CN105247056A - Acc脱氨酶表达的调节 - Google Patents

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Abstract

本发明的方法和组合物包括用于变更植物中的乙烯生成和胁迫响应的ACC脱氨酶核酸及它们的编码蛋白。重组表达盒、宿主细胞和转基因植物包含构建体。该脱氨酶的氨基酸序列可进行变更以修饰酶功能。ACC脱氨酶可来自玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodia？maydis)，并且宿主植物可为玉蜀黍。

Description

ACC脱氨酶表达的调节
技术领域本发明概括地讲涉及植物分子生物学。更具体地讲，它涉及核酸和用于调节核酸在植物中的表达的方法。
背景技术
植物激素，包括生长素、乙烯、脱落酸、细胞分裂素和赤霉素，由于对植物生命的多种多样和复杂的作用而令人感兴趣。
乙烯(C2H4)是影响植物中的多个发育过程和适应性响应的气态植物激素，所述发育过程和适应性响应包括发芽、花和叶衰老、果实成熟、叶或果实脱落、根结瘤、程序性细胞死亡以及对胁迫和病原体攻击的响应性。另外的乙烯影响包括水生植物的茎延伸、根中气室(通气组织)的发育、叶偏上弯曲、茎和苗膨大(与发育迟缓相关)、枯萎中的雌性特征、某些物种中的果实生长、黄化苗中的顶端弯钩闭合、根毛形成、凤梨科(Bromeliaceae)的开花、黄化苗的横生以及基因表达(如，聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、几丁质酶或β1，3-葡聚糖酶)的增加。这些效应有时受到其他植物激素、其他生理信号及生物环境和非生物环境的影响。
乙烯通过成熟果实释放，还通过大多数植物组织产生，例如响应胁迫(如，干旱、拥挤、病原体攻击、温度胁迫、创伤等)而产生，以及在成熟和衰老器官中产生。遗传筛选鉴别了十几个涉及植物中乙烯响应的基因。
乙烯由确定的途径从甲硫氨酸产生，该途径涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或AdoMet)转化为环状氨基酸1-氨基环丙烷-1-甲酸(ACC)，该转化由ACC合酶推进。然后通过ACC氧化酶的作用由ACC的氧化产生乙烯。或者，ACC可通过ACC脱氨酶的作用转化为α-酮丁酸和氨。
对于调节植物中的乙烯生成及其响应途径以便操纵植物发育或胁迫响应，一直存在着需求。本发明涉及真菌、细菌和植物(例如拟南芥)ACC脱氨酶序列以及它们在植物中通过去除乙烯合成途径的关键组分而降低乙烯生成的用途。本发明包括多核苷酸序列、表达构建体、载体、植物细胞和所得的植物。在另一个实施方案中，公开了用于提高植物的产量或干旱耐受性的方法，所述植物包含具有提高的或降低的ACC脱氨酶活性的变体ACC脱氨酶序列。参考以下内容，本发明的这些和其他的特征将变得显而易见。
发明内容
本发明设想到以下实施方案：
本发明的实施方案1提供一种编码ACC脱氨酶多肽的分离多核苷酸，所述ACC脱氨酶多肽包含与选自SEQIDNO：2、8、10的多肽序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Tyr307变更为Ala307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。实施方案2是实施方案1的分离多核苷酸，其还包含植物可表达的调节元件。
实施方案3是一种包含与选自SEQIDNO：1、3-7和9的核苷酸序列具有至少70％至95％同一性的核酸序列的分离多核苷酸。实施方案4是一种编码包含SEQIDNO：8或10的氨基酸序列或与SEQIDNO：8或10具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的分离多核苷酸。实施方案5是一种改进ACC脱氨酶的活性的方法，该方法包括使SEQIDNO：2的氨基酸序列中包含氨基酸变化并评估突变的酶的ACC脱氨酶活性。
实施方案6是一种改进作物植物的非生物胁迫耐受性的方法，该方法包括提高或降低该作物植物中的ACC脱氨酶的活性并将该作物植物在植物栽培环境中栽培，在该栽培环境中该作物植物暴露于非生物胁迫。实施方案7是一种改进作物植物的干旱耐受性的方法，该方法包括提高玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodiamaydis)ACC脱氨酶基因在该作物植物中的表达并将该作物植物在植物栽培环境中栽培，在该栽培环境中该作物植物暴露于干旱胁迫。
实施方案8是一种提高作物植物的农学参数的方法，该方法包括提高玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodiamaydis)ACC脱氨酶基因在该作物植物中的表达并将该作物植物在植物栽培环境中栽培，由此提高该农学参数。
实施方案9是实施方案6至8中的任一个实施方案的方法，其中该ACC脱氨酶包含与选自SEQIDNO：1、3-7和9的核苷酸序列具有至少70％至95％同一性的核酸序列。实施方案10是实施方案6至8中的任一个实施方案的方法，其中该ACC脱氨酶包含编码选自SEQIDNO：2、8和10的氨基酸序列或与SEQIDNO：2、8和10之一者具有至少70％至95％同一性的序列的核酸序列，并且其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Tyr307变更为Ala307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。实施方案11是一种耐受非生物胁迫的转基因玉蜀黍植物，该植物在其基因组中包含重组核酸，该重组核酸包含编码选自SEQIDNO：2、8和10的多肽的多核苷酸，并且其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Tyr307变更为Ala307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。实施方案12是实施方案11的玉蜀黍植物，其中该非生物胁迫是干旱、低氮、热或盐。实施方案13是实施方案11的玉蜀黍植物，其中该重组核酸编码包含SEQIDNO：8或10的多肽。实施方案14是一种从实施方案11的玉蜀黍植物产生的植物细胞。实施方案15是一种从实施方案11的玉蜀黍植物产生的种子。
