ES2218562T3 - Composicion pesticida que comprende delta-endotoxina de bacillus thurigiensis quimerico cryif y bacillus thurigiensis quimerico cryia(c). - Google Patents
Composicion pesticida que comprende delta-endotoxina de bacillus thurigiensis quimerico cryif y bacillus thurigiensis quimerico cryia(c).Info
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Abstract
SE DESCRIBEN COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA CONTROLAR PLAGAS DE LEPIDOPTEROS. ESTAS COMPOSICIONES INCLUYEN COMBINACIONES SINERGICAS DE LAS DE -ENDOTOXINAS CRYLF QUIMERICA Y CRYLA(C) QUIMERICA DE BACILLUS THURINGIENSIS. SE HA DESCUBIERTO QUE ESTAS COMPOSICIONES MUESTRAN UNA EXCELENTE ACTIVIDAD CONTRA PLAGAS DE LEPIDOPTEROS.
Description
Composición pesticida que comprende
\delta-endotoxina de bacillus thurigiensis
quimérico CryIF y bacillus thurigiensis quimérico
CryIA(c).
El microbio del suelo Bacillus
thuringiensis (B.t.) es una bacteria
gram-positiva formadora de esporas caracterizada por
inclusiones cristalinas proteicas paraesporales. Estas inclusiones
aparecen a menudo como cristales microscópicos y
característicamente formados. Las proteínas pueden ser altamente
tóxicas para las plagas y específicas en su actividad tóxica. Se han
aislado y secuenciado, en ciertos genes de toxinas de B.t. y
los productos basados en DNA recombinante de B.t. se han
producido y aprobado para su uso. Además, con el uso de técnicas de
ingeniería genética, están en desarrollo nuevos enfoques para
administrar estas endotoxinas de B.t. a ambientes agrícolas,
incluyendo el uso de plantas genéticamente modificadas con genes de
endotoxina para la resistencia a insectos y el uso de células
microbianas intactas estabilizadas como portadores de administración
de endotoxinas (Gaertner, F.H., L. Kim [1988] TIBTECH
6:S4-S7). Así, los genes de endotoxinas de
B.t. aislados están llegando a ser valiosos
comercialmente.
Hasta los últimos diez años, el uso comercial de
los pesticidas B.t. se ha restringido grandemente a un
estrecho grupo de plagas de lepidópteros (orugas). L preparación de
esporas y cristales de B. thuringiensis de la subespecie
kurstaki se han usado durante muchos años como insecticidas
comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, B.
thuringiensis de la variedad de kurstaki
HD-1 produjeron un cristal llamado
\delta-endotoxina el cual es tóxico para las
larvas de un número de insectos lepidópteros.
En años recientes, sin embargo, los
investigadores han descubierto pesticidas de B.t. con
especificidades para un grupo de plagas mucho más amplio. Por
ejemplo, otras especies de B.t., a saber israelensis y
tenebrionis (a.k.a. B.t. M-7, a.k.a.
B.t san diego), se han usado comercialmente para controlar
insectos de los órdenes Dípteros y Coleópteros, respectivamente
(Gaertner, F.H. [1989] "Cellular Delivery Systems for
Insecticidal Proteins: Living and Non-Living
Microorganisms", in Controlled Delivery of Crop Protection
Agents, R.M. Wilkins, ed., Taylor and Francis, Nueva York y
Londres, 1990, páginas 245-255). Véase también
Couch, T.L. (1980) "Mosquito Pathogenicity of Bacillus
thurigiensis variedad isralelensis", Developments
in Industrial Microbiology 20:97-104, Krieg A.,
A.M. Huger, G.A. Langenbruch, W. Schnetter (1983) Z. Ang.
Ent. 96: 500-508, describe Bacillus
thurigiensis variedad tenebrionis, la cual según se dice
es activa contra dos escarabajos del orden Coleópteros. Son el
escarabajo patatero de Colorado, Leptinotarsa decemleneata,
y Angelastica alni).
Recientemente, se han identificado nuevas
subespecies de B.t., y se han aislado los genes responsables
de las proteínas \delta-endotoxina (Höfte, H.,
H.R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews
52(2):242- 255). Höfte y Whiteley clasificaron los genes de
las proteínas cristalinas de B.t en 4 clases principales.
Las clases fueron CyrI (específicos contra lepidópteros), CryII
(específicos para lepidópteros y dípteros), CryIII (específicos
para coleópteros) y CryIV (específicos para dípteros). Se ha
notificado el descubrimiento de cepas específicamente tóxicas para
otras plagas (Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992]
Bio/Technology 10:271-275).
La clonación y expresión de un gen de proteína
cristalina de B.t. en Eschirichia coli se ha descrito
en la literatura publicada (Schnepf, H.E., H.R. Whiteley [1981]
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2893-2897). La
patente de los Estados Unidos Nº. 4.448.885 y la patente de los
Estados Unidos 4.467.036 describen ambas la expresión de una
proteína cristalina de B.t. en Escherichia coli. Se
han construido genes híbridos de proteínas cristalinas que presentan
toxicidad incrementada y muestran un amplio intervalo de
hospedadores para una plaga diana. Véanse las patentes de los
Estados Unidos Nº^{s}. 5.128.130 y 5.055.294. Las patentes de
los Estados Unidos Nº^{s}. 4.797.276 y 4.853.331 describen la
cepa de B. thuringiensis san diego (a.k.a. B.t.
tenebrionis, a.k.a. M-7), la cual se usó para
controlar plagas de coleópteros en varios ambientes. La patente de
los Estados Unidos Nº. 4.849.217 describe aislados de B.t.
que tiene actividad contra el escarabajo picudo de la alfalfa. La
patente de los Estados Unidos Nº. 5.151.363 y la patente de los
Estados Unidos Nº. 4.948.734 describen ciertos aislados de
B.t. los cuales tiene actividad contra nemátodos.
Como resultado de una búsqueda extensa y de la
inversión de recursos, se han distribuido otras patentes para
nuevos aislados de B.t. y nuevos usos de aislados conocidos
de B.t. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos aislados de
B.t. y nuevos usos de aislados conocidos de B.t.
permanece como una técnica empírica e impredecible.
Una mayoría de las moléculas de proteínas
cristalinas de \delta-endotoxina de Bacillus
thurigiensis se compone de dos segmentos funcionales. El núcleo
de la toxina resistente a proteasas es el primer segmento, y
corresponde aproximadamente a la primera mitad de la molécula de
proteína. Se conoce la estructura tridimensional de un segmento
núcleo de una \delta-endotoxina de B.t.
CryIIIA y se propone que todas las toxinas relacionadas tienen la
misma estructura general (Li, J., J. Carroll, D.J. Ellar [1991]
Nature 353: 815-821). La segunda mitad de la
molécula es el segundo segmento. Para los propósitos de esta
solicitud, el segundo segmento se referirá en este documento como
el "segmento protoxina". Se cree que el segmento protoxina
participa en la formación de cristales de toxinas (Arvidson, H.,
P.E. Dunn, S. Strand, A.I. Aronson [1989] Molecular
Microbiology 3: 1533-1534; Choma, C.T., W.K.
Suewicz, P.R. Carey, P. Pozsgay, T. Raynor, H. Kaplan [1990]
Eur. J. Biochem. 189: 523-527). La molécula
completa de toxina de 130 kDa se procesa rápidamente al segmento
núcleo mediante proteasas en el intestino del insecto. El segmento
protoxina puede así conferir una parcial especificidad de insecto
para la toxina limitando la accesibilidad de núcleo al insecto
reduciendo el procesamiento de la proteasa de la molécula de toxina
(Haider, M.Z., B.H. Knowles, D.J. Ellar [1986] Eur. J.
Biochem. 156: 531-540) o reduciendo la
solubilidad de la toxina (Aronson, A.I., E.S. Han, W. McGaughey, D.
Johnson [1991] Appl. Environ Microbiol. 57:
981-986).
Se han notificado proteínas quiméricas unidas con
los dominios toxina entre CryIC y CryIA(b) (Honee, G., D.
Convents, J. Van Rie, S. Jansens, M. Perferoen, B. Visser [1991]
Mol. Microbiol. 5: 2799-2806); sin embargo,
la actividad de estas proteínas quiméricas fue bien mucho menor, o
indetectable, cuando se la compara con CryIC en un insecto
relevante.
Honee y col.(Honee, G., W. Vriezen, B.
Visser [1990] Appl. Environ. Microbiol. 56:
823-825) también han notificado la fabricación de
una proteína quimérica de fusión mediante la unión conjunta de
dominios de toxina de CryIC y CryIA(b). La proteína
resultante tiene un espectro incrementado de actividad equivalente
a las actividades combinadas de las toxinas individuales; sin
embargo, la actividad de la quimérica no se incrementó hacia ninguno
de los insectos diana.
Se encontró que un nucleótido de
\beta-exotoxina producido por una cadena
particular B.t. actuaba sinérgicamente con las
\delta-endotoxinas proteicas en la
variedad kurstaki de B.t., para producir actividad
incrementada contra la plaga de lepidópteros Spodoptera
exigua; véase Moar y col. (1986), J. Econ. Entomol. 79:
1443-1446. La toxicidad incrementada contra las
larvas de mosquito tiene lugar con una mezcla de la proteína de 27
kDa y la de 65 o la de 130 kDa de la variedad israelensis
de B.t.; véase Chilcott y col. (1988), J. Gen.
Microbiology 132: 2551-2558, y Wu y col.
(1985), FEBS 190(2): 232-236. Las toxinas
CryIVA y CryIVB de la variedad israelensis de B.t.
también se han usado conjuntamente; véase Angsuthanasomat y
col. (1992), FEMS Microbiol. Lett. 94:
63-68.
Ge y col. (1991), J. Biol. Chem. 266(27):
17954-8, describe toxinas proteicas quiméricas que
comprenden CryIA(c) y CryIA(a).
El documento
US-A-5128130 describe genes de
toxinas de Bacillus thurigiensis efectivos contra plagas de
lepidópteros, comprendiendo los genes CryIA(c) y
CryIA(b).
Chambers y col. (1991), J.
Bacteriol. 173(13): 3.966-76, y el documento
WO-A-9116434 describen la
identificación y aislamiento del gen CryIF del Bacillus
thurigiensis.
