素の組み合わせは、鱗翅目害虫を制御するために用いることができる。成虫の鱗翅目類、すなわち、チョウ及びガは、主に花蜜を餌とし、授粉の重要な媒介者である。その幼虫、すなわち、イモムシはほとんどが植物体を餌にし、その多くが深刻な害虫である。イモムシは、茎葉の上または内部、植物の根または茎の上を食害し、植物から栄養を奪い、しばしば植物の物理的支持構造を破壊する。さらに、イモムシは、果実、組織、ならびに貯蔵した穀粒及び穀粉を食害し、これらの販売用産物を害したり、それらの価値を大いに低下させる。本明細書で用いられるとき、鱗翅目害虫というのは、幼虫の段階を含むこの害虫のさまざまな発育段階を指す。
本発明のキメラ毒素は、B.t.毒素のN末端の全コア毒素部分を含み、この蛋白質は、毒素部分の終点を越えたある部位で、異種のプロ毒素配列に移行する。本明細書において、B.t.毒素のN末毒素部分は「コア」毒素という。毒素/プロ毒素接続部位付近で異種のプロ毒素分節への移行が起こるようにしてもよく、または異種プロ毒素への移行をもっと下流で起こすようにして天然のプロ毒素の一部（毒素部分を越えて延びる部位）を維持してもよい。例として、本発明のキメラ毒素の一つは、cryIFの全毒素部分（アミノ酸1〜601）、および異種のプロ毒素（アミノ酸602からC末端まで）をもつ。好ましい態様において、プロ毒素の異種部分は、cryIA（b）または436毒素に由来する。
当業者は、B.t.毒素の、毒素部分からプロ毒素部分へ移行するまでの長さや正確な位置は、たとえcryIFなどの一定のクラス内においても、ある程度は異なっていることを認識するであろう。典型的には、cryIA（b）毒素およびcryIF毒素は、およそ1150アミノ酸から1200アミノ酸の長さである。毒素部分からプロ毒素部分への移行は、典型的には、毒素全長の約50％から60％の間で起こる。本発明のキメラ毒素は、このN末端側のコア毒素部分の全範囲を含む。したがって、キメラ毒素は、全長cryIF B.t.毒素の少なくとも約50％を含む。これは、典型的には少なくとも約590アミノ酸である。プロ毒素部分に関しては、cryIA（b）プロ毒素部分の全範囲が、毒素部分の終わりから分子のC末端まで延びている。この部位の終わりの約100から150アミノ酸を、本発明のキメラ毒素に含ませることが最も重要である。本明細書において特に例示されたキメラ毒素において、cryIA（b）分子の、少なくともアミノ酸の1043（配列番号23）からC末端までが利用されている。配列番号：23のアミノ酸1043の前には、配列Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys（配列番号：31）がある。このアミノ酸配列は、キメラ毒素において、その配列の先に異種生物に由来するアミノ酸が必ず続いている分子の、プロ毒素部分の位置を示す指標となる。別の実施例では、配列番号：31として示されているペプチドが、アミノ酸1061から1068にある。この場合、1069からC末までのアミノ酸は、好ましくは異種性のものである（配列番号：29）。配列番号：31に示されているペプチドが、図９の1061から1068の位置に見ることができる。したがって、本発明に係るキメラ毒素において、異種生物由来のDNAを含むのは（cryIF毒素のコアN末部分に比較すると）、B.t.蛋白質全体の、少なくとも最後の、およそ５から10％である。本明細書に含まれる特異的な実施例においては、640番目のアミノ酸からC末端までが異種性のプロ毒素配列である。
このように、本発明の好ましい態様は、長さ約1150から約1200アミノ酸のキメラB.t.毒素であって、cryIF分子全長の少なくとも約50％から60％のcryIFコア毒素のN末部分を含むが、この分子全長の約90％から95％以上は含まないキメラ毒素である。キメラ毒素は、さらに、cryIA（b）または436分子の少なくとも約5％から10％を含む、cryIA（b）または436プロ毒素のC末端部分を含む。したがって、cryIFからcryIA（b）または436配列への移行は、分子全体の約50％から約95％の間のプロ毒素部分で起こる（または、毒素とプロ毒素の結合部分で起きる）。本明細書で提供される特異的な実施例において、cryIF配列から異種生物由来のプロ毒素配列への移行は、配列番号：31に示されているペプチド配列の末端の手前で起こる。
本発明の特別な態様は、図9のキメラ毒素である。本明細書において提供された開示によって利益を受ける当業者が、別の構築物を作成し、使用すると考えられる。cryI蛋白質のコア毒素分節は特徴的な末端の配列、Val/Leu Tyr/Ile Ile Asp Arg/Lys Ile/Phe Glu Ile/Phe/Leu Ile/Leu/Val Pro/Leu Ala/Val Glu/Thr/Asp（配列番号30）をもち、配列番号23の601番目の残基で終わる。さらに、cryI毒素のプロ毒素分節（601残基目以降）は、毒素分節よりも配列類似性が高い。この配列類似性によって、当業者は、cryIF配列とcryIA（b）または436配列との間でキメラ蛋白質を作るために、プロ毒素分節の移行部位を容易に判定することができる。CryI遺伝子の部分的な蛋白質分解に関するデータを調べると、cryIプロ毒素の保存的配列、図9の1061〜1068位の後部に、異種の、保存性が低いアミノ酸領域が見られる。
したがって、本発明のキメラ毒素は、全cryIF毒素と、毒素分節（上記で定義されている）の終わりと配列番号31のペプチド配列末端部との間のいかなる部位に、対応するcryIA（b）または436配列に移行するcryIFプロ毒素の一部を含んでいてもよい。好ましくは、キメラ毒素のC末アミノ酸配列は、cryIA（b）配列、または436遺伝子由来の配列、またはこれらの配列の１つと同等な配列を含む。
CryIF毒素およびこれらの毒素をコードする遺伝子は、当業者によく知られている。CryIF遺伝子および毒素は、例えば「Chambers et al.,（1991）J.Bacteriol.173:3966」で説明されている。cryIA（b）遺伝子および毒素は、例えば「Hoefte et al.（1986）Eur.J.Biochem.161:273」、「Geiser et al.（1986）Gene 48:109」、および「Haider et al.（1988）Nucleic Acids Res.16:10927」で説明されている。本明細書に包含される開示の利益を受ける当業者は、cryIF分子のN末端毒素部分およびcryIA（b）毒素のC末端側プロ毒素部分をコードするDNAを容易に同定し用いることができると考えられる。
図9は、本発明の毒素において用いられうるアミノ酸置換の例を提供している。毒素の活性を変えることなく、さまざまな突然変異を毒素の配列中に作出することができることも当業者によく知られている。さらに、遺伝子コードの縮退により、一つの毒素をコードするさまざまなDNA配列を用いることもできる。当業者は、本発明にしたがって、このような代替的なDNAおよびアミノ酸配列を用いることができる。
本発明のプロ毒素置換技術は、毒素の発現を増強するため、他の種類のB.t.内毒素を用いることができる。この技術は、配列番号30に示された特徴的な配列を有する、他のB.t.毒素に対して最も応用性が高いと考えられる。
図１〜８のフローチャートは、本発明にしたがって実施できるベクター構築の一般的な概観である。スプライス・オーバーラップ伸長反応（SOE）というPCR技術を用いた突然変異誘発によって（Horton,R.M.,H.D.Hunt,S.N.Ho,J.K.Pullen,L.R.Pease（1989）Gene77:61-68）、BamHIおよびPvuIクローニング部位をcryIA（c）/cryIA（b）キメラ毒素遺伝子に導入して、プラスミドpMYC2224を作成した。pMYC1260などのcryIFを含むプラスミドから採ったcryIF遺伝子の領域をPCRによって作成して、pMYC2224のcryIA（c）/cryIA（b）遺伝子のBamHI-PvuI断片と置き換えることができる。本発明者が設計した新しいプラスミドpMYC2239は、毒素/プロ毒素分節の接続部位にcryIFが続くcryIA（c）の短い分節を含んでいた。したがって、このときのプロ毒素部分は、cryIA（b）（pMYC1050）に由来するものであった。pMYC2239のApaI断片を、cryIFクローン（pMYC2047）に由来するApaI断片で置き換えた。これによってできたクローン（pMYC2244）は、開始メチオニンから毒素/プロ毒素部分の結合部まではcryIFから成り、コーディング領域の末端まではcryIA（b）から成っていた。一定の領域にサイレントなコドン変異を導入するため、SOEによってクローンpMYC2243を構築した。クローンpMYC2523を得るため、サイレントなコドン変異を含むpMYC2243のApaI断片で、pMYC2244のApaI断片を置換した。このキメラpMYC2523は、pMYC2243よりも発現の向上を示すが、変更を加えていないcryIF蛋白質配列を含んでいる。
PvuI-BstEII蛋白質の一部を含む、pMYC2523の断片を、cryIA（c）/cryIA（b）遺伝子を含むプラスミドからPCRによって作成した同等の断片で置き換えることによって、cryIF/436キメラを組み立てることができる。このような遺伝子の一つが436遺伝子である（例えば、pMYC467で、米国特許第5,005,294号と第5,169,760号で開示されている）。この構築物はまた、天然のcryIF蛋白質の配列に較べて、発現の向上をもたらす。
遺伝子および毒素 本発明による有用な遺伝子および毒素には、開示された全長配列だけでなく、本明細書において特に例示された毒素の殺虫活性特性を保持しているこれらの配列の断片、異型、変異体、および融合タンパク質も含まれる。本明細書において用いられるように、遺伝子の「異型」または「変異」という語は、同じ毒素をコードするヌクレオチド配列、または同等の殺虫活性をもつ毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において用いられるように「等価的毒素」という語は、標的害虫に対して、請求の範囲の毒素と同じか、または本質的に同じ生物学的活性をもつ毒素を意味する。
いくつかの方法を用いて、活性毒素をコードする遺伝子を同定し得ることができることは、当業者に明らかであろう。特異的遺伝子または本明細書において例示される遺伝子の一部は、上記の培養細胞寄託機関に寄託されている単離物から得てもよい。また、これらの遺伝子、またはその一部もしくは変異体を、例えば遺伝子合成機を用いて合成して作成することもできる。遺伝子の変異体は、点突然変異を作出する標準的な技術を用いて、容易に構築することができる。また、標準的な手順にしたがって、市販のエクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて、これらの遺伝子の断片を作成することもできる。例えば、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを規則正しく切り出すBal31のような酵素又は部位特異的突然変異誘発を用いることができる。また、さまざまな制限酵素を用いて、活性断片をコードする遺伝子を得ることもできる。これらの毒素の活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いてもよい。
例示された毒素の殺虫活性を保持している断片および等価物も、本発明の範囲内にある。また、遺伝子コードの縮重のため、さまざまな異なるDNA配列が、本明細書に開示されたアミノ酸配列をコードすることができる。同じ毒素、または本質的に同じ毒素をコードする代替DNA配列を作成することは、当業者の技術の範囲内に当然含まれる。これらの変異DNA配列は、本発明の範囲内にある。本明細書において用いられるように「本質的に同じ」配列という語は、アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を有する、殺虫活性に実質的に影響しない配列を意味する。殺虫活性を保持している断片もまた、この定義に含まれる。
本発明による有用な毒素および遺伝子部分をさらに同定するための、さらに別の方法は、オリゴヌクレオチド・プローブを用いることによる。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適当な標識によって検出可能にすることができ、また、国際出願WO93/16094号で開示されているように、最初から蛍光を発するようにしてもよい。当業者にはよく知られているように、プローブ分子および核酸試料が、二分子間で強い結合を形成することによりハイブリダイズすれば、プローブおよび試料は実質的に相同であるということが合理的に推定できる。好ましくは、例えば「Keller,G.H.,M.M.Manak（1987）DNA Probes,Stockton Press,New York,NY.,pp.169-170」で述べられているような、当技術分野において公知の技術によって、厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行なう。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起きたか否かを既知の条件で判定するための方法を提供する。このようなプローブ解析は、本発明による毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチド分節は、DNA合成機を用いて、標準的な手順で合成することができる。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして用いることもできる。
本発明の一定の毒素が、本明細書において特に例示されてきた。これらの毒素は単に本発明毒素の模範例であるため、本発明が、例示されている毒素と同じか、または類似した殺虫活性をもつ変異体毒素または等価的毒素（および等価的毒素をコードするヌクレオチド配列）を含むことは、いうまでもなく明らかであろう。等価的毒素には、例示されている毒素に対するアミノ酸相同性があると考えられる。このアミノ酸相同性は、典型的には75％を超え、好ましくは90％を超え、最も好ましくは95％を超える。生物学的活性の原因となるか、または最終的に生物学的活性に関係する三次元構造の決定に関与する、重要な毒素領域で、アミノ酸の相同性が最も高い。この点に関して、活性に対して重要ではない領域にあるか、分子の三次元構造に影響しないような保存的アミノ酸の置換である場合には、そのようなアミノ酸置換は受容され、期待される。例えば、アミノ酸は、次のように分類できよう。すなわち、非極性、非荷電性、塩基性、および酸性である。同じ分類の中の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、置換によって化合物の生物学的活性が実質的に変化しない限り、本発明の範囲に含まれる。表１に、それぞれの分類に属するアミノ酸の例を列挙する。
場合によっては、非保存的な置換が行われることもある。重要な要素は、これらの置換によって、毒素の生物学的活性が有意に損なわれてはならないということである。
組み換え宿主 本発明の毒素をコードする遺伝子は、広い範囲の微生物または植物の宿主に導入することができる。毒素遺伝子を発現させると、殺虫性の毒素が、直接的または間接的に細胞内に産生され、維持される。本発明に係る両方の毒素を発現するB.t.菌株を作出するために、接合による遺伝子導入と組み換えによる遺伝子導入とを利用することができる。また、他の宿主生物を、協働作用的効果を起こさせるために用いられた毒素遺伝子の一方または双方で形質転換してもよい。例えば、シュードモナス菌などの適当な微生物宿主を用いて、該微生物を害虫のいる場所に適用し、そこで増殖させ、摂取させることができる。その結果、害虫を抑制できる。または、毒素遺伝子を宿している微生物を、毒素活性を持続させながら、細胞を安定させる条件の下で処理することができる。処理された細胞は、毒素活性を保持しており、それから標的害虫の環境へと適用することができる。
B.t.毒素遺伝子を適当なベクターによって微生物宿主に導入し、該宿主を生きたままの状態で環境中に適用する際には、一定の宿主微生物を用いることが重要である。一つまたは複数の目的の作物の「植物圏（phytosphere）」（葉面、葉圏、根圏および/または根面）に居住することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物および他の昆虫の生育場所）の中で、野生型の微生物とうまく競合でき、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定した維持と発現を提供し、そして好ましくは、周囲の環境の作用による分解および不活化から殺虫剤をよりよく保護できるように選択される。