实施方案16是一种提高作物植物在干旱条件下的谷粒产量的方法，该方法包括降低作物植物中的乙烯的水平，其中乙烯水平的降低伴随ACC脱氨酶活性的提高或ACC脱氨酶活性的降低，其中该作物植物暴露于干旱胁迫，从而提高该作物植物的谷粒产量。实施方案17是实施方案16的方法，其中该作物植物是玉蜀黍。实施方案18是实施方案16的方法，其中乙烯水平是通过提高编码ACC脱氨酶的基因的表达来降低的，其中该ACC脱氨酶包含编码选自SEQIDNO：2、8和10的多肽的多核苷酸，并且其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Tyr307变更为Ala307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。
实施方案19是一种基因调节构建体，其包含实施方案1或3的多核苷酸。实施方案20是一种载体，其包含实施方案1或3的多核苷酸。
实施方案21是一种调节植物细胞中的乙烯生成或乙烯水平的方法，该方法包括：
(a)将包含与启动子有效连接的ACC脱氨酶多核苷酸的重组构建体引入到植物细胞中；
(b)在植物细胞生长条件下培养该植物细胞；以及
(c)诱导所述多核苷酸的表达长达一段足以调节所述植物细胞中的乙烯合成水平的时间。实施方案22是实施方案21的方法，其中该植物细胞是玉蜀黍细胞。
实施方案23是一种调节植物中的乙烯生成或水平的方法，该方法包括：
a.将包含与启动子有效连接的编码ACC脱氨酶蛋白的多核苷酸的核苷酸构建体引入到植物细胞中；
b.在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；以及
a.从所述植物细胞再生植物；其中所述植物中的乙烯生成或水平得到调节。
实施方案24是一种通过实施方案23的方法产生的转基因植物。实施方案25是实施方案24的转基因植物，其中该植物相对于对照具有降低的乙烯生成。实施方案26是实施方案23的方法，其中该ACC脱氨酶包含编码与选自SEQIDNO：2、8和10的多肽具有70％-95％同一性的多肽的多核苷酸，并且其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Ala307变更为Tyr307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。
实施方案27是实施方案6至8或16中的任一个实施方案的方法，其中该ACC脱氨酶在根偏好的或干旱胁迫诱导的或繁殖组织偏好的或乙烯诱导的或衰老诱导的调节元件的控制下表达。
实施方案28是一种编码ACC脱氨酶多肽的分离多核苷酸，该ACC脱氨酶多肽包含与选自SEQIDNO：2、8和10的多肽序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含至少一个选自以下的氨基酸：Ala308、Ala307、Ala317、Pro49、Ala59、Ala294、Ala297、Ala86、Ala68和Ala76。
附图说明
图1显示壳色单隔孢菌(Diplodia)ACC脱氨酶(ACCD)的定向突变体在大肠杆菌细胞中的相对表达水平，如实施例2中所描述。
序列说明
表1
具体实施方式
定义
应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、属和试剂，因为这些可有所变化。还应当理解，本文所用的术语是仅出于描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制本发明的范围。
除非上下文另外明确规定，否则本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“该蛋白”包括提及一种或多种蛋白以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。除非另外明确指明，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
单位、前缀和符号可以以其国际单位制(SI)接受的形式表示。除非另外指明，否则分别地，核酸以5′至3′取向从左向右书写；氨基酸序列以氨基向羧基取向从左向右书写。在本说明书内叙述的数值范围包括限定该范围的数字并且包括所限定范围内的每个整数。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。除非另外提供，否则本文所用的软件、电气和电子术语如TheNewIEEEStandardDictionaryofElectricalandElectronicsTerms(5thedition，1993)(《新IEEE电气和电子术语标准辞典》，第5版，1993年)中所定义。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。
所谓“扩增”意指构造核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，构建是利用所述核酸序列中的至少一个作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如DiagnosticMolecularMicrobiology：PrinciplesandApplications，Persing，etal.，Ed.，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.(1993)(《诊断分子微生物学：原理和应用》，Persing等人编辑，美国微生物学会，华盛顿哥伦比亚特区，1993年)。扩增的产物称为扩增子。