De acuerdo con la presente invención, una
composición para controlar plagas de lepidópteros comprende una
proteína que contiene un núcleo de toxina quimérico CryIF y una
proteína que contiene núcleo de toxina quimérico CryIA(c), o
células que expresen estas proteínas.
La combinación de proteínas de acuerdo con la
invención proporciona una toxicidad inesperadamente incrementada a
las plagas de lepidópteros. Se puede lograr un efecto sinérgico
combinando, como una mezcla, aislados los cuales cada uno de ellos
produce una de las proteínas toxina. Los hospedadores modificados
genéticamente para expresar ambas toxinas se pueden usar también
para lograr el efecto sinérgico. Los hospedadores recombinantes
adecuados incluyen procariotas y eucariotas inferiores, igual que
plantas.
Los genes quiméricos CryIF útiles de acuerdo con
la presente invención se puede emsamblar, eso sustituye un segmento
heterólogo de protoxina para todas o parte de los segmentos
protoxina de CryIF. En particular, toda o parte de la región
codificante de protoxina de un gen CryIA(b) se puede usar en
lugar de toda o parte de la región que codifica la protoxina para
una toxina CryIF nativa. De forma similar, un gen quimérico puede
construirse en el que la región codificante de toda o parte de la
protoxina de una toxina CryIF se sustituye por DNA que codifica
toda o parte de la protoxina de un gen quimérico
CryIA(c)/CryIA(b). En una realización específica, el
gen quimérico CryIA(c)/CryIA(b) es ese que se ha
señalado 436 y el cual se describe en el documento
US-A-5128130. Este gen se puede
obtener del plásmido en P. fluorescens MR436.
El gen quimérico se puede introducir dentro de
una amplia variedad de microbios u hospedadores vegetales. Un
hospedador transformado expresa el gen quimérico que se puede usar
para producir toxinas activas contra lepidópteros. Los hospedadores
transformados se pueden usar para producir las toxinas, o, en el
caso de una célula vegetal transformada para producir las toxinas,
la planta llegará a ser resistente al ataque de los insectos.
La invención proporciona el uso de las toxinas
quiméricas, u hospedadores que contienen los genes que codifican
las toxinas quiméricas, en procedimientos para controlar las plagas
de lepidópteros. La invención proporciona también combinaciones de
células tratadas de B.t. sustancialmente intactas, o células
recombinantes que expresan los genes y que producen las toxinas de
la invención. Las células se pueden tratar también para prolongar
la actividad pesticida cuando las células sustancialmente intactas
se aplican al ambiente de la plaga diana. Tal tratamiento puede ser
por medios químicos o físicos, o por una combinación de medios
químicos y físicos, por tanto tiempo como la técnica no afecte
deletéreamente las propiedades sinérgicas de los pesticidas, ni
disminuya la capacidad celular en proteger a los pesticidas. La
célula tratada actúa como un recubrimiento protector para la
toxinas del pesticida. Las toxinas llegan a estar disponibles para
actuar como tales tras su ingestión por una plaga diana.
Figura 1 - El sitio BamHI se eliminó de
pMYC1050 mediante una reacción de sustitución con la polimerasa
Klenow para dar el plásmido MYC1050\DeltaBamHI. Para
facilitar el clonaje, un fragmento de DNA NsiI que contiene
la mayoría de la fase de lectura abierta de la toxina se clonó en
pGEM5. El plásmido resultante se llamó pGEM_{tox}. C =
ClaI, H = HindIII.
Figura 2 - El sitio de clonado BamHI o
PvuI se introdujo dentro de la toxina de DNA por la técnica
de Extensión del Lazo de Splicing (SOE). Los fragmentos de
DNA con los sitios nuevos se usan para reemplazar los fragmentos
homólogos en pGEM_{tox}. Los plásmidos resultantes son
pGEM_{tox}BamHI o pGEM_{tox} PvuI. Las letras de
la A a la G entre las flechas corresponden a cebadores de
oligonucleótidos en el texto. Las letras sobre las líneas
verticales corresponden a sitios de enzimas de restricción. B =
BamHI, C = ClaI, H = HindIII, P = PvuI,
S = SacI.
Figura 3 - El fragmento de DNA que contiene la
mutación BamHI se usó para reemplazar el fragmento homólogo
en pGEM_{tox} PvuI. El plásmido resultante que contiene
ambos sitios de clonado es pGEM_{tox}BamHIPvuI.
Para construir un plásmido de expresión, el fragmento que contiene
toxina NsiI se escinde para clonarse dentro del vector de
alto número de hospedadores pTJS260. B = BamHI, C =
ClaI, H = HindIII, P = PvuI.
Figura 4 - El fragmento que contiene toxina
NsiI con los nuevos sitios de restricción se liga al vector
que contiene DNA de pMYC1050\DeltabamHI para dar pMYC2244.
Un fragmento de DNA derivado de PCR BamHI-PvuI que
contiene la toxina CryIF se intercambió por el fragmento equivalente
en pMYC2244. La quimera resultante se llamó pMYC2239. B =
BamHI, C = ClaI, H = HindIII, N = NsiI,
P = PvuI.
Figura 5 - El fragmento pequeño de DNA
ApaI de pMYC2047 se sustituyó por la región homóloga de
pMYC2239 para dar el plásmido pMYC2244. Esta quimera consta de CryF
en la región toxina y CryIA(b) en la protoxina. C =
ClaI, H = HindIII, N = NsiI, P =
PvuI.
Figura 6 - Cambios silenciosos de codones se
introducen dentro de la toxina CryF mediante SOE. El fragmento de
DNA de PCR SpeI-KpnI con los cambios se sustituyó por
los fragmentos homólogos que contienen toxinas en pMYC2047. El
plásmido resultante es pMYC2243. Las letras de la H a la K bajo las
flechas corresponden a oligonucleótidos cebadores en la prueba.
Figura 7 - Cambios silenciosos de codones se
introducen dentro de pMYC2244 mediante sustitución de los fragmentos
homólogos con el pequeño fragmento de DNA ApaI de pMYC2243.
El plásmido final es pMYC2523. P = PvuI.
Figura 8 - Una toxina quimérica que contiene la
protoxina 436 se construyó sustituyendo una protoxina
PvuI-BstEII generada mediante PCR por el fragmento
homólogo en pMYC2523. El plásmido final es pMYC2254. Las letras F y
M bajo las flechas corresponden a los cebadores de oligonuclótido
en el texto.
Figura 9 - Una secuencia de proteína quimérica
CryIF/CryIA(b) y sustituciones residuo por residuo. La línea
"Cons" muestra una secuencia quimérica CryIF/CryIA(b).
Las líneas "Alt" presentan sustituciones residuo por residuo
encontradas en la proteína 436, las proteínas variantes
CryA(b) y las protoxinas CryIF.
SEQ ID Nº. 1 es un cebador oligonucleótido
"A".
SEQ ID Nº. 2 es un cebador oligonucleótido
"B".
SEQ ID Nº. 3 es un cebador oligonucleótido
"C".
SEQ ID Nº. 4 es un cebador oligonucleótido
"D".
SEQ ID Nº. 5 es un cebador oligonucleótido
"E".
SEQ ID Nº. 6 es un cebador oligonucleótido
"F".
SEQ ID Nº. 7 es un cebador oligonucleótido
"G".
SEQ ID Nº. 8 es un cebador oligonucleótido
"L".
SEQ ID Nº. 9 es un cebador oligonucleótido
"N".
SEQ ID Nº. 10 es un cebador oligonucleótido
"O".
SEQ ID Nº. 11 es un cebador oligonucleótido
"H".
SEQ ID Nº. 12 es un cebador oligonucleótido
"I".
SEQ ID Nº. 13 es un cebador oligonucleótido
"J".
SEQ ID Nº. 14 es un cebador oligonucleótido
"K".
SEQ ID Nº. 15 es un cebador oligonucleótido
"P".
SEQ ID Nº. 16 es un cebador oligonucleótido
"Q".
SEQ ID Nº. 17 es un cebador oligonucleótido
"M".
SEQ ID Nº. 18 muestra la secuencia de DNA
codificadora de toxina de pMYC2224.
SEQ ID Nº. 19 muestra la secuencia de aminoácidos
predicha de la toxina codificada por pMYC2224.
SEQ ID Nº. 20 muestra la secuencia de DNA
codificadora de toxina de pMYC2239.
SEQ ID Nº. 21 muestra la secuencia de aminoácidos
predicha de la toxina codificada por pMYC2239.
SEQ ID Nº. 22 muestra la secuencia de DNA
codificadora de toxina de pMYC2244, la cual codifica una toxina
quimérica CryIF/CryIA(b).
SEQ ID Nº. 23 muestra la secuencia de aminoácidos
predicha de la toxina quimérica CryIF/CryIA(b) codificada por
pMYC2244.
SEQ ID Nº. 24 muestra la secuencia de DNA
codificadora de toxina de pMYC2243.
SEQ ID Nº. 25 muestra la secuencia de aminoácidos
predicha de la toxina codificada por pMYC2243.
SEQ ID Nº. 26 muestra la secuencia de DNA
codificadora de toxina de pMYC2523, la cual codifica una toxina
quimérica CryIF/CryIA(b) con un codón usado de nuevo en forma
alterada.
SEQ ID Nº. 27 muestra la secuencia de aminoácidos
predicha de la toxina codificada por pMYC2523.
SEQ ID Nº. 28 muestra la secuencia de DNA
codificadora de toxina de pMYC2554, la cual codifica una toxina
quimérica CryIF/436.
SEQ ID Nº. 29 muestra la secuencia de aminoácidos
predicha de la toxina codificada por pMYC2554.
SEQ ID Nº. 30 es una secuencia característica de
las toxinas crI. Esta secuencia finaliza en el residuo 601 de SEQ ID
Nº. 23.
SEQ ID Nº. 31 son los ocho aminoácidos que
preceden al aminoácido 1.043 en SEQ ID Nº. 23.
SEQ ID Nº. 32 muestra la secuencia de aminoácidos
de una toxina nativa CryIF/CryIA(b).
SEQ ID Nº. 33 muestra la secuencia de aminoácidos
de una toxina nativa CryIA(b).
SEQ ID Nº. 34 muestra la secuencia de aminoácidos
de una toxina CryIA(c)/CryIA(b).