多数の微生物が、さまざまな重要作物の葉表面（植物の葉の表面）および/または根圏（植物の根の回りの土）に生息していることが知られている。これらの微生物には、細菌、藻類、および菌類が含まれる。特に興味深い微生物は、例えば、細菌では、シュードモナス（Pseudomomas）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、メチロフィリウス（Methylophilius）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アグロバクター（Agrobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、およびアルカリジェネス（Alcaligenes）属、また菌類では、特に酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、およびオウレオバシディウム（Aureobasidium）属である。特に興味深い植物居住性細菌の種は、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas Syringae）、シュードモナス・フローレセンス（Pseudomonas Fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオチ（Rhizobium melioti）、アルカリジェネス・エントロファス（Alcaligenes entrophus）、およびアゾトバクター・ビンランディ（Azotobacter vinlandii）であり、植物居住性酵母の種は、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、R.グルチニス（R. glutinis）、R.マリナ（R. marina）、R.アウランチアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、C.ディフルエンス（C. diffluens）、C.ラウレンティ（C. laurentii）、サッカロミセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、S.プレトリエンシス（S. pretoriensis）、S.セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロミセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、S.オドラス（S. odorus）、クルイベロミセス・ベロネ（Kluyveromyces veronae）、およびアウレオバシディウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）である。特に重要なのは、色素性細菌である。
遺伝子の維持および発現を安定させる条件の下で、毒素をコードするB.t.遺伝子を、微生物の宿主の中に導入するために、さまざまな方法が利用できる。これらの方法は、当業者によく知られており、例えば、米国特許第5,135,867号に開示されており、これは本明細書に参照として包含される。
細胞の処理 毒素活性の持続期間を延ばし、細胞を安定化させるために、B.t.毒素を発現するバチラス・チューリンギエンシス又は組み換え細胞を処理することができる。生成される殺虫剤の微小カプセルは、細胞構造内にB.t.毒素又は毒素群を含む。細胞構造は、安定化され、微小カプセルが標的害虫の環境に適用された際に毒素を保護する。適当な宿主細胞には、原核生物も真核生物も含まれるが、通常、哺乳類などの高等生物に毒性がある物質を産生しない細胞に限定される。しかし、毒性物質が不安定であるか、または適用されるレベルが非常に低いため哺乳類宿主に対して毒性をもつ可能性がないときには、高等生物に毒性がある物質を産生する生物が用いられることもある。宿主として特に重要なのは、原核生物、および菌類などの下等真核生物である。
処理を行うとき、場合によっては胞子が用いられることもあるが、通常は胞子状態ではなく、完全な状態の実質的に増殖できる形態にある細胞が用いられる。
例えば、B.t.毒素遺伝子又は遺伝子群を含む微生物など、微生物細胞の処理は、毒素の性質を損なうような効果を与えたり、毒素を保護する細胞の能力を失わせたりしない限り、化学的方法、物理的方法、または、化学的および/または物理的方法を組み合わせた方法により行うことができる。化学薬品の例は、ハロゲン化試薬で、特に原子番号17〜80のハロゲンである。より特定すると、ヨウ素を用いて、穏やかな条件の下で十分な時間をかければ、所望の結果を得ることができる。他の適当な技術には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、塩化ゼフィラン、塩化セルピリジニウムなどの抗感染薬、イソプロピルおよびエタノールなどのアルコール類、ルゴールヨウ素、ブワン固定液、さまざまな酸、ヘリー固定液（Helly's fixatives）などの組織固定剤（Humason,Gretchen L.,動物組織技術（Animal Tissue Techniques）、W.H.Freeman and Company,1967）、または細胞を宿主の環境に与えたとき、細胞で産生される毒素の活性を保護し活性期間を引き延ばす、物理的（熱による）薬剤と化学的薬剤との組み合わせなどがある。物理的方法の例としては、ガンマ線照射およびX線照射などの短波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥などがある。微生物細胞の処理に関する方法は、米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されており、これらは、本明細書に参照として包含される。
細胞は、通常、環境条件に対する抵抗性を増すように、構造的な安定性を強化できる。殺虫剤は前駆体で存在しているため、細胞処理方法は、標的病原害虫によって前駆体をプロセシングして、成熟した殺虫剤の形態になるのを阻害しないようなものを選択すべきである。例えば、ホルムアルデヒドは、蛋白質を架橋させてしまうために、ポリペプチド殺虫剤前駆体のプロセシングを阻害する可能性がある。処理方法は、少なくとも毒素の生物学的利用能または生物活性の実質的な部位を保持するものでなければならない。
産生目的で宿主を選択するに当たって、特に重要な特性には、宿主へのB.t.遺伝子又は遺伝子群導入の容易さ、発現系の利用可能性、発現効率、宿主中での殺虫剤の安定性、および補助的な遺伝的因子の存在が含まれる。殺虫用微小カプセルとして用いられるための重要な特性には、厚い細胞壁、色素形成、細胞内パッケージングまたは封入体形成などの殺虫剤を保護する特質、水中環境でも生存すること、哺乳類に対する毒性がないこと、害虫が摂食に誘引されること、毒素を損なうことなく殺菌しやすく固定しやすいことなどが含まれる。他の考慮すべき事項には、処方および取り扱いの容易性、経済性、貯蔵安定性などが含まれる。
細胞の増殖 B.t.殺虫遺伝子又は遺伝子群を含む細胞性宿主は、B.t.遺伝子をもつ細胞のすべて、または実質的にすべてを選択できるような選択培地を提供して、DNA構造物が選択において優位性をもつような都合のよい栄養培地中で増殖させてもよい。次に、これらの細胞を従来からの方法に従って回収する。または、回収前に細胞を処理してもよい。
標準的な人工培地と発酵技術とを用いて、本発明に係る毒素を産生するB.t.細胞を培養することができる。発酵サイクルが終わったところで、当業において周知の方法によって、発酵培地からB.t.胞子及び結晶を最初に分離することによって菌体を回収することができる。回収されたB.t.胞子及び結晶は、取り扱いと特定の標的害虫への施用を容易にするために、界面活性剤や分散剤、不活性の担体、及びその他の成分を加えて、可溶性粉末、濃縮液、顆粒、またはその他の製剤に処方することができる。これらの処方及び施用手順は、当業においてよく知られている。
処方 誘因物質、胞子、結晶物、およびB.t.単離物の毒素、又は本明細書に開示されたB.t.単離物から得られる遺伝子を含んだ組み換え微生物を含む処方された餌用の顆粒は土に撒くことができる。処方した産物は、種子の被覆または根の処理剤として利用することもでき、また、作物の生活史のもっと後の段階で全植物体を処理するときに用いることもできる。B.t.細胞の植物および土壌処理剤は、無機質（葉珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）または植物性物質（粉末にしたトウモロコシの穂軸、イネの籾殻、クルミの殻など）などのさまざまな不活性物質と混ぜて、可溶性の粉末、顆粒、または粉剤の形で用いられる。この処方剤には、展着増強剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤、または界面活性剤が含まれていてもよい。液体処方薬は、水性でも非水性でもよく、泡状、ゲル状、懸濁液、乳化濃縮液などの形で用いられる。成分には、流動剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤、またはポリマーが含まれていてもよい。
当業者にはよく認識されているように、殺虫効果をもつ濃度は、それぞれの処方の性質によって大きく異なり、特に、濃縮して用いるか、直接用いるかによって異なる。殺虫剤は、重量にして1％以上であるが、重量にして100％のこともある。乾燥処方剤では、殺虫剤が重量にして約1〜95％あるが、液体処方剤では、一般的に、水相中の固体の重量で約1〜60％である。処方剤は、一般的に、約102から約104細胞数/mgである。これらの処方剤を、１ヘクタール当たり約50mg（液体か乾燥重で）から１kg以上散布する。
処方剤は、例えば、土壌および葉などの鱗翅目の害虫のいる環境に、噴霧や粉末散布、散水などによって散布することができる。
材料および方法
電気溶出したDNAの精製には、NACS（ベセスダ研究所（Bethesda Research Labs）、メリーランド州ゲティスバーグ）カラムクロマトグラフィーを用いた。精製は、結合緩衝液を0.5XTBE/0.2 M NaClに、溶出緩衝液を0.5XTBE/2.0 M NaClに修正した点を除いては、製造業者の指示に従って行なった。
DNAのα-［32P］dATPによるランダムプライマー標識は、製造業者の指示に従って、キット（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochemicals）、インディアナ州インディアナポリス）を用いて行なった。
ゲル精製とは、選択したDNA断片について、アガロース-TBEゲル電気泳動、電気溶出、およびNACSカラムクロマトグラフィーを連続して行うことを云い、これらの方法は当業者に周知のものである。
DNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅は、パーキン-エルマー社（コネティカット州ノーウォーク）のサーマルサイクラーで、以下のサイクル変数に従って25サイクル行なった。すなわち、94℃で1分間、37℃で2分間、72℃で3分間（72℃のサイクルのときは、それぞれ5秒間の伸長時間を設ける）である。PCR産物は、クローニング効率を上げるためにプロテアーゼKで処理した（Crowe,J.S.,Cooper,H.J.,Smith,M.A.,Sims,M.J.,Parker,D.,Gewert,D.（1991）Nucl.Acids Res.19:184）。
オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）を、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスター・シティー）のモデル381A DNA合成機で合成した。必要に応じて、製造業者の指示に従ってネンソーブ（Nensorb）カラム（ニューイングランドヌクレア-デュポン社（New England Nuclear-Dupont）、デラウエア州ウィルミントン）で精製を行なった。
回転培養器上、30℃のL-培地（LB）で増殖した対数増殖期の細胞を用いて、シュードモナス・フルオレセンスのエレクトロポレーションを行なった。氷冷した滅菌蒸留水で細胞を２、３回洗浄して、蒸留水で最初の容量の0.03倍に濃縮した。1〜20μlのDNAを、50〜300μlの細胞と混ぜた。バイオラド・ジーンパルサー（Biorad Gene Pulser）（バイオラド社、カリフォルニア州リッチモンド）用に選択したパラメータは、0.2cmの電極の間隔のキュベットで、200オーム、25マイクロファラッド、2.25キロボルトであった。エレクトロポレーション後、１ミリリットルのLBを加えて、細胞を２分間以上氷上に置いた。次に、細胞を２時間から一晩、30℃で静置した。
シュードモナス・フルオレセンスにおけるB.t.毒素の発現は、「一般微生物学の方法の手引き（Manual of Methods for General Bacteriology）、P.Gerhardt、1981年、米国微生物学会（American Society for Microbacteriology）、ワシントンD.C.」に記載されている推奨培地で行われた。グルコースの代わりにグリセロールを用いた。水道水で調合し、pHは7.2に調整した。接種用培養液はL培地で調製した。以下の調合を用いた：
基本培地（１リットル当たり）
グリセロール 65 g
（NH4）2SO4 1.0 g
Na2HPO4 5.24 g
KH2PO4 2.77 g
酵母抽出物 5.0 g
カザミノ酸 1.0 g
金属元素44（100 ml当たり）
EDTA 250 mg
ZnSO4-7H2O 1095 mg
FeSO4-7H2O 500 mg
MnSO4-H2O 154 mg
CuSO4-5H2O 39.2 mg
Co（NO3）2-6H2O 24.8 mg
Na2B4O7-10H2O 17.7 mg
沈澱が生じるのを防ぐため、6N H2SO4を数滴加える。
ハンターの無機物混合液（１リットル当たり）
ニトリロ酢酸（KOHで溶解中和したもの） 10 g
MgSO4-7H2O 14.45 g
CaCl2-2H2O 3.33 g
（NH4）6Mo7O24-4H2O 9.25 g
FeSO4-7H2O 99 mg
金属元素44 50 ml
pHを6.6〜6.8に調整する。
B.t.毒素の発現を解析するための接種を行う際、培地200 ml当たり４mlのハンター無機物混合液を加えた。そして、容量にして、フラスコ当たり2％の、一晩培養した接種物を加えた。培養液は、32℃、200 rpm以上で24時間増殖させた。この時点で、培養液に0.75 mM IPTGで発現誘導をかけ、２gの酵母抽出物を補充した。48時間後と72時間後に採取したサンプルを蛋白質用ゲル電気泳動した。レーザー濃度計によって130 kDaの蛋白質を定量した。
以下は、本発明を実施するための最良の形態を含む実験方法を例示した実施例である。これらの実施例は、本発明を制限するものではない。別記されない限り、すべてのパーセントは重量比であり、溶液の割合は容量比である。
実施例１−スプライスオーバーラップ伸長（SOE）による発現ベクターの改変
クローニングベクターを、RSF1010（pTJS260は、U.C.サンディエゴ校のドナルド・ヘリンスキー博士（Dr. Donald Helinski）から入手可能）由来の、広範な宿主域を有するpTJS260を基本として構築することができる。ベクター構築に用いられる系の例は、EPO特許出願0 471 564の中に見られる。本明細書において436遺伝子と呼ばれるcryIA（c）/cryIA（b）遺伝子と毒素は、米国特許第5,055,294号に開示されている。設計されたプラスミドpMYC1050は、436遺伝子を含む。pMYC1050は、毒素遺伝子およびpM3,130-7（米国特許第5,055,294号に開示されている）を、当技術分野において周知の方法によって、pMYC467（米国特許第5,169,760号で開示されている）などのpTJS260から作ったベクターに再クローニングして構築された。特に、pM3,130-7プロモーターおよび毒素遺伝子をBamHI-NdeI断片として得て、この断片を同じ部位（12100塩基目付近のBamHIと8000塩基目付近のNdeI）に結合した断片と入れ換えて、pMYC467プラスミドの中に入れることができる。
改良ベクターは、理想的には1個だけBamHIクローニング部位をもつ。プラスミドのBamHI部位はtacプロモーター（ptac）の上流にあるが、クレノウ酵素で平滑末端化し、ライゲーションし直すことによって除去することができる（図１）。この部位がなくなったことを、制限酵素消化によって確認した。この手順に従って作出したプラスミドをpMYC1050△BamHIと呼ぶ。構築物には、SOE突然変異誘発によって、BamHI部位をプラスミドに付け加える。SOE突然変異誘発は、毒素を含むNsiIで切断したDNA断片を、選抜マーカーとしてアンピシリン耐性（bla）遺伝子をもつ、より小さなベクターpGEM5（Promega Corp., Madison, WI）中にサブクローニングすることによって利用できる（図１）。断片は制限酵素消化によって方向性を決定することができる。このような処理によって作成されたプラスミドをpGEMtoxと名付けた。
毒素をコードする領域のDNAに、PCRを介在させたSOE技術によって、図２に示したような制限酵素クローニング部位を導入するための突然変異を起こさせた。プライマーとして用いられたオリゴヌクレオチドを下に示す。
pMYC1050のDNAを、プライマーセットA/B、C/D、E/D、およびF/Gを使用するPCR増幅のための鋳型に用いた。増幅したDNA断片をAB、CD、EDおよびFGと名付けた。増幅したDNAは、当分野では周知の方法である、アガロース-TBEゲル電気泳動、電気溶出、およびNACSカラムクロマトグラフィーによって精製した。精製した鋳型DNAを、２回目のPCR反応に用いた。断片ABおよびCDを混合し、プライマーAおよびDで増幅した。別の反応において、断片EDとFGを混合して、プライマーEおよびGを用いて増幅した。増幅されたDNAを、当分野では周知の方法である、アガロース-TBEゲル電気泳動によって解析し、対応するようにサイズが増加した断片を切り出し、電気溶出してNACSカラムで精製した。増幅されたDNA断片は、参照のためにADまたはEGと呼ばれる。