术语“抗体”包括指涉抗体的抗原结合形式(例如Faba、F(ab)2)。术语“抗体”常指实质上由一种或多种免疫球蛋白基因编码的多肽或其特异性结合并识别被分析物(抗原)的片段。但是，虽然各种抗体片段可根据完整抗体的消化来定义，但是技术人员会认识到，这类片段可用化学法或通过利用重组DNA方法重头合成。因此，本文所用的术语抗体也包括抗体片段如单链FV、嵌合抗体(即包含来自不同物种的恒定区和可变区)、人源化抗体(即包含来自非人来源的互补决定区(CDR))和杂缀合抗体(例如双特异性抗体)。
术语“抗原”包括指涉可针对其产生抗体和/或该抗体对其具有特异性免疫反应性的物质。抗原内的特异性免疫反应性位点被称为表位或抗原决定簇。这些表位可为聚合物构造中的单体(如蛋白质中的氨基酸)的线性阵列，或者由更复杂的二级或三级结构组成或包含更复杂的二级或三级结构。技术人员会认识到，所有免疫原(即能够引起免疫响应的物质)都是抗原；但是，一些抗原如半抗原不是免疫原，但可通过偶联到载体分子而变成具有免疫原性。与特定抗原具有免疫反应性的抗体可在体内产生或者通过重组方法产生，如在噬菌体或类似的载体中选择重组抗体的文库。参见Huseetal.，Science246：1275-1281(1989)(Huse等人，《科学》，第246卷，第1275-1281页，1989年)；及Ward，etal.，Nature341：544-546(1989)(Ward等人，《自然》，第341卷，第544-546页，1989年)；以及Vaughanetal.，NatureBiotech.14：309-314(1996)(Vaughan等人，《自然生物技术》，第14卷，第309-314页，1996年)。
如本文所用，“反义取向”包括指涉以反义链得以转录的取向有效连接至启动子的双链体多核苷酸序列。反义链与内源转录产物充分互补，使得内源转录产物的翻译常常被抑制。
术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列。就特定核酸序列而言，“保守修饰的变体”指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，有几种功能上相同的核酸可编码某种给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子中的任一种而不会变更所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰的变异的一种。本文每个编码多肽的核酸序列还结合遗传密码描述每种可能的核酸沉默变异。
普通技术人员将认识到，可修饰核酸中的每种密码子(AUG除外，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子；UGG也除外，其通常为色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并在本发明的范围内。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列作出的会变更、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的置换、缺失或添加，在该变更导致氨基酸被化学类似的氨基酸所置换时，为“保守修饰的变体”。因而，选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基可被如此变更。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。
保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，对于其天然底物而言，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的六个组各自含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。另参见Creighton，(1984)ProteinsW.H.FreemanandCompany(Creighton，1984年，《蛋白质》，W.H.FreemanandCompany公司出版)。
“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供度量其中已针对目的基因实现了遗传变更(诸如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。
对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即其基因型与用于进行导致产生该受试植物或细胞的遗传变更的起始材料相同的野生型植物或细胞；(b)其基因型与该起始材料相同但已用无效构建体(即用已知对目的性状没有作用的构建体(如包含标志基因的构建体))进行了转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的后代当中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与该受试植物或植物细胞相同但不被暴露于会引发目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于目的基因不被表达的条件下的该受试植物或植物细胞本身。对照植物还可以是用另选的构建体转化的植物。
就指定的核酸而言，所谓“编码”或“被编码的”意指包含据以翻译成指定蛋白的信息。编码蛋白质的核酸可以包含在所述核酸的翻译区内的居间的序列(例如内含子)或可以缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，当核酸在其中表达时，可使用如在一些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)或纤毛虫大核(Macronucleus)中存在的通用密码的变体。当通过合成法制备或变更核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。