La invención objeto se ocupa de la mejora
inesperada de la actividad pesticida resultante de una combinación
de una toxina quimérica CryIF y una toxina quimérica
CryIA(c). La combinación ha incrementado sorprendentemente la
actividad contra las plagas de lepidópteros. Preparaciones de
combinaciones de aislados que producen las dos toxinas quiméricas
se pueden usar para practicar la invención objeto. Las células de
Pseudomonas fluorescens transformadas con genes de
B.t. pueden usarse para practicar la invención objeto. Por
ejemplo, una cepa inducible por lactosa de P. fluorescens
comprende un gen que codifica una toxina quimérica
CryIF/CryIA(b), y P. fluorescens MR436, la cual
comprende un gen que codifica una toxina quimérica
CryIA(c)/CryIA(b), se puede usar para practicar la
invención objeto. Estas dos cepas de Pseudomanas se pueden
combinar en una mezcla física que presenta actividad pesticida
ventajosamente incrementada. Los genes que codifican las toxinas de
la invención pueden usarse para transformar hospedadores adecuados
de tal forma que un solo hospedador producirá las dos toxinas que
proporcionan el efecto ventajoso.
Las bacterias que albergan plásmidos útiles de
acuerdo con la invención objeto son las siguientes:
\newpage
| Cultivo | Nº. de depósito | Nº. de patente de los Estados Unidos |
| P. fluorescens (pM3, 130-7) | NRRL B-18332 | 5.055.294 |
| P. fluorescens MR436 (pM2, | NRRL B-18292 | 5.128.130 |
| 16-11, aka pMYC436) | ||
| E. coli NM522 (pMYC1603) | NRRL B.18517 | 5.188.960 |
Debería entenderse que la disponibilidad de un
depósito no constituye una licencia para practicar la invención
objeto en la derogación de los derechos de patente garantizados por
la acción gubernamental.
De acuerdo con la invención objeto, se ha
descubierto que los productos que comprenden las dos toxinas
quiméricas requieren un contenido total de proteínas menor para la
aplicación del producto proporcionando así mayor ahorro del
usuario. Los insectos que son menos susceptibles a la acción de una
única proteína serán afectados más grandemente por la combinación
de las toxinas de la invención objeto, dando lugar a un producto
que contiene las dos toxinas más eficaz que los productos que
contienen una única toxina Adicionalmente, es menos probable que
las plagas desarrollen una resistencia rápida frente a un producto
que contiene las dos toxinas, que frente a productos que contienen
una única toxina.
Las combinaciones de las toxinas descritas en la
invención pueden usarse para controlar plagas de lepidópteros. Los
lepidópteros adultos, es decir, mariposas y polillas, se alimentan
primariamente de néctar de las flores y son unos efectivos
efectores de la polinización. Las larvas, es decir, orugas, casi
todas se alimentan en las plantas, y muchas son plagas graves. La
comida de las orugas sobre o dentro del follaje o en las raíces o
tallo de una planta, privando a la planta de nutrientes y a menudo
destruyendo la estructura física de soporte de la planta.
Adicionalmente, las orugas se alimentan en la fruta, tejidos, y
semillas y harina almacenadas, arruinando estos productos para su
venta o disminuyendo seriamente su valor. Tal como se usa en el
presente documento, la referencia a las plagas de lepidópteros se
refiere a varias etapas de la vida de la plaga, incluyendo estados
larvarios.
Las toxinas quiméricas de la invención objeto
comprenden una parte N-terminal completa del núcleo
de la toxina de una toxina de B.t. y, en algún punto pasado
el final de la parte toxina, la proteína tiene un transición a una
secuencia heteróloga de protoxina. La parte de la toxina
N-terminal de una toxina B.t. se refiere en
el presente documento como la toxina "núcleo". La transición
del segmento heterólogo de la protoxina puede suceder a
aproximadamente la unión toxina/protoxina o, como alternativa, una
parte de la proteína nativa (que se extiende pasada la parte
toxina) puede retenerse con la transición a protoxina heteróloga
que sucede más adelante en la proteína. Como un ejemplo, una toxina
quimérica de la invención objeto tiene la parte toxina completa de
CryIF (aminoácidos 1-601) y una protoxina heteróloga
(aminoácidos 602 al extremo C-terminal). En una
realización preferida, la parte heteróloga de la protoxina se
deriva de una toxina CryIA(b) o una toxina 436.
Una persona experta en esta técnica apreciará que
las toxinas B.t., incluso dentro de cierta clase tal como
CryIF, variarán en alguna extensión en longitud y la localización
precisa de la transición de la parte toxina a la parte protoxina.
Típicamente, las toxinas CryIA(b) y CryIF son de
aproximadamente 1150 a aproximadamente 1200 aminoácidos de longitud.
La transición de la parte toxina a la parte protoxina sucederá
típicamente a entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 60%
de la longitud total de la proteína. La toxina quimérica de la
invención objeto incluirá la total extensión de esta parte
N-terminal del núcleo de la toxina. Así, la toxina
quimérica comprenderá al menos aproximadamente el 50% de la
longitud total de la toxina CryIF B.t. Esto será típicamente
al menos 590 aminoácidos. Con respecto a la parte protoxina, la
expansión plena de la parte protoxina CryIA(b) se extiende
del final de la parte toxina al extremo C-terminal
de la molécula. Son los últimos de 100 a 150 aminoácidos
aproximadamente los que son más críticos para incluir en la toxina
quimérica de la invención objeto. En una toxina quimérica
específicamente ejemplificada en el presente documento, al menos se
utilizan los aminoácidos del 1043 (de la SEQ ID Nº. 23) al extremo
C-terminal de la molécula CryIA(b). El
aminoácido 1043 en la SEQ ID Nº. 23 está precedido por la secuencia
Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys (SEQ ID Nº. 31). Esta secuencia de
aminoácido marca la posición en el segmento protoxina de la molécula
más allá de la cual los aminoácidos heterólogos se darán siempre en
la toxina quimérica. En otro ejemplo, el péptido que se muestra
como SEQ ID Nº. 31 se da en los aminoácidos 1061 a 1068. En este
caso, los aminoácidos 1069 al C-terminal son
preferiblemente heterólogos (SEQ ID Nº. 29). El péptido mostrado en
la SEQ ID Nº. 31 puede encontrarse en las posiciones 1061 a 1068 en
la figura 9. Así, es al menos el último aproximadamente del 5 al
10% de la proteína B.t. general, la cual comprendería DNA
heterólogo (comparado con la parte N-terminal del
núcleo de la toxina CryIF) en la toxina quimérica de la invención
objeto. En los ejemplos específicos contenidos en el presente
documento, las secuencias heterólogas de la proteína se dan del
aminoácido 640 al extremo C-terminal.
Así, una realización preferida de la invención
objeto es la toxina quimérica B.t. de aproximadamente 1150 a
aproximadamente 1200 aminoácidos en longitud, en la que la toxina
quimérica comprende una parte N-terminal del núcleo
de la toxina CryIF de al menos entre aproximadamente el 50% y
aproximadamente el 60% de una molécula CryIF completa, pero no más
de entre aproximadamente el 90 y aproximadamente el 95% de la
molécula completa. La toxina quimérica comprende adicionalmente una
CryIA(b) o una parte C-termina l de la
protoxina 436 la cual comprende al menos aproximadamente del 5 al
10% de la molécula CryIA(b) o la molécula 436. La transición
de CryIF a CryIA(b) o secuencia 436 ocurre así dentro del
segmento protoxina (o en la unión de los segmentos toxina y
protoxina) entre aproximadamente 50% y aproximadamente 95% del
recorrido a través de la molécula. En los ejemplos específicos
proporcionados en el presente documento, las transiciones de la
secuencia CryIF a las secuencias heterólogas de la protoxina tiene
lugar antes del final de la secuencia del péptido mostrada en la
SEQ ID Nº. 31.
Una realización específica de la invención objeto
es la toxina quimérica mostrada en la figura 9. Otras
construcciones pueden hacerse y usarse por aquellos expertos en
esta técnica que tienen el beneficio de las enseñanzas
proporcionadas en el presente documento. El segmento núcleo de la
toxina de las proteínas CryI termina característicamente con la
secuencia: Val/Leu Tyr/Ile Ile Asp Arg/Lys Ile/Phe Glu Ile/Phe/Leu
Ile/Leu/Val Pro/Leu Ala/Val Glu/Thr/Asp (SEQ ID Nº. 30), la cual
termina en el residuo 601 de la SEQ ID Nº. 23. Adicionalmente, los
segmentos protoxina de las toxinas CryI (el cual sigue al residuo
601) llevan más similitud de secuencia que los propios segmentos
toxina. Debido a esta similitud de secuencia, el punto de
transición en el segmento protoxina para hacer una proteína
quimérica entre la secuencia CryIF y las secuencias CryIA(b)
o 436 pueden determinarse fácilmente por alguien experto en la
técnica. A partir de estudios de datos con respecto a la proteolisis
parcial de los genes CryI, la heterogeneidad y las regiones de
aminoácidos menos conservadas se encuentran después de la secuencia
protoxina conservada CryI, posiciones 1061-1068 de
la figura 9.
Por lo tanto una toxina quimérica de la invención
objeto puede comprender la toxina CryF completa y una parte de la
protoxina CryIF, en transición a la correspondiente secuencia
CryIA(b) o 436 en cualquier posición entre el final del
fragmento toxina (como se definió anteriormente en este documento) y
el final de la secuencia peptídica mostrada en SEQ ID Nº. 31.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del extremo
C-terminal de la toxina quimérica comprende una
secuencia CryIA(b) o una secuencia del gen 436 o un
equivalente de una de estas secuencias.
Las toxinas CryIF, y los genes que codifican
estas toxinas, se conocen bien en la técnica. Los genes y toxinas
CryIF se han descrito, por ejemplo, en Höfte y col. (1986)
Eur. J. Biochem. 161:273; Geiser y col. (1986)
Gene 48:109; y Haider y col. (1988) Nucleic Acids
Res. 16:10927. El técnico experto que tiene el beneficio de las
enseñanzas contenidas en el presente documento pudo identificar y
usar fácilmente el DNA que codifica la parte
N-terminal toxina de una molécula CryIF y la parte
protoxina C-terminal de las toxinas
CryIA(b).