新しい制限酵素部位をもつDNA断片ADまたはEGを、いくつかのサブクローニング法によって毒素を含むDNAの中に取り込んだ（図２および３）。pGEMtoxをClaIまたはHindIIIで制限酵素消化した。ベクターを含むDNAをゲル精製した。断片ADをClaI消化して、ClaI消化したpGEMtoxベクターDNAとライゲーションした。断片EGをHindIIIで制限酵素消化して、HindIII消化したpGEMtoxベクターDNAにライゲーションした。ライゲーション混合液で大腸菌株NM522を形質転換した。単離されたコロニー由来のプラスミドDNAを制限酵素消化して、正しく構築された構築物を同定した。新しいBamHI部位をもつプラスミドをpGEMtoxBamHIと名付けた。新しいPvuI部位をもつプラスミドをpGEMtoxPvuIと名付けた。プラスミドpGEMtox BamHI由来のBamHI部位をもつClaI断片を、pGEMtox PvuI由来のClaI部位で切断したベクターを含む断片をフォスファターゼ処理したものとライゲーションした。ライゲーション混合液で大腸菌株NM522を形質転換した。プライマーセットC/DによるPCR解析および制限酵素消化によって、正しく構築された構築物を同定した。新しい制限酵素部位をもつプラスミドをpGEMtox BamHI/PvuIと名付けた。
pGEMtox BamHI/PvuI由来の挿入配列とpMYC1050△BamHI由来のベクターを構築して発現ベクターを完成した（図３および４）。ゲル精製した挿入配列を、（混入したベクターを除去するため）NsiI消化およびScaI消化して、pGEMtox BamHI /PvuIから調製した。これを、NsiIで消化したベクターを含むpMYC1050△BamHI DNAをゲル精製したものにライゲーションした。ライゲーション混合液で大腸菌株NM522を形質転換し、形質転換混合液を、テトラサイクリンを12μg/mlの濃度で含むLB寒天培地に塗布した。NsiI挿入配列を含むコロニーを、コロニーハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィーによって同定した。NsiIクローニング部位の両側に位置するプライマーセットA/Dを用いて、PCRによって挿入配列の方向を決め、アガロース-TBEゲル電気泳動をした。正しく構築されたプラスミドをpMYC2224と名付けた。毒素のDNAおよびタンパク質配列をそれぞれ配列番号18および19に示す。ラクトースで誘導できるP.フローレセンス（P.fluorescens）の菌株に正しく構築されたプラスミドをエレクトロポレーションした。形質転換混合液を、テトラサイクリンを20μg/mlの濃度で含むLB寒天培地に塗布した。次のクローニング実験に用いるために、P.フローレセンス（P.fluorescens）からプラスミドDNAを調製した。
実施例２−pMYC2224へのcryIF超可変領域のサブクローニング
cryIF（pMYC1260）の超可変領域を含むDNA断片を、pMYC2224のBamHI-PvuI毒素部分を含むDNA断片と交換した（図４）。コーディング領域には以前からBamHI部位が存在しているため、BglIIをクローニングのために選択した。BamHI及びBglIIの突出配列の４塩基が一致するため、制限酵素部位は結合部分から失われるが、ライゲーションをすることができる。PCR用に新しいプライマーを合成しなければならなかった。
プライマーL/Dを用いたPCRによって、pMYC1260を鋳型にして毒素部分を含むDNA断片を作製した。サブクローニングのために、DNAをBglIIとPvuIで制限酵素消化した。tetAR座位にはPvuI部位が多数あるため、二つの別々の断片から、ベクターを含むDNAを分離することが必要であった。一つ目の断片を得るために、pMYC2224をBamHI x BstEIIで制限酵素消化し、Ptac-tetAR座でrep機能を含む大きなDNA断片をゲル精製した。二つ目の断片を得るために、pMYC2224をBstEII x PvuIで制限酵素消化し、ベクター-プロ毒素部分を含むDNA断片をゲル精製した。３つの断片のライゲーションを行なって、大腸菌株NM522の形質転換に用いた。BamHI/BglII融合部分に架かるプライマーセットN/Oを用いたPCR解析とアガロース-TBEゲル電気泳動によって、大体適正なプラスミドを同定した。
適正なプラスミドをpMYC2239と名付けた。このプラスミドは、アミノ末端がcryIA（c）から、毒素/プロ毒素の結合部分まではcryIFから、また、プロ毒素部分全体はcryIA（b）から構成される。毒素DNA及び蛋白質の配列は、それぞれ配列番号：20及び配列番号：21である。
実施例３−シュードモナス・フルオレセンス（P. fluorescens）発現プラスミドpMYC1260及びpMYC2047の構築
シュードモナス・フルオレセンスで発現させるために、以下のように、クローン化した毒素遺伝子cryIFを改変することができる。
１．pKK223-3（ファルマシア大腸菌ベクター）から採ったPtacプロモーターとrrnBターミネーターとを含むBamHI-ScaI断片を、pMYC1197のBamHIと平滑化KpnIベクター断片の中にライゲーションして（欧州特許第0 417 564号に記載される）、pTJS260に由来するベクター（ドナルド・ヘリンスキー博士、カリフォルニア大学サンディエゴ（Donald Helinski,U.C.San Diego））の中にpKK223-3 rrnBターミネーター配列を含むプラスミドを作製することができる。組み立てられたベクターは、大腸菌を形質転換し、テトラサイクリン選抜下で増殖させた後回収した。
２．pMYC1603（NRRL B-18517より）からの、毒素遺伝子を含む約3800 bpのNdeI-Nde-I断片（DNAポリメラーゼ及びdNTPを用いて末端を平滑化したもの）を、pKK223-3のEcoRI及びHindIII部位を平滑化した部位にライゲーションして、PtacがプロモーターとなっているcryIF毒素部分をもつプラスミドを作製することができる。PtacをプロモーターとするcryIF毒素遺伝子を含むプラスミドは、大腸菌を形質転換させ、アンピシリン選抜下で増殖させ、当業において周知の技術により、Ptacプロモーターからの発現にとって適当な方向のインサートを有するプラスミドをスクリーニングした後回収できる。
３．PtacをプロモーターとするcryIF毒素を、プラスミドpTJS260から得たBamHI及びApaI末端を有する2.4 kbのDNA断片と、上記のステップ１のプラスミドの複製開始点を含む、ApaIからHindIIIまでの8.5 kbの断片、ならびに、上記のステップ２の、Ptacプロモーター及びcryIF毒素遺伝子を含むHindIIIと部分消化されたBamHIの断片を用いた、３つの断片のライゲーションを行なってpTJS260由来のベクターの中に組み込むことができる。
この結果できたpTJS260由来の、cryIF毒素を発現するプラスミド（pMYC1260）を、エレクトロポレーションによってシュードモナス・フルオレセンス（P. fluorescens）に導入することができる。
４．プライマーH及びKを用いた、適当なcryIFを鋳型とするPCRの後、SpeI及びKpnIにより制限酵素消化し、ゲル精製して得たSpeIからKpnIまでの断片、ステップ３のプラスミドからの約10 kbのApaIからKpnIまでの断片、および、Ptacプロモーターを含むpMYC1197のApaIからSpeIまでの約2600 bpの断片をライゲーションすることによってpMYC2047を構築できる。シュードモナス・フルオレセンスをエレクトロポレーションした後、プラスミドを制限酵素消化して、適正なcryIF毒素発現プラスミドを判定した。
実施例４−cryIF/cryIA（b）キメラの構築
アミノ末端のcryIA（c）部分は、単純で簡単な交換によって、cryIFのコーディング配列によって置き換えることができる（図５）。tetAR座位もcryIFコーディング配列もApaI部位を有する。pMYC2047から、tetAR遺伝子の一部とcryIFのアミノ末端を含む短いApaI断片を単離し、pMYC2239からの大きなApaIベクターを含む断片をライゲーションすることができる。シュードモナス・フルオレセンスのラクトースで誘導できる菌株をライゲーション混合液でエレクトロポレーションし、テトラサイクリンを20μg/ml含むLB寒天培地で培養することができる。ラクトースで誘導できる菌株は、当業者に知られており、例えば、米国特許第5,169,760号に記載されている。ApaI断片が正しい方向に入れば、テトラサイクリン耐性が再構成される。この方法で作成されたクローンは、制限酵素消化によって大体正しいことが分かり、pMYC2244と名付けられた。毒素DNAの配列は配列番号：22に示されており、推定される蛋白質配列は配列番号：23に示されている。
実施例５−cryIFの限定されたコドン再改変物の構築
GenBank/EMBL配列ライブラリーの遺伝子を解析して判定したところ、シュードモナス属のコドン使用は、トリプレットコドンにゆらぎのある位置では、GまたはCが選択される。cryIF遺伝子の限られた領域に、ゆらぎの位置で選択されるようなサイレントなコドン変更をSOEを用いて加えた（図６）。用いたオリゴヌクレオチドを以下に示す：
プライマーセットH/IまたはJ/Kを用いて、２つの独立したPCR反応をpMYC2047を鋳型にして行なった。増幅されたDNA断片をHIまたはJKと呼んだ。HI断片とJK断片を混ぜ、プライマーセットH/KでPCR増幅する、第二のPCR反応を行なった。大きい方のSOEDNAをゲル精製してSpeI x KpnIで制限酵素消化した。SpeI-ApaI Ptac-tetAR座位DNAと、ApaI-KpnIベクター-プロ毒素部分のDNA、および、SpeI-KpnI PCR DNAを用いて、３つの断片のライゲーションを行なった。ラクトースで誘導できるシュードモナス・フルオレセンス菌株をライゲーション混合液でエレクトロポレーションした。プライマーセットP/Qを用いたPCR解析と、アガロース-TBEゲル電気泳動によって、大まかに正しいといえるクローンを同定した。野生型遺伝子とコドン改変遺伝子とを区別するために、オリゴP（配列番号：15）を設計した。
完成したプラスミドをpMYC2243と名付けた。毒素DNA配列を、配列番号：24に示す。毒素蛋白質配列は変更されていないと推定され、配列番号：25に示されている。
実施例６−限定されたコドン改変を含むcryIF/cryIA（b）キメラの構築
上記のpMYC2244（cryIF/cryIA（b））と同じように、ApaI断片の交換手法を用いて構築物を組み立てた（図７）。毒素-tetAR座位ApaI DNAの小断片をpMYC2243からゲル精製した。大きい方の、ベクター-プロ毒素部分のApaI DNA断片を、pMYC2244からゲル精製した。完成したプラスミドはpMYC2523と名付けた。推定されるDNA配列及び蛋白質配列を、それぞれ配列番号：26及び配列番号：27に示す。
実施例７−pMYC2244及びpMYC2523からの毒素の発現比較
シュードモナス・フルオレセンス（P. fluorescens）における毒素発現を既述したようにして解析した。誘導後24時間と48時間で、pMYC2523を有する菌株は、pMYC2244を有する菌株よりも多量の毒素を産生した。シロイチモンジヨトウガの幼虫（Spodoptera exigua）に対する毒素の特異的な活性は、統計的には変化しなかった。
実施例８−限定されたコドン改変を含むcryIF/436キメラの構築
pMYC2523のcryIA（b）プロ毒素を436プロ毒素部分に置き換えて、第二の型のキメラ毒素を組み立てた（図８）。436プロ毒素配列は、本当のC末端を除いてはcryIA（c）配列から成る（米国特許第5,128,130号および第5,169,760号を参照。これらは全体として、本明細書において参照文献として包含される）。pMYC467（米国特許第5,169,760号）などのプラスミドを鋳型として用い、プライマーセットF/Mを用いたPCRによって、クローニングのためのプロ毒素DNAを作製した。
PCR DNAをPvuI x BstEIIで制限酵素消化した。pMYC2523からのSpeI-PvuI毒素DNA、pMYC2523からのSpeI-BstEIIベクターDNA、および、PvuI-BstEII PCRプロ毒素部分のDNAを用いて３つの断片のライゲーションを行なった。ラクトースで誘導できるシュードモナス・フルオレセンス菌株をライゲーション混合液でエレクトロポレーションした。プライマーセットF/Gを用いたPCR解析と、アガロース-TBEゲル電気泳動によってサイズが僅かに増加するものをスクリーニングして、大まかに正しいといえるプラスミドを同定した。構築したプラスミドをpMYC2254と名付けた。推定されるDNA配列及び蛋白質配列を、それぞれ配列番号：28及び配列番号：29に示す。
実施例９−pMYC2243及びpMYC2254からの毒素の発現比較
シュードモナス・フルオレセンスにおける毒素発現を既述したようにして解析した。pMYC2254からの毒素の発現は、pMYC2243の発現よりも増加していた。
実施例10−オオタバコガ（Heliothis zea）の幼虫に対する、CryIFキメラ毒素とCryIA（c）キメラ毒素との間の協働作用の解析
24匹のオオタバコガ（Heliothis zea）の一齢幼虫を、さまざまな濃度の毒素を含む寒天食餌の上に置いた。処理後７日目に、成長阻害を測定して等級に分けた。一齢から二齢への脱皮が阻害された場合、幼虫は成長阻害されたものとした。協働因子（SF）と予測活性（E［exp］）を推計する計算式は以下の通りである。
SF = E（obs）/E（exp）
ここで、
SF＝協働因子
E（obs）＝観察された死亡率
E（exp）＝予測される死亡率
E（exp） = a + b - （ab/100）
ここで、
a＝化合物Aによる活性
B＝化合物Bによる活性
1よりも大きいSF値は協働作用があることを示している（Levy,Y.,M.Benderly,Y.Cohen,U.Gisi,D.Bassard（1986）、OEPP/EPPO会報、16:651〜657）。
Abbott,W.S.（1925）J.Economic Entomology 18:265〜267
実施例11−オオタバコガ（Heliothis zea）の幼虫に対する、CryIFキメラ毒素とCryIA（c）キメラ毒素との間の協働作用の解析
24匹のオオタバコガ（Heliothis zea）の一齢幼虫を、さまざまな濃度の毒素を含む寒天食餌の上に置いた。処理後７日目に、成長阻害を測定して等級に分けた。一齢から二齢への脱皮が阻害された場合、幼虫は成長阻害されたものとした。標準的なプロビット解析技法を用いて、集団の50パーセントを阻害するのに必要とされる用量（ED50）を判定した。協働因子（SF）と予測有効用量（ED［exp］）を推計する計算式は以下の通りである。
SF = ED（exp）/ED（obs）
ここで、
ED（exp）＝混合剤の予測有効用量
ED（obs）＝混合剤の観察有効用量
ED（exp） = （a＋b ）/ a/EDA＋b/EDB
ここで、
a＝混合剤における化合物Aの割合
b＝混合剤における化合物Bの割合
EDAおよびEDB＝混合剤において、AおよびBが等しい効果をもつ用量
１よりも大きいSF値は協働作用があることを示している（Levy et al.（1986）、前掲）［ウォドリー（Wadley）法参照］。
本明細書で説明されている実施例及び態様は、例示のためにすぎないこと、それに基づくさまざまな修正または変更が当業者に示唆されており、これらも本出願の意図及び範囲ならびに添付の請求の範囲に含まれることと解されるべきである。
配列表
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：39塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１：
（2）配列番号：２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２：
（2）配列番号：３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：29塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：３：
（2）配列番号：４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：28塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：４：
（2）配列番号：５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：５：
（2）配列番号：６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：28塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：６：
（2）配列番号：７の情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：７：
（2）配列番号：８の情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：36塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：８：
（2）配列番号：９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：17塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：９：
（2）配列番号：１０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：23塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１０：
（2）配列番号：１１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：45塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１１：
（2）配列番号：１２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：64塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１２：
（2）配列番号：１３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：65塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１３：
（2）配列番号：１４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：17塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１４：
（2）配列番号：１５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１５：
（2）配列番号：１６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：41塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１６：
（2）配列番号：１７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：24塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１７：
（2）配列番号：１８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3465塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１８：
（2）配列番号：１９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1155アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１９：
（2）配列番号：２０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3450塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２０：
（2）配列番号：２１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1150アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２１：
（2）配列番号：２２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3444塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２２：
（2）配列番号：２３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1148アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２３：
（2）配列番号：２４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3522塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２４：
（2）配列番号：２５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1174アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２５：
（2）配列番号：２６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3444塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２６：
（2）配列番号：２７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1148アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２７：
（2）配列番号：２８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3522塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２８：
（2）配列番号：２９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1174アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２９：
（2）配列番号：３０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：12アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３０：
（2）配列番号：３１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：8アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３１：
（2）配列番号：３２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1174アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３２：
（2）配列番号：３３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1155アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３３：
（2）配列番号：３４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1182アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３４：
（2）配列番号：３５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1148アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３５：
（2）配列番号：３６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1174アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３６：
土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.）は、グラム陽性で、胞子を形成する細菌であり、パラ胞子的（parasporal）な結晶性蛋白質の封入体を特徴とする。これらの封入体は、しばしば、特殊な形状の結晶として顕微鏡で見ることができる。この蛋白質は、病原生物に対して非常に毒性が強く、特異的な毒素活性を示すことがある。ある種のB.t.毒素遺伝子が単離され、配列が決定されており、組み換えDNAによるB.t.産物が製造され、使用が認められている。さらに、遺伝子工学技術を用いてこれらのB.t.内毒素を農業環境に取り入れさせるために、害虫抵抗性に関する内毒素遺伝子を用いて遺伝子工学的に改良した植物を用いたり、安定化した微生物細胞そのものをB.t.内毒素の運搬体として用いることを含む、新しい方法が開発中である（Gaetner, F.H., L. Kim［1988］TIBTECH 6:S4-S7）。このように、単離されたB.t.内毒素が、商業上の価値を持ちつつある。
10年前まで、B.t.農薬の商業的な利用は、鱗翅目（毛虫）の害虫に対してだけという、狭い範囲に大きく制限されていた。バチルス・チューリンギエンシス・クルスタキ亜種（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）から調製された胞子および結晶が、長い間、鱗翅目（毛虫）用の殺虫剤として商業的に用いられてきた。例えば、B.チューリンギエンシス・クルスタキHD-1変種（B.thuringiensis var.kurstaki HD-1）は、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を示すδ-内毒素と呼ばれる結晶を産生する。
しかし、近年になって、研究者たちは、ずっと広い範囲の害虫に特異性をもつB.t.農薬を発見した。例えば、別のB.t.種、すなわち、イスラエレンシス（israelensis）およびテネブリオニス（tenebrionis）（B.t.M-7、B.t.san diegoとしても知られている）が、それぞれ、双翅目とコルコプテラ（Colcoptera）目の昆虫を抑制するために商業的に用いられている（Gaetner,F.H.,（1989）、作物防御剤の制御的輸送「殺虫蛋白質の細胞内運搬系：生存微生物と非生存微生物」（Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins:Living and Non-Living Microorganisms,in Controlled Delivery of Crop Protection Agents）、R.M.Wilkins,ed.,Taylor and Francis,New York and London,1990,pp.245-255）。また、「Couch,T.L.（1980）、バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変種の蚊に対する病原性（Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var.israelensis）、Developments in Industrial Microbiology 22:61-76」、「Beegle, C.C.（1978）、農業環境系における昆虫に発生する細菌の利用（Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems）、Developments in Industrial Microbiology 20:97-104」も参照のこと。「Krieg,A.,A.M.Huger,G.A.Langenbruch,W.Schnetter（1983）Z.ang.Ent.96:500-508」は、バチルス・チューリンギエンシス・テネブリオニス変種（Bacillus thuringiensis var.tenebrionis）について述べ、これが鞘翅目の２種の甲虫に対して活性があることを報告している。それらは、コロラド・ジャガイモ甲虫のレプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）およびアゲラスチカ・アルニ（Agelastica alni）である。
最近、新しいB.t.の亜種が同定され、活性δ内毒素に関連する蛋白質をコードする遺伝子が単離された（Hofte,H.,H.R.Whiteley（1989）Microbiological Reviews 52（2）:242-255）。ヘフテ（Hofte）およびウィトリー（Whiteley）は、B.t.結晶蛋白質遺伝子を４種類に大別した。これらは、CryI（鱗翅目特異的）、CryII（鱗翅目および双翅目特異的）、CryIII（鞘翅目特異的）、およびCryIV（双翅目）である。他の害虫に特異的に有毒な菌株が発見されたことも報告されている（Feitelson,J.S.,J.Payne,L.Kim（1992）Bio/Technology 10:271-275）。
B.t.結晶蛋白質遺伝子の大腸菌におけるクローニングおよび発現が、発表文献に開示されている（Schnepf,H.E.,H.R.Whiteley（1981）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2893-2897）。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号はいずれも、B.t.結晶蛋白質の大腸菌における発現を開示している。毒性を強化し、標的害虫に対する宿主範囲の拡大を示すハイブリッドB.t.結晶蛋白質遺伝子が構築されている。米国特許第5,128,130号および第5,055,294号を参照のこと。米国特許第4,797,276号および第4,853,331号は、さまざまな環境で鞘翅目を抑制するために用いることができるB.チューリンギエンシス（B. thuringiensis）サンディエゴ（san diego）株（M-7、B.t.tenebrionisとしても知られている）を開示している。米国特許第4,918,006号は、双翅目に対する活性をもつB.t.毒素を開示している。米国特許第4,849,217号は、アルファルファ・ゾウムシ（alfalfa weevil）に対して活性をもつB.t.単離物を開示している。米国特許第5,151,363号および米国特許第4,948,734号は、線虫に対する活性をもつB.t.単離物を開示している。
多くの研究と資源の投入の結果、新しいB.t.単離物およびB.t.単離物の新しい利用に関する他の特許が発行されている。しかし、新しいB.t.単離物の発見および既知のB.t.単離物の新しい利用は、依然として経験に依存する予測不可能な技術である。
バチルス・チューリンギエンシスのδ-内毒素結晶蛋白質分子の大半は、二つの機能部分からなる。プロテアーゼ抵抗性コア毒素が第一の部分で、蛋白質分子の前方の約半分に相当する。cryIIIA B.t.δ-内毒素のコア部分の三次元構造が明らかにされており、すべての関連毒素が同じ全体構造をもつと云われている（Li,J.,J.Carroll,D.J.Ellar（1991）Nature 353:815-821）。この分子の後ろの半分が第二の部分である。本願のため、本明細書において、この第二の部分を「プロ毒素分節」と呼ぶことにする。プロ毒素分節は、毒素の結晶形成に関与すると考えられている（Arvidson,H.,P.E.Dunn,S.Strand,A.I.Aronson（1989）Molecular Microbio logy 3:1533-1534;Choma,C.T.,W.K.Surewicz,P.R.Carey,M.Pozsgay,T.Raynor,H.Kaplan（1990）Eur.J.Biochem.189:523-527）。全長130 kDの毒素分子は、昆虫の腸の中でプロテアーゼにより速やかに処理されて、抵抗性コア分節になる。このように、プロ毒素分節は、毒素分子をプロセシングするプロテアーゼを減少させ、コア部分が昆虫に接近しにくくすることによって（Hainder,M.Z.,B.H.Knowles,D.J.Ellar（1986）Eur.J.Biochem.156:531-540）、または毒素の可溶性を低下させることによって（Aronson,A.I.,E.S.Han,W.McGaughey,D.Johnson（1991）Appl.Environ.Microbiol.57:981-986）、毒素に対する昆虫の特異性を部分的に担っていると考えられる。
毒素ドメインで結合したキメラ蛋白質が、CryICとCryIA（b）の間で報告されている（Honee,G.,D.Convents,J.Van Rie,S.Jansens,M.Perferoen,B.visser（1991）Mol.Microbiol.5:2799-2806）が、これらのキメラ蛋白質の活性は、適当な昆虫に対するCryICと較べると、非常に低いか、検出できないほどである。
ハニーら（Honee,G.,W.Vriezen,B.visser（1990）Appl.Environ.Microbiol.56:823-825）はまた、CryICおよびCryIA（b）の毒素ドメインを直列に連結することによるキメラ融合蛋白質の作出を報告した。その結果できた蛋白質は、各毒素の活性を組み合わせた活性に相当する、広い活性スペクトルを示した。しかし、そのキメラの活性は、標的昆虫のいずれに対しても増加しなかった。
毒素または生物学的活性剤を混合すると、それによってできる混和剤の生物学的活性に、いくつかの面で影響が表れることがある。できた混和剤の生物学的活性は、各毒素の活性の総和であると考えられる。混和剤の生物学的活性は、各薬物の活性の総和より少ない、または各薬物の活性の総和よりも大きいと考えられる。