La figura 9 proporciona ejemplos de sustituciones
de aminoácidos que pueden usarse en las toxinas de la invención
objeto. También son bien conocidas en la técnica varias mutaciones
que pueden hacerse en una secuencia toxina sin cambiar la actividad
de una toxina. Además, debido a la degeneración del código
genético, una variedad de secuencias de DNA se puede usar para
codificar una toxina en particular. Estas secuencias alternativas
de DNA y aminoácidos pueden usarse de acuerdo con la invención
objeto por una perdona experta en esta técnica.
Las técnicas de sustitución de la protoxina de la
invención objeto pueden usarse con otras clases de endotoxinas
B.t. para mejorar la expresión de la toxina. La técnica
sería más aplicable a otras toxinas B.t. las cuales tienen
la secuencia característica que se muestra en la SEQ ID Nº. 30.
Los diagramas de flujo de las figuras
1-8 proporcionan una visión de conjunto general de
la construcción de vectores que puede llevarse a cabo de acuerdo a
la invención objeto. Los sitios de clonado BamHI y
PvuI se pueden introducir dentro de un gen de toxina
quimérica CryIA(c)CryIA(b) mediante
mutagénesis usando la técnica de PCR de Extensión de Lazo de
"Splicing" (SOE) (Horton, R.M., H.D. Hunt, S.N. Ho, J.K.
Pullen, L.R. Pease [1989] Gene 77: 61-68)
para dar el plásmido pMYC2224. Una región del gen CryIF de un
plásmido que contiene CryIF tal como pMYC1260 puede generarse
mediante PCR y sustituirse por el fragmento génico
BamHI-PvuI
CryIA(c)/
\hbox{CryIA(b)} de pMYC2224. El
nuevo plásmido, el cual se designó pMYC2239, constó de un segmento
corto de CryIA(c) seguido por CryIF ala unión entre segmentos
toxina/protoxina. Así, el segmento protoxina se derivó ahora de
\hbox{CryIA(b)} (pMYC1050). Un fragmento
ApaI derivado del clon CryIF (pMYC2047) se sustituyó por el
fragmento ApaI en pMYC2239. El clon resultante (pMYC2244)
constó de CryIF de la metionina iniciadora al segmento de unión
toxina/protoxina y CryA(b) al final de la región
codificante. El clon pMYC2243 se construyó mediante SOE para
introducir cambios silenciosos de codones en una región limitada. El
fragmento ApaI de pMYC2243 que contiene los cambios
silenciosos se sustituyó por el fragmento ApaI en pMYC2244
para dar el clon pMYC2523. El quimérico pMYC2523 mostró un
incremento de expresión por encima de pMYC2243, lo cual contiene
SECUENCIAS de proteína CryIF sin cambiar.
Una quimera CryIF/436 se puede ensamblar
sustituyendo el segmento de la proteína que contiene el fragmento
PvuI-BstEII de pMYC2523 con un fragmento equivalente
generado por PCR de un plásmido que contiene un gen
CryIA(c)/CryIA(b). Un gen tal es el gen 436 (por
ejemplo, pMYC467, como se discute en las patentes de los Estados
Unidos Nº^{s}. 5.055.294 y 5.169.760. Esta construcción también
resulta en una expresión incrementada comparada con la secuencia
nativa de la proteína CryIF.
Genes y toxinas. Los genes y las toxinas
útiles de acuerdo con la invención objeto incluyen no sólo las
longitudes totales de las secuencias descritas sino también
fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes, y proteínas de
fusión las cuales retienen la característica actividad pesticida de
las toxinas específicamente ejemplificadas aquí. Del modo en que se
usan en el presente documento, los términos "variantes" o
"variaciones" de genes se refieren a las secuencias de
nucleótidos las cuales codifican las mismas toxinas o las cuales
codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Como
se usa en el presente documento, el término "toxinas
equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o
esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas diana
como las toxinas reivindicadas.
Será patente para una persona experta en esta
técnica que los genes que codifican toxinas activas se pueden
identificar y obtener a través de varios medios. Los genes
específicos de porciones génicas ejemplificadas en el presente
documento pueden obtenerse de los aislados depositados en un
depósito de cultivos como se describió anteriormente en este
documento. Estos genes, o partes o variantes de los mismos, pueden
también construirse sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de
un sintetizador de genes. Las variaciones de los genes pueden
construirse fácilmente usando técnicas estándar para hacer
mutaciones puntuales. También, fragmentos de estos genes pueden
hacerse usando endonucleasas comercialmente disponibles o
exonucleasas de acuerdo con procedimientos estándar. Por ejemplo,
las enzimas tales como Bal31 o de mutagénesis dirigida
específica de sitio pueden usarse para escindir sistemáticamente
nucleótidos de los extremos de estos genes. También, los genes que
codifican fragmentos activos pueden obtenerse usando una variedad de
enzimas de restricción. Las proteasas pueden usarse para obtener
directamente fragmentos activos de estas toxinas.
Los fragmentos y equivalentes que retienen la
actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas estarían dentro
de la panorámica de la invención objeto. También, debido a la
redundancia del código genético una variedad de diferentes
secuencias de DNA pueden codificar las secuencias de aminoácidos
descritas en el presente documento. Está claramente dentro de la
habilidad de una persona preparada en la técnica crear estas
secuencias de DNA alternativas que codifican las mismas, o
esencialmente las mismas, toxinas. Estas secuencias variantes de
DNA están dentro de la panorámica de la presente invención. Como se
usa en el presente documento, la referencia a "esencialmente la
misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen
sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos
que no afectan materialmente la actividad pesticida. Los fragmentos
que retienen la actividad pesticida también están incluidos en esta
definición.
Un procedimiento adicional para identificar las
toxinas y partes génicas útiles de acuerdo con la invención objeto
es a través del uso de las sondas de oligonucleótidos. Las sondas
son secuencias de nucleótidos detectables. Estas secuencias pueden
ser detectables en virtud de una apropiada marca o pueden hacerse
inherentemente fluorescentes como se describe en la solicitud
internacional Nº. WO93/16094. Como se conoce bien en la técnica, si
la molécula sonda y la muestra de ácidos nucleicos hibridan
formando un fuerte enlace entre las dos moléculas, se puede asumir
razonablemente que la sonda y la muestra tienen homología
sustancial. Preferiblemente, la hibridación se dirige bajo
condiciones estrictas mediante técnicas bien conocidas en la
técnica, como se describe, por ejemplo, en Keller, G.H., M.M. Manak
(1987) DNA Probes, Stockton Press, Nueva York, NY., páginas
169-170. La detección de la sonda proporciona un
medio para determinar de una forma conocida si ha ocurrido la
hibridación. Así, un análisis de la sonda proporciona un
procedimiento rápido para identificar genes que codifican toxinas
de la invención objeto. Los segmentos de nucleótido que se usan
como sondas de acuerdo a la invención pueden sintetizarse usando
sintetizadores de DNA y procedimientos estándar. Estas secuencias
de nucleótidos se pueden usar también como cebadores de PCR para
amplificar los genes de la invención objeto.
Ciertas toxinas de la invención objeto se han
ejemplificado específicamente en el presente documento. A partir de
que estas toxinas son meramente ejemplos de las toxinas de la
invención objeto, sería fácilmente patente que la invención objeto
comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias
nucleotídicas que codifican para toxinas equivalentes) que tienen la
misma o similar actividad pesticida de la toxina ejemplificada. Las
toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácidos con una
toxina ejemplificada. Esta homología de aminoácidos será típicamente
mayor del 75%, preferiblemente será mayor del 90%, y más
preferiblemente será mayor del 95%. La homología aminoacídica será
mayor en regiones críticas de la toxina la cual da cuenta de la
actividad biológica o está implicada en la determinación de la
configuración tridimensional que en última instancia es responsable
de la actividad biológica. A este respecto, ciertas sustituciones
de aminoácidos son aceptables y pueden esperarse si estas
sustituciones están en regiones que no son críticas para la
actividad o son sustituciones de aminoácidos conservadoras las
cuales no afectan la configuración tridimensional de la molécula.
Por ejemplo, los aminoácidos se pueden situar en las siguientes
clases: no polares, polares no cargados, básicos, y ácidos. Las
sustituciones conservadoras por las cuales un aminoácido de una
clase es reemplazado con otro aminoácido del mismo tipo caen dentro
de la panorámica de la invención sujeto siempre que la sustitución
no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. La
tabla 1 proporciona un listado de ejemplos de aminoácidos
pertenecientes a cada clase.
| Clase de aminoácido | Ejemplos de aminoácidos |
| No polares | Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp |
| Polares no cargados | Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln |
| Ácidos | Asp, Glu |
| Básicos | Lys, Arg, His |
En algunos ejemplos, se pueden hacer también
sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que esas
sustituciones no deben significar quitar valor a la actividad
biológica de la toxina.
Hospedadores recombinantes. Los genes que
codifican las toxinas de la invención objeto pueden introducirse
dentro de una amplia variedad de hospedadores microbianos o
vegetales. La expresión del gen de la toxina da como resultado,
directa o indirectamente, en la producción intracelular y
mantenimiento del pesticida. La transferencia por conjugación y la
transferencia recombinante se pueden usar para crear una cepa de
B.t. que expresa ambas toxinas de la invención objeto. Otros
organismos hospedadores pueden transformarse también con uno o ambos
de los genes toxina usados después para lograr el efecto sinérgico.
Con los hospedadores microbianos adecuados, por ejemplo,
Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar al sitio de la
plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el
control de la plaga. Alternativamente, el microbio que hospeda el
gen de la toxina puede tratarse bajo condiciones que prolonguen la
actividad de la toxina y estabilicen la célula. La célula tratada,
la cual retiene la actividad tóxica, se puede aplicar después al
ambiente de la plaga diana.
Donde la toxina B.t. se introduce por
medio de un vector adecuado en un hospedador microbiano, y dicho
hospedador se aplica al ambiente en un estado vivo, es esencial que
ciertos microbios hospedadores se usen. Se seleccionan hospedadores
microbianos que son conocidos por ocupar la "fitosfera"
(filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más
cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de tal
forma que son capaces de competir exitosamente en el ambiente
particular (cultivo y otros hábitats de insectos) con los
microorganismos de tipo salvaje, proporcionar mantenimiento y
expresión estables de los genes que expresan el pesticida
polipeptídico, y, deseablemente, proporcionar protección mejorada
del pesticida de la degradación e inactivación medioambientales.