特定のB.t.系統によって産生されるβ外毒素のヌクレオチドが、鱗翅目の害虫であるスポドプテラ・エキシグア（Spodoptera exigua）に対する活性を上昇させるよう、B.t.変種クルスタキ（kurstaki）のδ内毒素蛋白質と協働作用することが分かった（Moar,W.J.,W.L.A.Osbrink,J.T.Trumble（1986）J.Econ.Entomol.79:1443〜1446）。B.t.変種イスラエレンシス（islaelensis）に由来する27 kDaと65または130 kDaの蛋白質とを混合させると、蚊の幼虫に対する毒性を強化することができる（Chilcott,C.N.,D.J.Ellar（1988）J.Gen.Microbiology 132:2551〜2558;Yu et al.,1987;Wu D.,F.N.Chang（1985）FEBS 190（2）:232〜236）。B.t.変種イスラエレンシス由来のCryIVAおよびCryIVB毒素もともに用いられてきた（Angsuthanasomat,C.,N.Crickmore,D.J.Ellar（1992）FEMS Microbiol.Lett.94:63〜68）。
発明の簡単な概要
本発明は、２つのバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus Thuringiensis）（B.t.）のδ内毒素蛋白質を組み合わせることにより、鱗翅目害虫に対する効果的で強化された作用の発見に関する。より特定すると、CryIFキメラ毒素は、CryIA（c）キメラ毒素と組み合わせると、鱗翅目害虫に対して予想以上に強い毒性を示すように、協働作用することである。
本発明に係る協働作用的効果は、毒素蛋白質の一つを産生する菌株を混合物として組み合わせることにより達成される。本発明に係る２つの毒素を発現するように操作した組み換え宿主も協働作用的効果を呈するために用いることができる。適当な組み換え宿主には、原核生物及び下等真核生物並びに植物が含まれる。
本発明で有用なキメラCryIF遺伝子を、天然のcryIFプロ毒素部分の全部または一部を異種生物のプロ毒素部分で置き換えて構築することもできる。特に、天然のcryIF毒素のプロ毒素をコードする領域の全部または一部を、CryIA（b）遺伝子のプロ毒素コーディング領域の全部または一部で置き換えて用いることができる。同様に、cryIF毒素のプロ毒素をコードする領域の全部または一部を、cryIA（c）/cryIA（b）キメラ遺伝子のプロ毒素の全部または一部をコードするDNAで置き換えたキメラ遺伝子を構築することができる。特異的な態様において、cryIA（c）/cryIA（b）キメラ遺伝子とは、436と表示されているもので、米国特許第5,128,130号に記載されているものである。この遺伝子は、P.フルオレセンス（P. fluorescens）MR436のプラスミドから得られる。
広範な微生物または植物を宿主として、キメラ遺伝子を導入することができる。キメラ遺伝子を発現するように形質転換した宿主は、本発明に係る、鱗翅目に活性な毒素を産生させるために用いることができる。形質転換された宿主は、殺虫性毒素を産生するために用いることができるが、毒素を産生させるために植物細胞を形質転換した場合には、植物体が昆虫の攻撃に対して耐性になるはずである。本発明は、さらに、キメラ毒素またはキメラ毒素をコードする遺伝子を含む宿主を、鱗翅目害虫を制御する方法において利用することに関する。さらにまた、本発明には、実質的に無処理のB.t.細胞を組み合わせたもの、または遺伝子を発現して、本発明の毒素を産生する組み換え細胞が含まれる。標的害虫がいる環境に、実質的には無処理の細胞を施用するときには、殺虫剤活性が持続するよう、細胞を処理することができる。このような処理には、化学的手段もしくは物理的手段によるもの、または化学的手段と物理的手段とを組み合わせたものとがありうるが、この技術は、殺虫剤の協働作用特性に有害な影響を及ぼしたり、殺虫成分を保護する細胞の能力を低下させたりしないものであることが必要である。処理細胞は、殺虫性毒素を保護する被膜として機能する。この毒素は、標的害虫が摂食したときに、毒素として働くように利用できるようになる。
【図面の簡単な説明】
図１−pMYC1050からBamHI部位を除去して、クレノウポリメラーゼで平滑化し、プラスミドpMYC1050△BamHIを作成する。クローニングを効率的に行うため、毒素のオープンリーディングフレームの大部分を含むNsiI DNA断片をpGEM5中にクローニングする。得られるプラスミドをpGEMtoxと名付ける。C＝ClaI、H＝HindIII。
図２−スプライス・オーバーラップ伸長反応（SOE）技術によって、毒素DNAにBamHIおよびPvuIクローニング部位を導入した。新しい部位をもつDNA断片をpGEMtoxの相同なDNA断片に置き換えるために用いる。得られるプラスミドは、pGEMtox BamHIまたはpGEMtox PvuIである。矢印の下のAからGの文字は、本文中のオリゴヌクレオチドプライマーに相当する。縦線の上の文字は、制限酵素部位に相当する。B＝BamHI、C＝ClaI、H＝HindIII、P＝PvuI、S＝SacI。
図３−pGEMtox PvuIの相同配列と入れ換えるため、BamHI変異を含むDNA断片を用いる。得られる両方のクローニング部位をもつプラスミドを、pGEMtox BamHI/PvuIとする。発現プラスミドを作成するために、毒素を含むNsiI断片を切り出して、広範な宿主域をもつベクターpTJS260中にクローニングする。B＝BamHI、C＝ClaI、H＝HindIII、P＝PvuI。
図４−新しい制限酵素部位をもつ、NsiI毒素を含む断片を、pMYC1050△BamHI由来のベクターを含むDNAにライゲーションしてpMYC2244を得る。cryIF毒素を含むBamHI-PvuI PCR由来のDNA断片をpMYC2244の同等の断片と置換する。得られるキメラをpMYC2239と名付ける。B＝BamHI、C＝ClaI、H＝HindIII、N＝NsiI、P＝PvuI。
図５−プラスミドpMYC2244を作成するために、pMYC2047のApaI DNAの小断片で、pMYC2239の相同領域を置換する。このキメラには毒素領域のcryIFと、プロ毒素領域のcryIA（b）とが含まれる。C=ClaI、H=HindIII、N=NsiI、P=PvuI。
図６−SOEによって、サイレントなコドン置換をcryIF毒素に導入する。置換させた、SpeI-KpnI PCR DNA断片で、pMYC2047の相同な毒素を含む断片を置き換える。その結果得られるプラスミドはpMYC2243である。矢印の下のHからKまでの文字は、本文中のオリゴヌクレオチドプライマーに相当する。
図７−pMYC2243のApaI DNAの小断片で相同な断片を置換して、pMYC2244にサイレントなコドン置換を導入する。最終的にできるプラスミドはpMYC2523である。P=PvuI。
図８−PCRで作成したPvuI-BstEIIプロ毒素DNAで、pMYC2523の相同領域を置き換えて、436プロ毒素を含むキメラ毒素を構築する。最終的にできるプラスミドはpMYC2254である。矢印の下のF及びMの文字は、本文中のオリゴヌクレオチドプライマーに相当する。
図９−cryIF/cryIA（b）キメラ蛋白質の配列と残基毎の置換を示す。「Cons」行は、cryIF/cryIA（b）のキメラ配列を示している。「Alt」行は、436蛋白質、cryIA（b）変異蛋白質およびCryIFプロ毒素に見られる置換を残基毎に示している。
配列の簡単な説明
配列番号：１は、オリゴヌクレオチド・プライマー「A」である。
配列番号：２は、オリゴヌクレオチド・プライマー「B」である。
配列番号：３は、オリゴヌクレオチド・プライマー「C」である。
配列番号：４は、オリゴヌクレオチド・プライマー「D」である。
配列番号：５は、オリゴヌクレオチド・プライマー「E」である。
配列番号：６は、オリゴヌクレオチド・プライマー「F」である。
配列番号：７は、オリゴヌクレオチド・プライマー「G」である。
配列番号：８は、オリゴヌクレオチド・プライマー「L」である。
配列番号：９は、オリゴヌクレオチド・プライマー「N」である。
配列番号：１０は、オリゴヌクレオチド・プライマー「O」である。
配列番号：１１は、オリゴヌクレオチド・プライマー「H」である。
配列番号：１２は、オリゴヌクレオチド・プライマー「I」である。
配列番号：１３は、オリゴヌクレオチド・プライマー「J」である。
配列番号：１４は、オリゴヌクレオチド・プライマー「K」である。
配列番号：１５は、オリゴヌクレオチド・プライマー「P」である。
配列番号：１６は、オリゴヌクレオチド・プライマー「Q」である。
配列番号：１７は、オリゴヌクレオチド・プライマー「M」である。
配列番号：１８は、pMYC2224において毒素をコードするDNA配列を示す。
配列番号：１９は、pMYC2224によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２０は、pMYC2239において毒素をコードするDNA配列を示す。
配列番号：２１は、pMYC2239によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２２は、pMYC2244において毒素をコードするDNA配列を示すが、これはcryIF/cryIA（b）キメラ毒素をコードしている。
配列番号：２３は、pMYC2244によってコードされるcryIF/cryIA（b）キメラ毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２４は、pMYC2243において毒素をコードするDNA配列を示す。
配列番号：２５は、pMYC2243によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２６は、pMYC2523において毒素をコードするDNA配列を示すが、これはコドンを再加工したcryIF/cryIA（b）キメラ毒素をコードしている。
配列番号：２７は、pMYC2523によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：２８は、pMYC2254において毒素をコードするDNA配列を示すが、これはcryIF/436キメラ毒素をコードしている。
配列番号：２９は、pMYC2254によってコードされる毒素の推定アミノ酸配列を示す。
配列番号：３０は、cryI毒素に特徴的な配列である。この配列は、配列番号：23の601残基目で終わっている。
配列番号：３１は、配列番号：２３におけるアミノ酸1043の前の８個のアミノ酸である。
配列番号：３２は、天然のcryIF/cryIA（b）毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３３は、天然のcryIA（b）毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３４は、cryIA（c）/cryIA（b）毒素のアミノ酸配列を示す。
発明の詳細な開示
本発明は、CryIFキメラ毒素とCryIA（c）キメラ毒素とを組み合わせることによってもたらされる予想外に増強した殺虫活性に関する。この組み合わせは、鱗翅目害虫に対する活性を驚くほど上昇させた。この２つのキメラ毒素を産生する菌株を組み合わせた調製物を、本発明を実施するために用いることができる。B.t.遺伝子で形質転換したシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluoresence）の細胞を、本発明の毒素の供給源の一つとして用いることができる。例えば、CryIF/CryIA（b）毒素をコードする遺伝子を含む、ラクトースで誘導できるシュードモナス・フルオレセンス（P.fluoresence）系統と、CryIA（c）/CryIA（b）キメラ毒素をコードする遺伝子を含むシュードモナス・フルオレセンス（P.fluoresence）MR436とを、本発明を実施するために用いることができる。これら２つのシュードモナス菌株は、殺虫活性の効果的な強化を示すよう、物理的に混合して組み合わせることができる。単一の宿主が有利な効果をもたらす２つの毒素を産生するよう、適当な宿主を形質転換するために、本発明に係る毒素をコードしている遺伝子を用いることができる。
本発明により有用となるプラスミドを有するバクテリアは以下の通りである。
本発明による、２つのキメラ毒素を含む製剤は、製剤を施用するに当たって、必要な全蛋白質含量が少量であるため、これを使用する者にとっては非常に経済的である。単独の毒素に対しては弱い感受性しか示さない昆虫ほど、本発明の毒素を組み合わせることによって一層強い影響を受け、２つの毒素を含む製剤の効き目は、一つの毒素しか含まない製剤の効き目より強くなる。さらに、害虫は、２つの毒素を含む製剤に対しては単独の毒素を含む製剤に対してよりも、すぐに耐性を生ずる可能性が低い。
本発明で説明する毒素の組み合わせは、鱗翅目害虫を制御するために用いることができる。成虫の鱗翅目類、すなわち、チョウ及びガは、主に花蜜を餌とし、授粉の重要な媒介者である。その幼虫、すなわち、イモムシはほとんどが植物体を餌にし、その多くが深刻な害虫である。イモムシは、茎葉の上または内部、植物の根または茎の上を食害し、植物から栄養を奪い、しばしば植物の物理的支持構造を破壊する。さらに、イモムシは、果実、組織、ならびに貯蔵した穀粒及び穀粉を食害し、これらの販売用産物を害したり、それらの価値を大いに低下させる。本明細書で用いられるとき、鱗翅目害虫というのは、幼虫の段階を含むこの害虫のさまざまな発育段階を指す。
本発明のキメラ毒素は、B.t.毒素のN末端の全コア毒素部分を含み、この蛋白質は、毒素部分の終点を越えたある部位で、異種のプロ毒素配列に移行する。本明細書において、B.t.毒素のN末毒素部分は「コア」毒素という。毒素/プロ毒素接続部位付近で異種のプロ毒素分節への移行が起こるようにしてもよく、または異種プロ毒素への移行をもっと下流で起こすようにして天然のプロ毒素の一部（毒素部分を越えて延びる部位）を維持してもよい。例として、本発明のキメラ毒素の一つは、cryIFの全毒素部分（アミノ酸1〜601）、および異種のプロ毒素（アミノ酸602からC末端まで）をもつ。好ましい態様において、プロ毒素の異種部分は、cryIA（b）または436毒素に由来する。
当業者は、B.t.毒素の、毒素部分からプロ毒素部分へ移行するまでの長さや正確な位置は、たとえcryIFなどの一定のクラス内においても、ある程度は異なっていることを認識するであろう。典型的には、cryIA（b）毒素およびcryIF毒素は、およそ1150アミノ酸から1200アミノ酸の長さである。毒素部分からプロ毒素部分への移行は、典型的には、毒素全長の約50％から60％の間で起こる。本発明のキメラ毒素は、このN末端側のコア毒素部分の全範囲を含む。したがって、キメラ毒素は、全長cryIF B.t.毒素の少なくとも約50％を含む。これは、典型的には少なくとも約590アミノ酸である。プロ毒素部分に関しては、cryIA（b）プロ毒素部分の全範囲が、毒素部分の終わりから分子のC末端まで延びている。この部位の終わりの約100から150アミノ酸を、本発明のキメラ毒素に含ませることが最も重要である。本明細書において特に例示されたキメラ毒素において、cryIA（b）分子の、少なくともアミノ酸の1043（配列番号23）からC末端までが利用されている。配列番号：23のアミノ酸1043の前には、配列Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys（配列番号：31）がある。このアミノ酸配列は、キメラ毒素において、その配列の先に異種生物に由来するアミノ酸が必ず続いている分子の、プロ毒素部分の位置を示す指標となる。別の実施例では、配列番号：31として示されているペプチドが、アミノ酸1061から1068にある。この場合、1069からC末までのアミノ酸は、好ましくは異種性のものである（配列番号：29）。配列番号：31に示されているペプチドが、図９の1061から1068の位置に見ることができる。したがって、本発明に係るキメラ毒素において、異種生物由来のDNAを含むのは（cryIF毒素のコアN末部分に比較すると）、B.t.蛋白質全体の、少なくとも最後の、およそ５から10％である。本明細書に含まれる特異的な実施例においては、640番目のアミノ酸からC末端までが異種性のプロ毒素配列である。
このように、本発明の好ましい態様は、長さ約1150から約1200アミノ酸のキメラB.t.毒素であって、cryIF分子全長の少なくとも約50％から60％のcryIFコア毒素のN末部分を含むが、この分子全長の約90％から95％以上は含まないキメラ毒素である。キメラ毒素は、さらに、cryIA（b）または436分子の少なくとも約5％から10％を含む、cryIA（b）または436プロ毒素のC末端部分を含む。したがって、cryIFからcryIA（b）または436配列への移行は、分子全体の約50％から約95％の間のプロ毒素部分で起こる（または、毒素とプロ毒素の結合部分で起きる）。本明細書で提供される特異的な実施例において、cryIF配列から異種生物由来のプロ毒素配列への移行は、配列番号：31に示されているペプチド配列の末端の手前で起こる。
本発明の特別な態様は、図9のキメラ毒素である。本明細書において提供された開示によって利益を受ける当業者が、別の構築物を作成し、使用すると考えられる。cryI蛋白質のコア毒素分節は特徴的な末端の配列、Val/Leu Tyr/Ile Ile Asp Arg/Lys Ile/Phe Glu Ile/Phe/Leu Ile/Leu/Val Pro/Leu Ala/Val Glu/Thr/Asp（配列番号30）をもち、配列番号23の601番目の残基で終わる。さらに、cryI毒素のプロ毒素分節（601残基目以降）は、毒素分節よりも配列類似性が高い。この配列類似性によって、当業者は、cryIF配列とcryIA（b）または436配列との間でキメラ蛋白質を作るために、プロ毒素分節の移行部位を容易に判定することができる。CryI遺伝子の部分的な蛋白質分解に関するデータを調べると、cryIプロ毒素の保存的配列、図9の1061〜1068位の後部に、異種の、保存性が低いアミノ酸領域が見られる。