Un gran número de microorganismos son conocidos
por habitar el filoplano (la superficie de las hojas de las
plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de una
planta) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos
microorganismos incluyen bacterias, algas, y hongos. De particular
interés son los microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo,
los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella,
Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas,
Methylophilius, Agrobacterium Acetobacter, Lactobacillus,
Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes;
hongos, particularmente bacterias, por ejemplo, los géneros
Sacharomyces, Cryptococcus, Kuyveromyces, Sporobolomyces,
Rhodotorula, y Aureobasidium. De particular interés son
especies bacterianas de la fitosfera tales como Pseudomonas
syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter
xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides,
Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus,
y Azotobacter vinlandii; y especies bacterianas de la
fistosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina,
R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii,
Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces
roseus, S. odorus, Kluiveromyces veronae, y Aureobasidium
pollulans. De particular interés son los microorganismos
pigmentados.
Una amplia variedad de caminos están disponibles
para introducir un gen de B.t. que codifica una toxina
dentro de un microorganismo hospedador bajo condiciones que
permiten el mantenimiento estable y la expresión del gen. Estos
procedimientos son bien conocidos por aquellos expertos en la
técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados
Unidos Nº. 5135.867, la cual se incorpora en el presente documento
mediante referencia.
Tratamiento de células. Bacillus
thuringiensis o células recombinantes que expresan las toxinas
de B.t. pueden tratarse para prolongar la actividad de la
toxina y estabilizar la célula. La microcápsula de pesticida que se
forma comprende la toxina de B.t. o toxinas dentro de una
estructura celular que se ha estabilizado y protegerá la toxina
cuando la microcápsula se aplica al ambiente de la plaga diana. Las
células hospedadoras adecuadas pueden incluir bien procariotas o
bien eucariotas, estando normalmente limitadas a aquellas células
las cuales no producen sustancias tóxicas para los organismos
superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, los organismos que
producen sustancias tóxicas para organismos superiores se pueden
usar, donde las sustancias tóxicas son inestables o el nivel de
aplicación es lo suficientemente bajo como para permitir cualquier
posibilidad de toxicidad para un hospedador mamífero. Como
hospedadores, los procariotas y los eucariotas inferiores, tales
como hongos, serán de particular interés.
La célula estará usualmente intacta y estará
sustancialmente en la forma proliferativa cuando se trate, más que
en una forma espora, aunque en algunos casos se pueden emplear
esporas.
El tratamiento de la célula microbiana, por
ejemplo un microbio que contiene el gen o genes de la toxina
B.t., puede ser por medios físicos o químicos, o por una
combinación de medios químicos y/o físicos, mientras que la técnica
no afecte deletéreamente las propiedades de la toxina, ni disminuya
la capacidad celular de proteger la toxina. Ejemplos de reactivos
químicos son los compuestos halogenantes, particularmente los
halógenos de número atómico 17-80. Más
particularmente, el yodo puede ser usado bajo condiciones moderadas
y durante el tiempo suficiente para conseguir los resultados
deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el tratamiento con
aldehídos, tales como glutaraldehído, antiinfectivos, tales como
cloruro de cefiran y cloruro de cetilpiridinium, alcoholes, tales
como isopropil y etanol; varios fijadores histológicos, tales como
Lugol de yodo, fijador de Bouin's, varios ácidos y el fijador de
Helly (véase: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques,
W.H. Freeman and Company, 1967); o una combinación de agentes
físicos (calor) y químicos que preservan y prolongan la actividad
de la toxina producida en la célula cuando la célula se administra
al ambiente del hospedador. Ejemplos de medios físicos son
radiaciones de longitud de onda corta tales como
radiación-gamma y radiación-X,
congelación, irradiación ultravioleta, liofilización, y similares.
Los procedimientos para el tratamiento de células microbianas se
discuten en las patentes de los Estados Unidos Nº^{s}. 4.695.455
y 4.695.462, las cuales se incorporan en el presente documento por
referencia.
Las células generalmente tendrán una estabilidad
estructural la cual aumentará la resistencia a las afecciones
ambientales. Donde el pesticida está en una proforma, el
procedimiento de tratamiento de la célula se selecciona de tal
forma que no inhiba el procesamiento de la proforma a la forma
madura del pesticida por el patógeno de la plaga diana. Por
ejemplo, el formaldehído entrecruzará las proteínas y podría
inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida
polipeptídico. El procedimiento del tratamiento retendrá al menos
una parte sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la
toxina.
Características de particular interés al
seleccionar una célula hospedadora para los propósitos de la
producción, incluyen facilidad de introducir el gen o genes de
B.t. en el hospedador, disponibilidad de sistemas de
expresión, eficiencia de expresión, estabilidad del pesticida en el
hospedador, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares.
Características de particular interés para usar una microcápsula de
pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida, tales
como paredes celulares delgadas, pigmentación, y empaquetamiento
intracelular o formación de cuerpos de inclusión; supervivencia en
ambientes acuosos; falta de toxicidad para los mamíferos; atractivo
para las plagas para su ingestión; facilidad de matar y fijar sin
dañar la toxina, y similares. Otras consideraciones incluyen
facilidad de formulación y manipulación, aspectos económicos,
estabilidad de almacenamiento, y similares.
Crecimiento de las células. Las células
huésped que contienen el gen o genes insecticidas B.t.
pueden crecerse en cualquier medio de nutrientes conveniente, donde
las construcciones de DNA proporcionan una ventaja selectiva,
proporcionando, para un medio selectivo, que sustancialmente todas o
todas las células retengan el gen de B.t. Estas células
pueden también cosecharse de acuerdo con los medios convencionales.
Alternativamente, las células pueden tratarse antes de
cosecharse.
Las células B.t. que producen las toxinas
de la invención pueden cultivarse usando medios estándar de la
técnica y técnicas de fermentación. Tras la terminación del ciclo
de fermentación, las bacterias se pueden cosechar separando primero
esporas y cristales del caldo de fermentación por medios bien
conocidos en la técnica. Las esporas de B.t. y los cristales
recuperados se pueden formular en un polvo humedecible, líquido
concentrado, gránulos u otras formulaciones por la adición de
tensioactivos, dispersantes, vehículos inertes, y otros componentes
para facilitar la manipulación y aplicación para plagas particulares
diana. Estas formulaciones y aplicación de procedimientos son bien
conocidas en la técnica.
Formulaciones. Los gránulos cebo
formulados contienen un atrayente y esporas, cristales, y toxinas
de los aislados de B.t., o microbios recombinantes que
comprenden los genes obtenibles de los aislados de B.t.
descritos en el presente documento se pueden aplicar al suelo. Los
productos formulados pueden aplicarse también como un recubrimiento
de semillas o tratamiento de la raíz o tratamiento total de la
planta en los estados finales del ciclo de cultivo. Los
tratamientos de las plantas y del suelo de las células B.t.
se pueden emplear como polvos humedecibles, gránulos o polvos,
mezclando con varios materiales inertes, tales como minerales
inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y
similares) o materiales botánicos (mazorcas pulverizadas, vainas de
arroz, cáscaras de nuez, u similares). Las formulaciones pueden
incluir coadyuvantes pegajosos pulverizados, agentes
estabilizadores, otras aditivos de pesticidas, o tensioactivos. Las
formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosos y
emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados
emulsificadores, o similares. Los ingredientes pueden incluir
agentes reológicos, tensioactivos, emulsificadores, dispersantes, o
polímeros.
Como se apreciará por una persona experta en la
técnica, las concentración de pesticidas variará ampliamente
dependiendo de la naturaleza de la formulación particular,
particularmente si es un concentrado o si se usa directamente. El
pesticida estará presente en al menos un 1% en peso y pueden ser el
100% en peso. Las formulaciones en seco tendrán de aproximadamente
1-95% en peso del pesticida mientras que las
formulaciones líquidas serán generalmente de aproximadamente el
1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las
formulaciones generalmente tendrán de aproximadamente 10^{2} a
aproximadamente 10^{4} células/mg. Estas formulaciones se
administrarán a aproximadamente 50 mg (líquidos o en seco) a 1 kg o
más por hectárea.
Las formulaciones se pueden aplicar al ambiente
de los lepidópteros, por ejemplo, follaje o suelo, mediante
pulverización, espolvoreamiento, rociado, o similares.
La cromatografía en columna NACS (Bethesda
Research Labs, Gaithersburg, MD) se usó para la purificación de DNA
electroeluído. Se lleva a cabo de acuerdo con las instrucciones del
fabricante, excepto en que las tampones se modificaron a 0,5X
TBE/2,0 M de NaCl para la unión, y 0,5X TBE/2,0 M NaCl para la
elución.
El marcado aleatorio del cebado de DNA con
\alpha-[^{32}P]dATP se hizo con un kit
(Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN)
de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
La purificación de gel se refiere a la aplicación
secuencial de la electroforesis en gel de
agarosa-TBE, electroelución, y cromatografía en
columna NACS para la purificación de los fragmentos de DNA
seleccionados, procedimientos los cuales son bien conocidos en la
técnica.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se
hizo durante 25 ciclos de un ciclador termal de Perkin Elmer
(Norwalk, CT) con los siguientes parámetros de ciclo: 94ºC durante
1 minuto, 37ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 3 minutos (cada
ciclo a 72ºC tiene una extensión temporal de 5 segundos). El
producto de la PCR del DNA fue la proteasa K tratada para mejorar
la eficacia de la clonación (Crowe, J.S., Cooper, H.J., Smith,
M.A., Sims, M.J., Parker, D., Gewert, D. [1991] Nucl. Acid.
Res. 19:184).
Los oligodeoxiribonucleótidos (oligonucleótidos)
se sintetizaron en un sintetizador de DNA de Applied Biosistems
(Foster City, CA) modelo 1381A. La purificación se hizo con
columnas Nensorb (New England Nuclear-Dupont,
Wilmington, DE) si fue necesario, de acuerdo con las instrucciones
del fabricante.