したがって、本発明のキメラ毒素は、全cryIF毒素と、毒素分節（上記で定義されている）の終わりと配列番号31のペプチド配列末端部との間のいかなる部位に、対応するcryIA（b）または436配列に移行するcryIFプロ毒素の一部を含んでいてもよい。好ましくは、キメラ毒素のC末アミノ酸配列は、cryIA（b）配列、または436遺伝子由来の配列、またはこれらの配列の１つと同等な配列を含む。
CryIF毒素およびこれらの毒素をコードする遺伝子は、当業者によく知られている。CryIF遺伝子および毒素は、例えば「Chambers et al.,（1991）J.Bacteriol.173:3966」で説明されている。cryIA（b）遺伝子および毒素は、例えば「Hoefte et al.（1986）Eur.J.Biochem.161:273」、「Geiser et al.（1986）Gene 48:109」、および「Haider et al.（1988）Nucleic Acids Res.16:10927」で説明されている。本明細書に包含される開示の利益を受ける当業者は、cryIF分子のN末端毒素部分およびcryIA（b）毒素のC末端側プロ毒素部分をコードするDNAを容易に同定し用いることができると考えられる。
図9は、本発明の毒素において用いられうるアミノ酸置換の例を提供している。毒素の活性を変えることなく、さまざまな突然変異を毒素の配列中に作出することができることも当業者によく知られている。さらに、遺伝子コードの縮退により、一つの毒素をコードするさまざまなDNA配列を用いることもできる。当業者は、本発明にしたがって、このような代替的なDNAおよびアミノ酸配列を用いることができる。
本発明のプロ毒素置換技術は、毒素の発現を増強するため、他の種類のB.t.内毒素を用いることができる。この技術は、配列番号30に示された特徴的な配列を有する、他のB.t.毒素に対して最も応用性が高いと考えられる。
図１〜８のフローチャートは、本発明にしたがって実施できるベクター構築の一般的な概観である。スプライス・オーバーラップ伸長反応（SOE）というPCR技術を用いた突然変異誘発によって（Horton,R.M.,H.D.Hunt,S.N.Ho,J.K.Pullen,L.R.Pease（1989）Gene77:61-68）、BamHIおよびPvuIクローニング部位をcryIA（c）/cryIA（b）キメラ毒素遺伝子に導入して、プラスミドpMYC2224を作成した。pMYC1260などのcryIFを含むプラスミドから採ったcryIF遺伝子の領域をPCRによって作成して、pMYC2224のcryIA（c）/cryIA（b）遺伝子のBamHI-PvuI断片と置き換えることができる。本発明者が設計した新しいプラスミドpMYC2239は、毒素/プロ毒素分節の接続部位にcryIFが続くcryIA（c）の短い分節を含んでいた。したがって、このときのプロ毒素部分は、cryIA（b）（pMYC1050）に由来するものであった。pMYC2239のApaI断片を、cryIFクローン（pMYC2047）に由来するApaI断片で置き換えた。これによってできたクローン（pMYC2244）は、開始メチオニンから毒素/プロ毒素部分の結合部まではcryIFから成り、コーディング領域の末端まではcryIA（b）から成っていた。一定の領域にサイレントなコドン変異を導入するため、SOEによってクローンpMYC2243を構築した。クローンpMYC2523を得るため、サイレントなコドン変異を含むpMYC2243のApaI断片で、pMYC2244のApaI断片を置換した。このキメラpMYC2523は、pMYC2243よりも発現の向上を示すが、変更を加えていないcryIF蛋白質配列を含んでいる。
PvuI-BstEII蛋白質の一部を含む、pMYC2523の断片を、cryIA（c）/cryIA（b）遺伝子を含むプラスミドからPCRによって作成した同等の断片で置き換えることによって、cryIF/436キメラを組み立てることができる。このような遺伝子の一つが436遺伝子である（例えば、pMYC467で、米国特許第5,005,294号と第5,169,760号で開示されている）。この構築物はまた、天然のcryIF蛋白質の配列に較べて、発現の向上をもたらす。
遺伝子および毒素 本発明による有用な遺伝子および毒素には、開示された全長配列だけでなく、本明細書において特に例示された毒素の殺虫活性特性を保持しているこれらの配列の断片、異型、変異体、および融合タンパク質も含まれる。本明細書において用いられるように、遺伝子の「異型」または「変異」という語は、同じ毒素をコードするヌクレオチド配列、または同等の殺虫活性をもつ毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において用いられるように「等価的毒素」という語は、標的害虫に対して、請求の範囲の毒素と同じか、または本質的に同じ生物学的活性をもつ毒素を意味する。
いくつかの方法を用いて、活性毒素をコードする遺伝子を同定し得ることができることは、当業者に明らかであろう。特異的遺伝子または本明細書において例示される遺伝子の一部は、上記の培養細胞寄託機関に寄託されている単離物から得てもよい。また、これらの遺伝子、またはその一部もしくは変異体を、例えば遺伝子合成機を用いて合成して作成することもできる。遺伝子の変異体は、点突然変異を作出する標準的な技術を用いて、容易に構築することができる。また、標準的な手順にしたがって、市販のエクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて、これらの遺伝子の断片を作成することもできる。例えば、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを規則正しく切り出すBal31のような酵素又は部位特異的突然変異誘発を用いることができる。また、さまざまな制限酵素を用いて、活性断片をコードする遺伝子を得ることもできる。これらの毒素の活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いてもよい。
例示された毒素の殺虫活性を保持している断片および等価物も、本発明の範囲内にある。また、遺伝子コードの縮重のため、さまざまな異なるDNA配列が、本明細書に開示されたアミノ酸配列をコードすることができる。同じ毒素、または本質的に同じ毒素をコードする代替DNA配列を作成することは、当業者の技術の範囲内に当然含まれる。これらの変異DNA配列は、本発明の範囲内にある。本明細書において用いられるように「本質的に同じ」配列という語は、アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を有する、殺虫活性に実質的に影響しない配列を意味する。殺虫活性を保持している断片もまた、この定義に含まれる。
本発明による有用な毒素および遺伝子部分をさらに同定するための、さらに別の方法は、オリゴヌクレオチド・プローブを用いることによる。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適当な標識によって検出可能にすることができ、また、国際出願WO93/16094号で開示されているように、最初から蛍光を発するようにしてもよい。当業者にはよく知られているように、プローブ分子および核酸試料が、二分子間で強い結合を形成することによりハイブリダイズすれば、プローブおよび試料は実質的に相同であるということが合理的に推定できる。好ましくは、例えば「Keller,G.H.,M.M.Manak（1987）DNA Probes,Stockton Press,New York,NY.,pp.169-170」で述べられているような、当技術分野において公知の技術によって、厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行なう。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起きたか否かを既知の条件で判定するための方法を提供する。このようなプローブ解析は、本発明による毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチド分節は、DNA合成機を用いて、標準的な手順で合成することができる。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして用いることもできる。
本発明の一定の毒素が、本明細書において特に例示されてきた。これらの毒素は単に本発明毒素の模範例であるため、本発明が、例示されている毒素と同じか、または類似した殺虫活性をもつ変異体毒素または等価的毒素（および等価的毒素をコードするヌクレオチド配列）を含むことは、いうまでもなく明らかであろう。等価的毒素には、例示されている毒素に対するアミノ酸相同性があると考えられる。このアミノ酸相同性は、典型的には75％を超え、好ましくは90％を超え、最も好ましくは95％を超える。生物学的活性の原因となるか、または最終的に生物学的活性に関係する三次元構造の決定に関与する、重要な毒素領域で、アミノ酸の相同性が最も高い。この点に関して、活性に対して重要ではない領域にあるか、分子の三次元構造に影響しないような保存的アミノ酸の置換である場合には、そのようなアミノ酸置換は受容され、期待される。例えば、アミノ酸は、次のように分類できよう。すなわち、非極性、非荷電性、塩基性、および酸性である。同じ分類の中の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、置換によって化合物の生物学的活性が実質的に変化しない限り、本発明の範囲に含まれる。表１に、それぞれの分類に属するアミノ酸の例を列挙する。
組み換え宿主 本発明の毒素をコードする遺伝子は、広い範囲の微生物または植物の宿主に導入することができる。毒素遺伝子を発現させると、殺虫性の毒素が、直接的または間接的に細胞内に産生され、維持される。本発明に係る両方の毒素を発現するB.t.菌株を作出するために、接合による遺伝子導入と組み換えによる遺伝子導入とを利用することができる。また、他の宿主生物を、協働作用的効果を起こさせるために用いられた毒素遺伝子の一方または双方で形質転換してもよい。例えば、シュードモナス菌などの適当な微生物宿主を用いて、該微生物を害虫のいる場所に適用し、そこで増殖させ、摂取させることができる。その結果、害虫を抑制できる。または、毒素遺伝子を宿している微生物を、毒素活性を持続させながら、細胞を安定させる条件の下で処理することができる。処理された細胞は、毒素活性を保持しており、それから標的害虫の環境へと適用することができる。
B.t.毒素遺伝子を適当なベクターによって微生物宿主に導入し、該宿主を生きたままの状態で環境中に適用する際には、一定の宿主微生物を用いることが重要である。一つまたは複数の目的の作物の「植物圏（phytosphere）」（葉面、葉圏、根圏および/または根面）に居住することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物および他の昆虫の生育場所）の中で、野生型の微生物とうまく競合でき、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定した維持と発現を提供し、そして好ましくは、周囲の環境の作用による分解および不活化から殺虫剤をよりよく保護できるように選択される。
多数の微生物が、さまざまな重要作物の葉表面（植物の葉の表面）および/または根圏（植物の根の回りの土）に生息していることが知られている。これらの微生物には、細菌、藻類、および菌類が含まれる。特に興味深い微生物は、例えば、細菌では、シュードモナス（Pseudomomas）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、メチロフィリウス（Methylophilius）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アグロバクター（Agrobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、およびアルカリジェネス（Alcaligenes）属、また菌類では、特に酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、およびオウレオバシディウム（Aureobasidium）属である。特に興味深い植物居住性細菌の種は、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas Syringae）、シュードモナス・フローレセンス（Pseudomonas Fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオチ（Rhizobium melioti）、アルカリジェネス・エントロファス（Alcaligenes entrophus）、およびアゾトバクター・ビンランディ（Azotobacter vinlandii）であり、植物居住性酵母の種は、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、R.グルチニス（R. glutinis）、R.マリナ（R. marina）、R.アウランチアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、C.ディフルエンス（C. diffluens）、C.ラウレンティ（C. laurentii）、サッカロミセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、S.プレトリエンシス（S. pretoriensis）、S.セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロミセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、S.オドラス（S. odorus）、クルイベロミセス・ベロネ（Kluyveromyces veronae）、およびアウレオバシディウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）である。特に重要なのは、色素性細菌である。
遺伝子の維持および発現を安定させる条件の下で、毒素をコードするB.t.遺伝子を、微生物の宿主の中に導入するために、さまざまな方法が利用できる。これらの方法は、当業者によく知られており、例えば、米国特許第5,135,867号に開示されており、これは本明細書に参照として包含される。
細胞の処理 毒素活性の持続期間を延ばし、細胞を安定化させるために、B.t.毒素を発現するバチラス・チューリンギエンシス又は組み換え細胞を処理することができる。生成される殺虫剤の微小カプセルは、細胞構造内にB.t.毒素又は毒素群を含む。細胞構造は、安定化され、微小カプセルが標的害虫の環境に適用された際に毒素を保護する。適当な宿主細胞には、原核生物も真核生物も含まれるが、通常、哺乳類などの高等生物に毒性がある物質を産生しない細胞に限定される。しかし、毒性物質が不安定であるか、または適用されるレベルが非常に低いため哺乳類宿主に対して毒性をもつ可能性がないときには、高等生物に毒性がある物質を産生する生物が用いられることもある。宿主として特に重要なのは、原核生物、および菌類などの下等真核生物である。
処理を行うとき、場合によっては胞子が用いられることもあるが、通常は胞子状態ではなく、完全な状態の実質的に増殖できる形態にある細胞が用いられる。
例えば、B.t.毒素遺伝子又は遺伝子群を含む微生物など、微生物細胞の処理は、毒素の性質を損なうような効果を与えたり、毒素を保護する細胞の能力を失わせたりしない限り、化学的方法、物理的方法、または、化学的および/または物理的方法を組み合わせた方法により行うことができる。化学薬品の例は、ハロゲン化試薬で、特に原子番号17〜80のハロゲンである。より特定すると、ヨウ素を用いて、穏やかな条件の下で十分な時間をかければ、所望の結果を得ることができる。他の適当な技術には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、塩化ゼフィラン、塩化セルピリジニウムなどの抗感染薬、イソプロピルおよびエタノールなどのアルコール類、ルゴールヨウ素、ブワン固定液、さまざまな酸、ヘリー固定液（Helly's fixatives）などの組織固定剤（Humason,Gretchen L.,動物組織技術（Animal Tissue Techniques）、W.H.Freeman and Company,1967）、または細胞を宿主の環境に与えたとき、細胞で産生される毒素の活性を保護し活性期間を引き延ばす、物理的（熱による）薬剤と化学的薬剤との組み合わせなどがある。物理的方法の例としては、ガンマ線照射およびX線照射などの短波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥などがある。微生物細胞の処理に関する方法は、米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されており、これらは、本明細書に参照として包含される。
細胞は、通常、環境条件に対する抵抗性を増すように、構造的な安定性を強化できる。殺虫剤は前駆体で存在しているため、細胞処理方法は、標的病原害虫によって前駆体をプロセシングして、成熟した殺虫剤の形態になるのを阻害しないようなものを選択すべきである。例えば、ホルムアルデヒドは、蛋白質を架橋させてしまうために、ポリペプチド殺虫剤前駆体のプロセシングを阻害する可能性がある。処理方法は、少なくとも毒素の生物学的利用能または生物活性の実質的な部位を保持するものでなければならない。
産生目的で宿主を選択するに当たって、特に重要な特性には、宿主へのB.t.遺伝子又は遺伝子群導入の容易さ、発現系の利用可能性、発現効率、宿主中での殺虫剤の安定性、および補助的な遺伝的因子の存在が含まれる。殺虫用微小カプセルとして用いられるための重要な特性には、厚い細胞壁、色素形成、細胞内パッケージングまたは封入体形成などの殺虫剤を保護する特質、水中環境でも生存すること、哺乳類に対する毒性がないこと、害虫が摂食に誘引されること、毒素を損なうことなく殺菌しやすく固定しやすいことなどが含まれる。他の考慮すべき事項には、処方および取り扱いの容易性、経済性、貯蔵安定性などが含まれる。
細胞の増殖 B.t.殺虫遺伝子又は遺伝子群を含む細胞性宿主は、B.t.遺伝子をもつ細胞のすべて、または実質的にすべてを選択できるような選択培地を提供して、DNA構造物が選択において優位性をもつような都合のよい栄養培地中で増殖させてもよい。次に、これらの細胞を従来からの方法に従って回収する。または、回収前に細胞を処理してもよい。
標準的な人工培地と発酵技術とを用いて、本発明に係る毒素を産生するB.t.細胞を培養することができる。発酵サイクルが終わったところで、当業において周知の方法によって、発酵培地からB.t.胞子及び結晶を最初に分離することによって菌体を回収することができる。回収されたB.t.胞子及び結晶は、取り扱いと特定の標的害虫への施用を容易にするために、界面活性剤や分散剤、不活性の担体、及びその他の成分を加えて、可溶性粉末、濃縮液、顆粒、またはその他の製剤に処方することができる。これらの処方及び施用手順は、当業においてよく知られている。
処方 誘因物質、胞子、結晶物、およびB.t.単離物の毒素、又は本明細書に開示されたB.t.単離物から得られる遺伝子を含んだ組み換え微生物を含む処方された餌用の顆粒は土に撒くことができる。処方した産物は、種子の被覆または根の処理剤として利用することもでき、また、作物の生活史のもっと後の段階で全植物体を処理するときに用いることもできる。B.t.細胞の植物および土壌処理剤は、無機質（葉珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）または植物性物質（粉末にしたトウモロコシの穂軸、イネの籾殻、クルミの殻など）などのさまざまな不活性物質と混ぜて、可溶性の粉末、顆粒、または粉剤の形で用いられる。この処方剤には、展着増強剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤、または界面活性剤が含まれていてもよい。液体処方薬は、水性でも非水性でもよく、泡状、ゲル状、懸濁液、乳化濃縮液などの形で用いられる。成分には、流動剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤、またはポリマーが含まれていてもよい。
当業者にはよく認識されているように、殺虫効果をもつ濃度は、それぞれの処方の性質によって大きく異なり、特に、濃縮して用いるか、直接用いるかによって異なる。殺虫剤は、重量にして1％以上であるが、重量にして100％のこともある。乾燥処方剤では、殺虫剤が重量にして約1〜95％あるが、液体処方剤では、一般的に、水相中の固体の重量で約1〜60％である。処方剤は、一般的に、約102から約104細胞数/mgである。これらの処方剤を、１ヘクタール当たり約50mg（液体か乾燥重で）から１kg以上散布する。
処方剤は、例えば、土壌および葉などの鱗翅目の害虫のいる環境に、噴霧や粉末散布、散水などによって散布することができる。
材料および方法
電気溶出したDNAの精製には、NACS（ベセスダ研究所（Bethesda Research Labs）、メリーランド州ゲティスバーグ）カラムクロマトグラフィーを用いた。精製は、結合緩衝液を0.5XTBE/0.2 M NaClに、溶出緩衝液を0.5XTBE/2.0 M NaClに修正した点を除いては、製造業者の指示に従って行なった。
DNAのα-［32P］dATPによるランダムプライマー標識は、製造業者の指示に従って、キット（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochemicals）、インディアナ州インディアナポリス）を用いて行なった。
ゲル精製とは、選択したDNA断片について、アガロース-TBEゲル電気泳動、電気溶出、およびNACSカラムクロマトグラフィーを連続して行うことを云い、これらの方法は当業者に周知のものである。
DNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅は、パーキン-エルマー社（コネティカット州ノーウォーク）のサーマルサイクラーで、以下のサイクル変数に従って25サイクル行なった。すなわち、94℃で1分間、37℃で2分間、72℃で3分間（72℃のサイクルのときは、それぞれ5秒間の伸長時間を設ける）である。PCR産物は、クローニング効率を上げるためにプロテアーゼKで処理した（Crowe,J.S.,Cooper,H.J.,Smith,M.A.,Sims,M.J.,Parker,D.,Gewert,D.（1991）Nucl.Acids Res.19:184）。
オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）を、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスター・シティー）のモデル381A DNA合成機で合成した。必要に応じて、製造業者の指示に従ってネンソーブ（Nensorb）カラム（ニューイングランドヌクレア-デュポン社（New England Nuclear-Dupont）、デラウエア州ウィルミントン）で精製を行なった。
回転培養器上、30℃のL-培地（LB）で増殖した対数増殖期の細胞を用いて、シュードモナス・フルオレセンスのエレクトロポレーションを行なった。氷冷した滅菌蒸留水で細胞を２、３回洗浄して、蒸留水で最初の容量の0.03倍に濃縮した。1〜20μlのDNAを、50〜300μlの細胞と混ぜた。バイオラド・ジーンパルサー（Biorad Gene Pulser）（バイオラド社、カリフォルニア州リッチモンド）用に選択したパラメータは、0.2cmの電極の間隔のキュベットで、200オーム、25マイクロファラッド、2.25キロボルトであった。エレクトロポレーション後、１ミリリットルのLBを加えて、細胞を２分間以上氷上に置いた。次に、細胞を２時間から一晩、30℃で静置した。
シュードモナス・フルオレセンスにおけるB.t.毒素の発現は、「一般微生物学の方法の手引き（Manual of Methods for General Bacteriology）、P.Gerhardt、1981年、米国微生物学会（American Society for Microbacteriology）、ワシントンD.C.」に記載されている推奨培地で行われた。グルコースの代わりにグリセロールを用いた。水道水で調合し、pHは7.2に調整した。接種用培養液はL培地で調製した。以下の調合を用いた：
基本培地（１リットル当たり）
グリセロール 65 g
（NH4）2SO4 1.0 g
Na2HPO4 5.24 g
KH2PO4 2.77 g
酵母抽出物 5.0 g
カザミノ酸 1.0 g
金属元素44（100 ml当たり）
EDTA 250 mg
ZnSO4-7H2O 1095 mg
FeSO4-7H2O 500 mg
MnSO4-H2O 154 mg
CuSO4-5H2O 39.2 mg
Co（NO3）2-6H2O 24.8 mg
Na2B4O7-10H2O 17.7 mg
沈澱が生じるのを防ぐため、6N H2SO4を数滴加える。
ハンターの無機物混合液（１リットル当たり）
ニトリロ酢酸（KOHで溶解中和したもの） 10 g
MgSO4-7H2O 14.45 g
CaCl2-2H2O 3.33 g
（NH4）6Mo7O24-4H2O 9.25 g
FeSO4-7H2O 99 mg
金属元素44 50 ml
pHを6.6〜6.8に調整する。
B.t.毒素の発現を解析するための接種を行う際、培地200 ml当たり４mlのハンター無機物混合液を加えた。そして、容量にして、フラスコ当たり2％の、一晩培養した接種物を加えた。培養液は、32℃、200 rpm以上で24時間増殖させた。この時点で、培養液に0.75 mM IPTGで発現誘導をかけ、２gの酵母抽出物を補充した。48時間後と72時間後に採取したサンプルを蛋白質用ゲル電気泳動した。レーザー濃度計によって130 kDaの蛋白質を定量した。
以下は、本発明を実施するための最良の形態を含む実験方法を例示した実施例である。これらの実施例は、本発明を制限するものではない。別記されない限り、すべてのパーセントは重量比であり、溶液の割合は容量比である。
実施例１−スプライスオーバーラップ伸長（SOE）による発現ベクターの改変
クローニングベクターを、RSF1010（pTJS260は、U.C.サンディエゴ校のドナルド・ヘリンスキー博士（Dr. Donald Helinski）から入手可能）由来の、広範な宿主域を有するpTJS260を基本として構築することができる。ベクター構築に用いられる系の例は、EPO特許出願0 471 564の中に見られる。本明細書において436遺伝子と呼ばれるcryIA（c）/cryIA（b）遺伝子と毒素は、米国特許第5,055,294号に開示されている。設計されたプラスミドpMYC1050は、436遺伝子を含む。pMYC1050は、毒素遺伝子およびpM3,130-7（米国特許第5,055,294号に開示されている）を、当技術分野において周知の方法によって、pMYC467（米国特許第5,169,760号で開示されている）などのpTJS260から作ったベクターに再クローニングして構築された。特に、pM3,130-7プロモーターおよび毒素遺伝子をBamHI-NdeI断片として得て、この断片を同じ部位（12100塩基目付近のBamHIと8000塩基目付近のNdeI）に結合した断片と入れ換えて、pMYC467プラスミドの中に入れることができる。
改良ベクターは、理想的には1個だけBamHIクローニング部位をもつ。プラスミドのBamHI部位はtacプロモーター（ptac）の上流にあるが、クレノウ酵素で平滑末端化し、ライゲーションし直すことによって除去することができる（図１）。この部位がなくなったことを、制限酵素消化によって確認した。この手順に従って作出したプラスミドをpMYC1050△BamHIと呼ぶ。構築物には、SOE突然変異誘発によって、BamHI部位をプラスミドに付け加える。SOE突然変異誘発は、毒素を含むNsiIで切断したDNA断片を、選抜マーカーとしてアンピシリン耐性（bla）遺伝子をもつ、より小さなベクターpGEM5（Promega Corp., Madison, WI）中にサブクローニングすることによって利用できる（図１）。断片は制限酵素消化によって方向性を決定することができる。このような処理によって作成されたプラスミドをpGEMtoxと名付けた。
毒素をコードする領域のDNAに、PCRを介在させたSOE技術によって、図２に示したような制限酵素クローニング部位を導入するための突然変異を起こさせた。プライマーとして用いられたオリゴヌクレオチドを下に示す。
新しい制限酵素部位をもつDNA断片ADまたはEGを、いくつかのサブクローニング法によって毒素を含むDNAの中に取り込んだ（図２および３）。pGEMtoxをClaIまたはHindIIIで制限酵素消化した。ベクターを含むDNAをゲル精製した。断片ADをClaI消化して、ClaI消化したpGEMtoxベクターDNAとライゲーションした。断片EGをHindIIIで制限酵素消化して、HindIII消化したpGEMtoxベクターDNAにライゲーションした。ライゲーション混合液で大腸菌株NM522を形質転換した。単離されたコロニー由来のプラスミドDNAを制限酵素消化して、正しく構築された構築物を同定した。新しいBamHI部位をもつプラスミドをpGEMtoxBamHIと名付けた。新しいPvuI部位をもつプラスミドをpGEMtoxPvuIと名付けた。プラスミドpGEMtox BamHI由来のBamHI部位をもつClaI断片を、pGEMtox PvuI由来のClaI部位で切断したベクターを含む断片をフォスファターゼ処理したものとライゲーションした。ライゲーション混合液で大腸菌株NM522を形質転換した。プライマーセットC/DによるPCR解析および制限酵素消化によって、正しく構築された構築物を同定した。新しい制限酵素部位をもつプラスミドをpGEMtox BamHI/PvuIと名付けた。
pGEMtox BamHI/PvuI由来の挿入配列とpMYC1050△BamHI由来のベクターを構築して発現ベクターを完成した（図３および４）。ゲル精製した挿入配列を、（混入したベクターを除去するため）NsiI消化およびScaI消化して、pGEMtox BamHI /PvuIから調製した。これを、NsiIで消化したベクターを含むpMYC1050△BamHI DNAをゲル精製したものにライゲーションした。ライゲーション混合液で大腸菌株NM522を形質転換し、形質転換混合液を、テトラサイクリンを12μg/mlの濃度で含むLB寒天培地に塗布した。NsiI挿入配列を含むコロニーを、コロニーハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィーによって同定した。NsiIクローニング部位の両側に位置するプライマーセットA/Dを用いて、PCRによって挿入配列の方向を決め、アガロース-TBEゲル電気泳動をした。正しく構築されたプラスミドをpMYC2224と名付けた。毒素のDNAおよびタンパク質配列をそれぞれ配列番号18および19に示す。ラクトースで誘導できるP.フローレセンス（P.fluorescens）の菌株に正しく構築されたプラスミドをエレクトロポレーションした。形質転換混合液を、テトラサイクリンを20μg/mlの濃度で含むLB寒天培地に塗布した。次のクローニング実験に用いるために、P.フローレセンス（P.fluorescens）からプラスミドDNAを調製した。
実施例２−pMYC2224へのcryIF超可変領域のサブクローニング
cryIF（pMYC1260）の超可変領域を含むDNA断片を、pMYC2224のBamHI-PvuI毒素部分を含むDNA断片と交換した（図４）。コーディング領域には以前からBamHI部位が存在しているため、BglIIをクローニングのために選択した。BamHI及びBglIIの突出配列の４塩基が一致するため、制限酵素部位は結合部分から失われるが、ライゲーションをすることができる。PCR用に新しいプライマーを合成しなければならなかった。
実施例３−シュードモナス・フルオレセンス（P. fluorescens）発現プラスミドpMYC1260及びpMYC2047の構築
シュードモナス・フルオレセンスで発現させるために、以下のように、クローン化した毒素遺伝子cryIFを改変することができる。
１．pKK223-3（ファルマシア大腸菌ベクター）から採ったPtacプロモーターとrrnBターミネーターとを含むBamHI-ScaI断片を、pMYC1197のBamHIと平滑化KpnIベクター断片の中にライゲーションして（欧州特許第0 417 564号に記載される）、pTJS260に由来するベクター（ドナルド・ヘリンスキー博士、カリフォルニア大学サンディエゴ（Donald Helinski,U.C.San Diego））の中にpKK223-3 rrnBターミネーター配列を含むプラスミドを作製することができる。組み立てられたベクターは、大腸菌を形質転換し、テトラサイクリン選抜下で増殖させた後回収した。
２．pMYC1603（NRRL B-18517より）からの、毒素遺伝子を含む約3800 bpのNdeI-Nde-I断片（DNAポリメラーゼ及びdNTPを用いて末端を平滑化したもの）を、pKK223-3のEcoRI及びHindIII部位を平滑化した部位にライゲーションして、PtacがプロモーターとなっているcryIF毒素部分をもつプラスミドを作製することができる。PtacをプロモーターとするcryIF毒素遺伝子を含むプラスミドは、大腸菌を形質転換させ、アンピシリン選抜下で増殖させ、当業において周知の技術により、Ptacプロモーターからの発現にとって適当な方向のインサートを有するプラスミドをスクリーニングした後回収できる。
３．PtacをプロモーターとするcryIF毒素を、プラスミドpTJS260から得たBamHI及びApaI末端を有する2.4 kbのDNA断片と、上記のステップ１のプラスミドの複製開始点を含む、ApaIからHindIIIまでの8.5 kbの断片、ならびに、上記のステップ２の、Ptacプロモーター及びcryIF毒素遺伝子を含むHindIIIと部分消化されたBamHIの断片を用いた、３つの断片のライゲーションを行なってpTJS260由来のベクターの中に組み込むことができる。
この結果できたpTJS260由来の、cryIF毒素を発現するプラスミド（pMYC1260）を、エレクトロポレーションによってシュードモナス・フルオレセンス（P. fluorescens）に導入することができる。
４．プライマーH及びKを用いた、適当なcryIFを鋳型とするPCRの後、SpeI及びKpnIにより制限酵素消化し、ゲル精製して得たSpeIからKpnIまでの断片、ステップ３のプラスミドからの約10 kbのApaIからKpnIまでの断片、および、Ptacプロモーターを含むpMYC1197のApaIからSpeIまでの約2600 bpの断片をライゲーションすることによってpMYC2047を構築できる。シュードモナス・フルオレセンスをエレクトロポレーションした後、プラスミドを制限酵素消化して、適正なcryIF毒素発現プラスミドを判定した。