La electroporación de Pseudomonas
fluorescens se hizo con células en fase de crecimiento
logarítmico en medio LB (caldo-L) a 30ºC en un
agitador rotatorio. Las células se lavaron entonces de 2 a 3 veces
con agua helada estéril destilada y concentrada a 0,03x de su
volumen de partida en agua destilada. El DNA en
1-20 \mul se mezcló con 50-300
\mul de células. Los parámetros seleccionados para el Biorad Gene
Pulser (Bio-Rad, Richmond, CA) fueron 100 ohmios,
25 microfaradios, y 2,25 kilovoltios en una cubeta con un espacio
entre electrodos de 0,2 cm. Siguiendo a la electroporación, se
añadió un mililitro de LB y las células se mantuvieron en hielo
durante al menos 2 minutos. Las células se incubaron después
durante entre 2 horas y toda una noche a 30ºC sin agitación.
La expresión de la toxina de B.t. en P.
fluorescens se hizo en el medio recomendado que se encuentra en
el Manual of Methods for General Bacteriology (P.Gerhardt
y col., 1981, American Society for Microbiology, Washington,
D.C). El glicerol se sustituyó por la glucosa. La receta se hizo con
agua del grifo y el pH se ajustó a 7,2. Los matraces de semillas se
hicieron a partir de medio LB. Las siguientes recetas se
aplicaron:
Medio base (para 1
litro)
| glicerol | 65 g |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 1,0 g |
| Na_{2}HPO_{4} | 5,24 g |
| KH_{2}PO_{4} | 2,77 g |
| Extracto de levadura | 5,0 g |
| Ácidos casamino | 1,0 g |
Metales 44 (para 100
ml)
| EDTA | 250 mg |
| ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O | 1095 mg |
| FeSO_{4}\cdot7H_{2}O | 500 mg |
| MnSO_{4}\cdot7H_{2}O | 154 mg |
| CuSO_{4}\cdot7H_{2}O | 39,2 mg |
| Co(NO_{3})_{2}\cdot6H_{2}O | 24,8 mg |
| Na_{2}B_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O | 17,7 mg |
Añadir una pocas gotas de H_{2}SO_{4}6 N para
retardar la precipitación.
Mezcla mineral de Huntner (para 1
litro)
| Ácido nitriloacético (disuelto en y neutralizado con KOH) | 10 g |
| MgSO_{4}\cdot7H_{2}O | 14,45 g |
| CaCl_{2}\cdot2H_{2}O | 3,33 g |
| (NH_{4})Mo_{7}O_{24}\cdot4H_{2}O | 9,25 g |
| FeSO_{4}\cdot7H_{2}O | 99 mg |
| Metales 44 | 50 ml |
| pH ajustado a 6,6-6,8 |
En la inoculación para el análisis de la
expresión de la toxina de B.t., se añadieron 4 ml de la
mezcla mineral de Huntner por 200 ml de caldo de cultivo. A los
matraces se les dio un inóculo de un 2%, en volumen, de un cultivo
que duró toda una noche. Se dejó crecer a los cultivos durante 24
horas a 32ºC a \geq 200 rpm. En este punto, se indujeron con 0,75
mM de IPTG y se suplementaron con 2 g de extracto de levaduras. Los
geles proteicos se corrieron con muestras recogidas a 48 y 72
horas. La proteína de 130 kDa se cuantificó mediante densitometría
láser.
Los siguientes son ejemplos los cuales ilustran
los procedimientos, incluyendo el mejor modo, para llevar a la
práctica la invención. Estos ejemplos no deberían interpretarse
como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las
proporciones de la mezcla disolvente son en volumen a menos que se
indique lo contrario.
Un vector de clonación se puede construir tomando
como base pTJS260, un plásmido de amplio rango de hospedadores
derivado de RSF1010 (pTJS260 se puede obtener del doctor Donald
Helinski, U.C. San Diego). Un ejemplo del sistema usado en la
construcción del vector se puede encontrar en la solicitud de
patente EPO 0471564. Un gen de CryA(c)CryA(b),
referido en el presente documento como el gen y la toxina 436, se
describe en la patente de los Estados Unidos Nº. 5.055.294. Un
plásmido designado pMYC1050 contiene el gen 436. El pMYC1050 se
construyó por reclonación del gen de la toxina y el promotor de
pM3.130-7 (descrito en la patente de los Estados
Unidos Nº. 5.055.294) dentro de un vector basado en pTJS260
(descrito en la patente de los Estados Unidos Nº. 5.169.760) por
procedimientos bien conocidos en la técnica. En particular, el
promotor de pM3.130-7 y el gen de la toxina se
pueden obtener como un fragmento de BamHI a NdeI y
situarse dentro del plásmido pMYC467 reemplazando un fragmento
unido por los mismos sitios (BamHI cerca de la base 12100 y
NdeI cerca de la base 8000).
El vector mejorado contiene idealmente un único
sitio de clonación de BamHI. El sitio BamHI del
plásmido, localizado cadena arriba del promotor
tac(Ptac), se puede eliminar mediante despunte con
Klenow y religamiento (figura 1). La ausencia del sitio se puede
confirmar mediante digestión con enzimas de restricción. Un
plásmido producido de acuerdo con este procedimiento se llamó
pMYC1050\DeltaBamHI. La construcción puede tener ahora un
sitio BamHI añadido al plásmido mediante mutagénesis SOE. La
mutagénesis SOE se podrá facilitar subclonando un fragmento de DNA
NsiI que contiene toxina dentro del vector más pequeño pGEM5
(Promega Corp., Madison, WI) el cual usa el gen de resistencia a
ampicilina (bla) como un marcador de selección (figura 1).
El fragmento puede estar orientado por digestión de restricción. Un
plásmido producido de acuerdo con este procedimiento se llamó
pGEMtox.
El DNA en la región codificadora de la toxina
puede mutarse mediante la técnica de SOE mediada por PCR para
introducir sitios de clonado de enzimas de restricción como se
muestra en la figura 2. Los oligonucleótidos útiles como cebadores
se muestran a continuación:
"A"(SEQ ID Nº. 1)
5' GCATACTAGTAGGAGATTTCCATGGATAACAATCCGAAC
3'
"B"(SEQ ID Nº. 2)
5' GGATCCGCTTCCCAGTCT
3'
"C"(SEQ ID Nº. 3)
5' AGAGAGTGGGAAGCGGATCCTACTAATCC
3'
"D"(SEQ ID Nº. 4)
5' TGGATACTCGATCGATATGATAATCCGT
3'
"E"(SEQ ID Nº. 5)
5' TAATAAAGAGCTCCTATGT
3'
"F"(SEQ ID Nº. 6)
5' TATCATATCGATCGATCGAGTATCCAATTTAG
3'
"G"(SEQ ID Nº. 7)
5' GTCACATAGCCAGCTGGT
3'
El DNA pMYC1050 se usó como la plantilla para la
amplificación de PCR usando los grupos de cebadores A/B, C/D, E/D,
y F/G. Los fragmentos anticipados de DNA se llamaron AB, CD, ED, y
FG. Los DNA amplificados se purificaron mediante gel de
electroforesis de agarosa-TBE, electroelución, y
cromatografía en columna NACS, procedimientos todos bien conocidos
en la técnica. Los DNA plantilla purificados se usaron en un
segundo grupo de reacciones de PCR. Los fragmentos AB y CD se
mezclaron y amplificaron con los cebadores A y D. En una reacción
separada, los fragmentos ED y FG se mezclaron y amplificaron con los
cebadores E y G. El DNA amplificado se resolvió mediante
electroforesis en gel de agarosa-TBE y los
fragmentos con el correspondiente incremento en tamaño se
escindieron, electroeluyeron, y purificaron sobre columnas NCAS por
medios bien conocidos en la técnica. Los fragmentos de DNA se
llaman AD o EG por referencia.
Los fragmentos de DNA AD o EG con los nuevos
sitios de enzimas de restricción se incorporaron dentro del DNA que
contiene toxina por varios procedimientos de subclonado (figuras 2
y 3). pGEMtox se digirió con ClaI o HindIII. El DNA
conteniendo vector se purificó mediante gel. El fragmento de DNA se
digirió con ClaI y se ligó al vector de DNA pGEMtox digerido
con HindIII. La cepa de E. coli NM522 se transformó
con mezclas de ligazón. Las construcciones correctamente
ensambladas se identificaron por digestión con enzimas de
restricción del plásmido de DNA de colonias aisladas. El plásmido
con el nuevo sitio BamHI se llamó pGEMtox BamHI. El
plásmido con el nuevo sitio PvuI se llamó pGEMtox
PvuI. El fragmento ClaI que contiene el sitio
BamHI del plásmido pGEMtox BamHI se ligó al fragmento
ClaI fosfatado que contiene el vector de pGEMtox
PvuI. La cepa de E. coli NM522 se transformó con mezclas
de ligazón. Las construcciones correctamente ensambladas se
identificaron por análisis con PCR con el grupo de cebadores C/D, y
por la digestión de restricción. El plásmido con ambos sitios de
enzimas restricción nuevos se llamó pGEMtox
BamHI/PvuI.
Un vector de expresión completo se ensambló con
un inserto de pGEMtox BamHI/PvuI y un vector de
pMYC1050\Delta
BamHI (figuras 3 y 4). Se preparó un inserto purificado por gel a partir de pGEMtox BamHI/PvuI mediante digestión con NsiI, y digestión con ScaI (para eliminar el vector contaminante). Se ligó al vector purificado mediante gel digerido con NsiI que contiene DNA de pMYC1050\DeltaBamHI. La cepa de E. coli NM522 se transformó con mezclas de ligazón, y las mezclas de transformación se plaquearon en agar con medio LB conteniendo tetraciclina a 12 \mug/ml. Las colonias que contienen el inserto NsiI se identificaron por hibridación de colonia y autorradiografía. Los insertos se orientaron mediante PCR, usando el primer grupo de cebadores A/D, los cuales rellenan un sitio de clonación de NsiI, y la electroforesis en gel de agarosa-TBE. El plásmido ensamblado correctamente se llama pMYC2224. Las secuencias de DNA y proteicas de la toxina se encuentran en las SEQ ID Nº^{s}. 18 y 19, respectivamente. Una cepa de P. fluorescens inducible por lactosa se sometió a electroporación con DNA plasmídico correctamente ensamblado. Las mezclas de transformación se plaquearon en agar con medio LB conteniendo tetraciclina a 20 \mug/ml. El plásmido de DNA se preparó a partir de P. fluorescens para su uso en los subsiguientes experimento de clonaje.
BamHI (figuras 3 y 4). Se preparó un inserto purificado por gel a partir de pGEMtox BamHI/PvuI mediante digestión con NsiI, y digestión con ScaI (para eliminar el vector contaminante). Se ligó al vector purificado mediante gel digerido con NsiI que contiene DNA de pMYC1050\DeltaBamHI. La cepa de E. coli NM522 se transformó con mezclas de ligazón, y las mezclas de transformación se plaquearon en agar con medio LB conteniendo tetraciclina a 12 \mug/ml. Las colonias que contienen el inserto NsiI se identificaron por hibridación de colonia y autorradiografía. Los insertos se orientaron mediante PCR, usando el primer grupo de cebadores A/D, los cuales rellenan un sitio de clonación de NsiI, y la electroforesis en gel de agarosa-TBE. El plásmido ensamblado correctamente se llama pMYC2224. Las secuencias de DNA y proteicas de la toxina se encuentran en las SEQ ID Nº^{s}. 18 y 19, respectivamente. Una cepa de P. fluorescens inducible por lactosa se sometió a electroporación con DNA plasmídico correctamente ensamblado. Las mezclas de transformación se plaquearon en agar con medio LB conteniendo tetraciclina a 20 \mug/ml. El plásmido de DNA se preparó a partir de P. fluorescens para su uso en los subsiguientes experimento de clonaje.
Un fragmento de DNA que contiene la región
hipervariable de Cry(pMYC1260) se intercambió por el
fragmento de DNA BamHI-PvuI conteniendo toxina de
pYC2224 (figura 4). Dado que la secuencia codificante contiene un
sitio BamHI preexistente, se escogió Bg/II para clonar. Las
4 bases salientes de BamHI y Bg/II son compatibles,
permitiendo la ligazón mientras eliminaron varios sitios de la
unión. Fue necesario sintetizar un nuevo primer para PCR:
"L" (SEQ ID Nº. 8)
5' GAGTGGAACAGATCTTAATAATGCACAATAAGG
3'
Un fragmento de DNA que contiene toxina se generó
con cebadores L/D en el pMYC2160 plantilla. El DNA se digirió con
BglII y PvuI para subclonarse. Partiendo de que el
locus tetAR contiene múltiples sitios PvuI, es
necesario aislar el vector que contiene DNA en dos fragmentos
separados. Para obtener el primer fragmento, se digirió pMYC2224
con BamHI x BstEII, y el fragmento grande de DNA que
contiene las funciones de locus-rep
Ptac-tetAR se purificó mediante gel. Para
obtener el segundo fragmento, se digirió pMYC2224 con BstEII
x PvuI, y el fragmento de DNA que contiene el módulo
vector-protoxina se purificó mediante gel. Se creó y
usó una ligazón de tres piezas para la transformación de E.
coli NM522. Los plásmidos, correctos en general, se
identificaron por un análisis mediante PCR y electroforesis en gel
de agarosa-TBE, usando el primer grupo N/O, el cual
rellena el empalme de fusión de BamH/BglII.
"N" (promotor tac) (SEQ ID Nº. 9)
5'TTAATCATCGGCTCGTA
3'
"O" (SEQ ID Nº. 10)
5' ACTCGATCGATATGATA(GA)TCCGT
3'
El plásmido correcto se llamó pMYC2239. Consiste
en CryIA(c) en el aminoterminal, CryIF hasta el empalme
toxina/protoxina, y CryIA(c) a través del segmento
protoxina. La toxina de DNA y las secuencias de proteínas están en
SEQ ID Nº^{s}. 20 y 21, respectivamente.
El gen clonado de la toxina CryIF se puede
modificar por la expresión de P. fluorescens en el siguiente
camino:
1. Un plásmido que contiene las secuencias de
terminación pKK223-3 rrnB en el vector derivado de
pTJS260 (doctor Donald Helinski, U.C. San Diego) puede fabricarse
ligando el fragmento BamHI-ScaI que contiene el
promotor Ptac y el terminador rrnB de
pKK223-3 (Pharmacia, vector E. coli) dentro del
BamHI al fragmento vector de pMYC1197 (descrito en el
documento EP 0 417 564) despuntado por KpnI. El plásmido
ensamblado se recupera a continuación de la transformación de E.
coli y crece bajo selección con tetraciclina.
2. Un plásmido que contiene el gen de la toxina
promovida por Ptac puede hacerse ligando el fragmento
NdeI- Nde-I que contiene el gen (con los extremos
despuntados usando DNA polimerara y dNTPs) de la toxina de
aproximadamente 3800 pares de bases de pMYC1603 (partiendo de NRRL
B-18517) dentro de los sitios despuntados por
EcoRI y HindIII de pKK223-3. El
plásmido de la toxina CryIF promovida por Ptac puede
recuperarse tras la transformación de E. coli, crecimiento
bajo selección con ampicilina, y rastreo de plásmidos con insertos
en la orientación adecuada para la expresión del promotor
Ptac mediante técnicas bien conocidas en la técnica.
3. La toxina CryIF promovida por Ptac
puede ensamblarse dentro del vector derivado de pTJS260 en una
ligazón de tres piezas usando el fragmento de 2,4 kb de DNA que
tiene extremos BamHI y ApaI del plásmido pTJS260, el
fragmento de ApaI a HindIII de 8,5 kb que contiene la
región de replicación del plásmido de la etapa I mencionada
anteriormente en este documento, y un fragmento de HindIII
al fragmento parcial BamHI que contiene el promotor
Ptac y el gen CryIF de la toxina de la etapa 2 mencionada
anteriormente en este documento.
El plásmido que expresa de la toxina CryIF
derivada de pTJS260 resultante (pMYC1260) se pueden introducir
dentro de P. fluorescens por lectroporación.
4. pMYC2047 puede construirse ligando un
fragmento de SpeI a KpnI obtenido por PCR de una
plantilla CryIF adecuada con cebadores H y K, seguido de digestión
con SpeI y KpnI y purificación en gel, un fragmento
de ApaI a SpeI de alrededor de 2600 pared de bases a
partir de pMYC1197 que contiene el promotor Ptac. La
expresión correcta de los plásmidos de la toxina CryIF se determinó
por la digestión con enzimas de restricción de los plásmidos
seguidos por electroporación dentro de Pseudomonas
fluorescens.
El segmento CryIA(c) en el extremo
aminoterminal se puede reemplazar mediante la secuencia codificante
de CryIF mediante un simple, sencillo intercambio (figura 5). Tanto
el locus tetAR como la secuencia codificante CryIF
contiene un sitio ApaI. Un pequeño fragmento ApaI
contiene una parte de los genes tetAR y el extremo
aminoterminal de CryIF se puede aislar a partir de pMYC2047 y
ligarse al fragmento grande ApaI que contiene un vector de
pMYC2239. Una cepa de de P. fluorescens inducible por
lactosa puede someterse a electroporación con la mezcla de ligazón
y plaqueado en medio LB con agar que contiene tetraciclina a 20
\mug/ml. Las cepas inducibles por lactosa se conocen por aquellos
expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente
de los Estados Unidos Nº. 5.169.760. La correcta orientación del
fragmento ApaI reconstituye la resistencia a tetraciclina.
Un clon producido de esta manera muestra ser generalmente correcto
por digestión con enzimas de restricción, y se llamó pMY2244. La
secuencia de DNA de la toxina se muestra en SEQ ID Nº. 22, y la
secuencia proteica predecida se mostró en SEQ ID Nº. 23.
El uso del codón en Pseudomonas spp.
favorece G o C en la posición balanceante de los tripletes
codones, como se determinó por análisis de genes en las librerías
de secuencias del GenBank/EMBL. Una región limitada del gen CryIF
se reprocesó mediante SOE para incorporar los cambios en las
posiciones balanceantes que son silentes (figura 6). Los oligos
usados se muestran a continuación:
"H" (SEQ ID Nº. 11)
5' GGACTAGTAAAAAGGAGATAACCATGGAAAATAATATTCAAAATC
3'
"I" (SEQ ID Nº. 12)
5'
TCCAGCGGCAGGCGGCCGGTGCTGCTGCGTTCTTCGTTCAGTATTTCTACTTCAGGATTATTTAAAC
3'
"J" (SEQ ID Nº. 13)
5'
AACGCAGCAACCGGCCGCCTGCCGCTGGACATCAGCCTGAGCCTTACACGTTTCCTTTTGAGTGAA
3'
"K" (SEQ ID Nº. 14)
5' CATCAAAGGTACCTGGT
3'
Dos reacciones separadas de PCR se hicieron sobre
una plantilla pMYC2047 con los grupos de cebadores H/I o J/K. Los
fragmentos de DNA amplificados se llamaron HI o JK. Una segunda
reacción de PCR se dispuso mezclando fragmentos HI y JK y
amplificando con el grupo de cebadores H/K. El DNA SOE mayor se
purificó mediante gel y digirió con SpeI x KpnI. Una
ligazón de tres piezas se dispuso con el locus de DNA
SpeI-ApaI Ptac-tetAR,
el módulo vector del DNA de la protoxina entre
ApaI-KpnI, y el DNA amplificado con PCR entre
SpeI-KpnI. Una cepa inducible por lactosa de P.
fluorescens puede someterse a electroporación con la mezcla de
ligazón. Los clones correctos en general, pueden identificarse por
análisis con PCR usando el grupo de cebadores P/Q y la
electroforesis en gel de agarosa-TBE. El oligo P
(SEQ ID Nº. 15) se diseñó para discriminar entre el gen de tipo
salvaje y el gen con codón reprocesado.
"P" (SEQ ID Nº. 15)
5' TGCCGCTGGACATCAGCCTGAG
3'
"Q" (SEQ ID Nº. 16)
5'
TCTAGAGCGGCCGCTTATAC(CT)CGATCGATATGATA(GA)TCCGT
3'
El plásmido completo se llamó pMYC2243. La
secuencia de DNA de la toxina se muestra en SEQ ID Nº. 24. La
secuencia de la proteína toxina se predice que es invariable, y se
muestra en SEQ ID Nº. 25.