実施例４−cryIF/cryIA（b）キメラの構築
アミノ末端のcryIA（c）部分は、単純で簡単な交換によって、cryIFのコーディング配列によって置き換えることができる（図５）。tetAR座位もcryIFコーディング配列もApaI部位を有する。pMYC2047から、tetAR遺伝子の一部とcryIFのアミノ末端を含む短いApaI断片を単離し、pMYC2239からの大きなApaIベクターを含む断片をライゲーションすることができる。シュードモナス・フルオレセンスのラクトースで誘導できる菌株をライゲーション混合液でエレクトロポレーションし、テトラサイクリンを20μg/ml含むLB寒天培地で培養することができる。ラクトースで誘導できる菌株は、当業者に知られており、例えば、米国特許第5,169,760号に記載されている。ApaI断片が正しい方向に入れば、テトラサイクリン耐性が再構成される。この方法で作成されたクローンは、制限酵素消化によって大体正しいことが分かり、pMYC2244と名付けられた。毒素DNAの配列は配列番号：22に示されており、推定される蛋白質配列は配列番号：23に示されている。
実施例５−cryIFの限定されたコドン再改変物の構築
GenBank/EMBL配列ライブラリーの遺伝子を解析して判定したところ、シュードモナス属のコドン使用は、トリプレットコドンにゆらぎのある位置では、GまたはCが選択される。cryIF遺伝子の限られた領域に、ゆらぎの位置で選択されるようなサイレントなコドン変更をSOEを用いて加えた（図６）。用いたオリゴヌクレオチドを以下に示す：
実施例６−限定されたコドン改変を含むcryIF/cryIA（b）キメラの構築
上記のpMYC2244（cryIF/cryIA（b））と同じように、ApaI断片の交換手法を用いて構築物を組み立てた（図７）。毒素-tetAR座位ApaI DNAの小断片をpMYC2243からゲル精製した。大きい方の、ベクター-プロ毒素部分のApaI DNA断片を、pMYC2244からゲル精製した。完成したプラスミドはpMYC2523と名付けた。推定されるDNA配列及び蛋白質配列を、それぞれ配列番号：26及び配列番号：27に示す。
実施例７−pMYC2244及びpMYC2523からの毒素の発現比較
シュードモナス・フルオレセンス（P. fluorescens）における毒素発現を既述したようにして解析した。誘導後24時間と48時間で、pMYC2523を有する菌株は、pMYC2244を有する菌株よりも多量の毒素を産生した。シロイチモンジヨトウガの幼虫（Spodoptera exigua）に対する毒素の特異的な活性は、統計的には変化しなかった。
実施例８−限定されたコドン改変を含むcryIF/436キメラの構築
pMYC2523のcryIA（b）プロ毒素を436プロ毒素部分に置き換えて、第二の型のキメラ毒素を組み立てた（図８）。436プロ毒素配列は、本当のC末端を除いてはcryIA（c）配列から成る（米国特許第5,128,130号および第5,169,760号を参照。これらは全体として、本明細書において参照文献として包含される）。pMYC467（米国特許第5,169,760号）などのプラスミドを鋳型として用い、プライマーセットF/Mを用いたPCRによって、クローニングのためのプロ毒素DNAを作製した。
実施例９−pMYC2243及びpMYC2254からの毒素の発現比較
シュードモナス・フルオレセンスにおける毒素発現を既述したようにして解析した。pMYC2254からの毒素の発現は、pMYC2243の発現よりも増加していた。
実施例10−オオタバコガ（Heliothis zea）の幼虫に対する、CryIFキメラ毒素とCryIA（c）キメラ毒素との間の協働作用の解析
24匹のオオタバコガ（Heliothis zea）の一齢幼虫を、さまざまな濃度の毒素を含む寒天食餌の上に置いた。処理後７日目に、成長阻害を測定して等級に分けた。一齢から二齢への脱皮が阻害された場合、幼虫は成長阻害されたものとした。協働因子（SF）と予測活性（E［exp］）を推計する計算式は以下の通りである。
SF = E（obs）/E（exp）
ここで、
SF＝協働因子
E（obs）＝観察された死亡率
E（exp）＝予測される死亡率
E（exp） = a + b - （ab/100）
ここで、
a＝化合物Aによる活性
B＝化合物Bによる活性
Abbott,W.S.（1925）J.Economic Entomology 18:265〜267
実施例11−オオタバコガ（Heliothis zea）の幼虫に対する、CryIFキメラ毒素とCryIA（c）キメラ毒素との間の協働作用の解析
24匹のオオタバコガ（Heliothis zea）の一齢幼虫を、さまざまな濃度の毒素を含む寒天食餌の上に置いた。処理後７日目に、成長阻害を測定して等級に分けた。一齢から二齢への脱皮が阻害された場合、幼虫は成長阻害されたものとした。標準的なプロビット解析技法を用いて、集団の50パーセントを阻害するのに必要とされる用量（ED50）を判定した。協働因子（SF）と予測有効用量（ED［exp］）を推計する計算式は以下の通りである。
SF = ED（exp）/ED（obs）
ここで、
ED（exp）＝混合剤の予測有効用量
ED（obs）＝混合剤の観察有効用量
ED（exp） = （a＋b ）/ a/EDA＋b/EDB
ここで、
a＝混合剤における化合物Aの割合
b＝混合剤における化合物Bの割合
EDAおよびEDB＝混合剤において、AおよびBが等しい効果をもつ用量
本明細書で説明されている実施例及び態様は、例示のためにすぎないこと、それに基づくさまざまな修正または変更が当業者に示唆されており、これらも本出願の意図及び範囲ならびに添付の請求の範囲に含まれることと解されるべきである。
配列表
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：39塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：29塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：３：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：28塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：４：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：５：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：28塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：６：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：18塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：７：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：36塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：８：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：17塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：９：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：23塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１０：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：45塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１１：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：64塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１２：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：65塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１３：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：17塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１４：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１５：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：41塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１６：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：24塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸 合成DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１７：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3465塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：１８：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1155アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１９：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3450塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２０：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1150アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２１：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3444塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２２：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1148アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２３：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3522塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２４：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1174アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２５：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3444塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２６：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1148アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２７：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3522塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（xi）配列の記載：配列番号：２８：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1174アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２９：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：12アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３０：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：8アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３１：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1174アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３２：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1155アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３３：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1182アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３４：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1148アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３５：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1174アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３６：
Claims (10)
- CryIFコア毒素のN末端配列を590アミノ酸以上かつ1100アミノ酸以下含むCryIFコア毒素部位、およびB.t.毒素のプロ毒素のC末端配列を100アミノ酸以上含むプロ毒素部位を含むCryIFキメラ蛋白質、並びにCryIA（c）コア毒素のN末端配列を590アミノ酸以上含むCryIA（c）コア毒素部位、およびB.t.毒素のプロ毒素のC末端配列を100アミノ酸以上含むプロ毒素部位を含むCryIA（c）キメラ蛋白質、又はこれらの蛋白質を発現する細胞を含む、鱗翅目害虫を制御するための組成物。
- CryIFキメラ蛋白質を発現する細胞とCryIA（c）キメラ蛋白質を発現する細胞とを含む、請求項１記載の組成物。
- CryIFキメラ蛋白質と、CryIA（c）キメラ蛋白質とを発現する細胞を含む、請求項１記載の組成物。
- CryIFキメラ蛋白質が、1148から1200アミノ酸を有し、かつCryIA（b）またはCryIA（c）/CryIA（b）のプロ毒素のC末端配列を100アミノ酸以上含むプロ毒素部位を該蛋白質のC末端に含む、請求項１記載の組成物。
- CryIFコア毒素のN末端配列を590アミノ酸以上かつ1100アミノ酸以下含むCryIFコア毒素部位、およびB.t.毒素のプロ毒素のC末端配列を100アミノ酸以上含むプロ毒素部位を含むCryIFキメラ蛋白質、並びにCryIA（c）コア毒素のN末端配列を590アミノ酸以上含むCryIA（c）コア毒素部位、およびB.t.毒素のプロ毒素のC末端配列を100アミノ酸以上含むプロ毒素部位を含むCryIA（c）キメラ蛋白質の両方を発現するように形質転換された宿主。
- 宿主が微生物または植物の宿主である、請求項５に記載の宿主。
- 害虫または害虫がいる環境に対して、CryIFコア毒素のN末端配列を590アミノ酸以上かつ1100アミノ酸以下含むCryIFコア毒素部位、およびB.t.毒素のプロ毒素のC末端配列を100アミノ酸以上含むプロ毒素部位を含むCryIFキメラ蛋白質、並びにCryIF（c）コア毒素のN末端配列を590アミノ酸以上含むCryIA（c）コア毒素部位、およびB.t.毒素のプロ毒素のC末端配列を100アミノ酸以上含むプロ毒素部位を含むCryIA（c）キメラ蛋白質、又はこれらの蛋白質を産生する細胞を含む有効な用量の組成物を接触させることを含む、鱗翅目害虫を制御するための方法。
- 組成物が、CryIFキメラ蛋白質を発現する細胞とCryIA（c）キメラ蛋白質を発現する細胞とを含む、請求項７記載の方法。
- 組成物が、CryIFキメラ蛋白質とCryIA（c）キメラ蛋白質とを発現する細胞を含む、請求項７記載の方法。
- CryIFキメラ蛋白質が、1148から1200アミノ酸を有し、かつCryIA（b）またはCryIA（c）/CryIA（b）のプロ毒素のC末端配列を100アミノ酸以上含むプロ毒素部位を該蛋白質のC末端に含む、請求項７記載の方法。
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