La construcción se ensambló (figura 7) usando la
misma estrategia de intercambio del fragmento ApaI como se
describió para pMYC2244 (CryIF/CryIA(b)) anteriormente en
este documento. El pequeño fragmento de DNA del locus de la
toxina-tetAR se purificó mediante gel a partir de pMYC2243.
El mayor fragmento ApaI vector del módulo de protoxina se
purificó mediante gel a partir de pMYC2244. El plásmido completo se
llamó pMYC2523. El DNA predicho y las secuencias de proteína están
en SEQ ID Nº^{s}. 26 y 27, respectivamente.
La expresión de toxinas en P. fluorescens
se analizó como se describe anteriormente en este documento. A 24 y
48 horas tras la inducción, la cepa que contiene pMYC2523 produjo
más toxina que la cepa que contiene pMYC2244. La actividad
específica de toxina en Spodoptera exigua fue
estadísticamente invariable.
Un segundo tipo de toxina quimérica se ensambló
sustituyendo el módulo de la protoxina 436 por la protoxina
CryIA(b) en pMYC2523 figura 8). La secuencia de la protoxina
436 consta de la secuencia CryIA(c) excepto en zonas muy
próximas el extremo C-terminal (véanse las patentes
de los Estados Unidos Nº^{s}. 5.128.130 y 5.169.760, incorporadas
en el presente documento mediante referencias en su totalidad). El
DNA de la protoxina para su clonación se generó por PCR con el
grupo de cebadores F/M usando un plásmido tal como pMYC467 (patente
de los Estados Unidos Nº. 5.169.760) como una plantilla:
"M" (SEQ ID Nº. 17)
5' AGGCTTCCATAGACCTTGTGCG
3'
El DNA obtenido mediante PCR se sometió a
digestión con PvuI x BstEII. Se dispuso una ligazón
de tres piezas con el DNA de la toxina SpeI-PvuI de
pMYC2523, el vector de DNA SpeI-BstEII de pMYC2523,
y el DNA módulo de DNA de la protoxina PvuI-BstEII
PCR. Una cepa inducible por lactosa de P. fluorescens se
sometió a electoporación con la mezcla de ligazón. Los plásmidos
correctos en general, se identificaron mediante PCR con el grupo de
cebadores F/G y rastreo de incrementos pequeños en tamaño mediante
electroforesis en gel de agarosa-TBE. La
construcción se llamó pMYC2254. El DNA y las secuencias de proteínas
predecidas se encuentran en SEQ ID Nº^{s}. 28 y 29,
respectivamente.
La expresión de toxinas en P. fluorescens
se analizó y describió anteriormente en este documento. La
expresión de toxinas de pMYC2254 se mejoró sobre la expresión de
pMYC2243.
Veinticuatro Heliothis zea en su primer
instar larvario se expusieron a dieta de agar que contenía varias
concentraciones de toxina. A los 7 días tras el tratamiento, los
ensayos se graduaron por inhibición del crecimiento. Las larvas se
inhibieron si la muda del primer al segundo instar se inhibió. Los
cálculos para estimar el factor de sinergia (SF) y la actividad
esperada (E[exp]) se muestran a continuación.
SF =
E(obs)/E(exp)
donde,
SF = factor de sinergia
E(obs) = mortalidad observada
E(exp) = mortalidad esperada
E(exp) = a + b -
(ab/100)
donde,
a = actividad del compuesto A
b = actividad del compuesto B
| % de Inhibición | |||||
| CryIF/CryA(b) | CryIA(c)/CryA(b) | 1:1 mezcla de las dos toxinas quiméricas | |||
| Tasa \mug toxina/ | A | b | E(exp) | E(obs) | SF |
| g de dieta | |||||
| 50,0 | - - | - - | 50 | 78 | 1,6 |
| 25,0 | 13 | 23 | 22 | 62 | 2,8 |
| 12,5 | 9 | 14 | 22 | 31 | 1,4 |
| 6,25 | 9 | 14 | - - | - - | - - |
| Un SF mayor que 1 indica sinergia (Levy, Y., Benderly, Y. Cohen, U. Gisi, D. Bassard [1986] Bulletin OEPP/ | |||||
| EPPO Bulletin 16: 651-657). | |||||
| Abbott, W.S. (1925) J. Economic Entomology 18: 265-267. |
Veinticuatro Heliothis zea en su primer
instar larvario se expusieron a dieta de agar que contenía varias
concentraciones de toxina. A los 7 días tras el tratamiento, los
ensayos se graduaron por inhibición del crecimiento. Las larvas se
inhibieron si la muda del primer al segundo instar se inhibió. Las
dosis requeridas para inhibir el 50% de las poblaciones (ED_{50})
se estimularon usando técnicas de análisis estándar de probit. Los
cálculos para estimar el factor de sinergia (SF) y las dosis
efectivas esperadas se muestran a continuación:
SF =
ED(exp)/ED(obs)
donde,
ED(exp) = dosis efectiva esperada de una
muestra
ED(obs) = dosis efectiva observada de una
muestra
ED(exp) = (a +
b)/a/ED_{A} +
b/ED_{B}
donde,
a = proporción de un compuesto A en la mezcla
b = proporción de un compuesto B en la mezcla
ED_{A} y ED_{B}= dosis igualmente efectivas
de A y B en la mezcla.
| ED(obs) | ED(exp) | |||
| Tratamiento | (\mug toxina/g dieta) | SF | ||
| CryIA(c)/CryIA(b) | (A) | 36 | - - | - - |
| CryIF/CryIA(b) | (B) | 135 | - - | - - |
| A:B (1:1) | 21 | 57 | 2,6 | |
| A:B (3:1) | 14 | 44 | 3,1 | |
| A:B (1:3) | 35 | 80 | 2,3 | |
| Un SF mayor que 1 indica sinergia (Levy y col. [1986], supra). | ||||
| [CITE para el procedimiento Wadley] |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
| Nombre del solicitante: | MYCOGEN CORPORATION |
| Domicilio: | 5501 Oberlin Drive |
| Ciudad: | San Diego. |
| Estado/provincia: | California |
| País: | Estados Unidos. |
| Código postal/zip: | 92121 |
| Número de teléfono: | (619) 453-8030 \hskip0.5cm Número de fax: (619) 453-6991 |
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones novedosas de pesticidas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 34
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DOMICILIO POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CONSIGNATARIO: David R. Saliwanchik
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2421 N.W. calle 41ª, suite A-1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Gainesville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: FL
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 32606
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MEDIO TIPO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: patentin, release #1.0, versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA PRESENTACION:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Saliwanchik, David R.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO. 31.794
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/Nº EXPEDIENTE: MA86
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 904-375-8100
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 904-372-5800
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº. 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATACTAGT AGGAGATTTC CATGGATAAC AATCCGAAC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCGCTT CCCAGTCT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAGAGTGGG AAGCGGATCC TACTAATCC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGATACTCG ATCGATATGA TAATCCGT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATAAGAGC TCCTATGT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATCATATCG ATCGAGTATC CAATTTAG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCACATAGC CAGCTGGT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGTGGGAAG CAGATCTTAA TTATGCACAA TTAAGG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTAATCATCG GCTCGTA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTCGATCGA TATGATARTC CGT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACTAGTAA AAAGGAGATA ACCATGGAAA ATAATATTA AAATC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCAGCGGCA GGCGGCCGGT GCTGCGTTCT TCGTTCAGTA TTCTA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTC AGGATTATTTAAAC
\hfill64
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGCAGCAC CGGCCGCCTG CCGCTGGACA TCAGCCTGAG CCTTA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGT TTCCTTTTGA GTGAA
\hfill65
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCAAAGGT ACCTGGT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCCGCTGGA CATCAGCCTG AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTAGAGAGCGG CCGCTTATAC YCGATCGATA TGATARTCCG T
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGCTTCCAT AGATACCTTG TGCG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3465 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1155 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3450 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1150 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3444 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1148 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3522 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3444 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1148 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3522 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Ile Asp Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1155 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1182 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 34:
Claims (10)
1. Una composición para controlar las plagas de
lepidópteros, que comprende una proteína que contiene una toxina
núcleo quimérica CryIF y una proteína que contiene una toxina núcleo
quimérica CryIA(c), o células que expresen estas
proteínas.
2. La composición de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que la proteína que contiene una toxina
núcleo quimérica CryIF comprende una parte de proteína núcleo CryIF
N-terminal y una parte C-terminal
heteróloga de toxina de una toxina CryIA(b) o de una toxina
quimérica CryIA(b)/CryIA(c).
3. La composición de acuerdo con la
reivindicación 2, en la que la proteína que contiene una toxina
núcleo quimérica CryIF tiene de 1150 a 1200 aminoácidos, la
secuencia núcleo N-terminal de CryIF tiene de 590 a
1100 aminoácidos y la parte protoxina de CryIA(b) o
CryIA(c)/CryIA(b) comprender de al menos 100
aminoácidos en el extremo C-terminal de dicha
proteína.
4. La composición de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que la transición de la parte de toxina
núcleo CryIF N-terminal a la parte protoxina
heteróloga ocurre después de la SEQ ID Nº. 30 y antes del final de
la SEQ ID Nº. 31.
5. La composición de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que la parte de toxina núcleo comprende
aproximadamente los primeros 601 aminoácidos de una toxina CryIF, y
la parte C-terminal protoxina comprende la secuencia
de aminoácidos de CryIA(b) o CryIA(c)/ CryIA(b)
que sigue a la SEQ ID Nº. 31.
6. La composición de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que la proteína que contiene la toxina
núcleo comprende esencialmente la SEQ ID Nº. 23, SEQ ID Nº. 29, o la
secuencia que se muestra en la figura 9.
7. La composición de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente en la que la proteína que contiene una
toxina núcleo quimérica CryIA(c) comprende esencialmente la
SEQ ID Nº. 34.
8. Células que expresan ambas proteínas definidas
en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Células de acuerdo con la reivindicación 8,
las cuales expresan la SEQ ID Nº. 23 o la SEQ ID Nº. 29, y también
la SEQ ID Nº. 34.
10. Un procedimiento para controlar las plagas de
lepidópteros, que comprende poner en contacto a las plagas o su
ambiente con una composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, o células de acuerdo con la reivindicación 8
o la reivindicación 9.
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