例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以体现单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性(Murrayetal.Nucl.AcidsRes.17：477-498(1989)(Murray等人，《核酸研究》，第17卷，第477-498页，1989年)。因此，特定氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
如本文所用，关于特定多核苷酸或其编码的蛋白质的“全长序列”意指具有特定蛋白质的天然(非合成)、内源性、生物活性形式的整个氨基酸序列。确定序列是否为全长的方法是本领域熟知的，包括例如RNA或蛋白质印迹、引物延伸、S1保护和核糖核酸酶保护的示例性技术。参见例如PlantMolecularBiology：ALaboratoryManual，Clark，Ed.，Springer-Verlag，Berlin(1997)(《植物分子生物学：实验室手册》，Clark编辑，施普林格出版社，柏林，1997年)。与已知全长同源(直系同源和/或旁系同源)序列的比较也可用于鉴定本发明的全长序列。另外，通常存在于mRNA的5’和3’未翻译区的共有序列有助于多核苷酸的全长鉴定。例如，共有序列ANNNNAUGG有助于确定多核苷酸是否具有完整的5’末端，其中加下划线的密码子表示N-末端甲硫氨酸。3’末端的共有序列例如聚腺苷酸化序列有助于确定多核苷酸是否具有完整的3’末端。
如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了实质性修饰的核酸。例如，有效连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质性的修饰。
所谓“宿主细胞”意指含有载体并且支持该载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶或双子叶植物细胞。特别优选的单子叶宿主细胞是玉蜀黍宿主细胞。
术语“杂交复合物”包括指涉由相互选择性杂交的两条单链核酸序列形成的双链核酸结构。
所谓“免疫反应性条件”意指这样的条件，其容许与特定表位具有反应性的抗体与该表位结合的程度比该抗体与包含该特定表位的反应混合物中的基本上任何其他表位结合的程度可检测地更大(例如，至少2倍于背景)。免疫反应性条件取决于抗体结合反应的形式并且通常是免疫测定方案中采用的那些条件。有关免疫测定形式和条件的描述，参见HarlowandLane，Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications，NewYork(1988)(Harlow和Lane，《抗体实验室手册》，冷泉港出版社，纽约，1988年)。
在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指涉将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“分离的”指诸如核酸或蛋白之类的物质，该物质：(1)实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。该分离物质任选地包含在其自然环境中不与其一起存在的物质；或者(2)如果该物质处于其自然环境中，则该材料已被通过蓄意人为干预由合成法(非天然地)变更成某种组成和/或被置于细胞中的对于该环境中存在的该物质而言非天然的位置(例如基因组基因座或亚细胞级的细胞器)。该用于产生合成材料的变更可对处于或脱离其天然状态的材料进行。例如，天然的核酸如果通过在其来源细胞内进行的人为干预而被变更，或者如果从已通过在其来源细胞内进行的人为干预而被变更的DNA转录而来，则变成了分离核酸。参见例如“在真核生物细胞中进行定点诱变的化合物和方法”(CompoundsandMethodsforSiteDirectedMutagenesisinEukaryoticCells)，Kmiec，美国专利No.5,565,350；“真核细胞中的体内同源序列靶向”(InVivoHomologousSequenceTargetinginEukaryoticCells)；Zarling等人，PCT/US93/03868。同样，天然的核酸(例如启动子)如果通过非天然手段引入到对其而言非天然的基因组的基因座，则该天然的核酸变成分离的。本文所定义的“分离的”核酸也称为“异源”核酸。
除非另有说明，否则术语“ACC脱氨酶核酸”是本发明的核酸并且意指包含本发明的编码具有ACC脱氨酶活性的ACC脱氨酶多肽的多核苷酸(“ACC脱氨酶多核苷酸”)。“ACC脱氨酶基因”是本发明的基因并且指全长ACC脱氨酶多核苷酸的异源基因组形式。
本文针对特定标志所使用的“定位在由...限定和包括...的染色体区域内”包括指涉染色体的这样的连续长度，该连续长度由指定的标志界定并包括指定的标志。
本文所用的“标志(marker)”包括指涉染色体上的这样的基因座，该基因座用于鉴定该染色体上的独特位置。“多态性标志”包括指涉这样的标志，该标志以多种形式(等位基因)出现，使得不同形式的该标志当以同源对存在时容许该对的染色体中的每条染色体的传播得以监测。基因型可通过使用一个或多个标志进行定义。
如本文所用，“核酸”包括指涉单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且基本上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建在标准的分子生物学参考文献中得以教导，如BergerandKimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology，Vol.152，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(Berger和Kimmel，《酶学方法，分子克隆技术指南》，第152卷，学术出版社，美国加州圣地亚哥)(Berger)；Sambrooketal.，MolecularCloning-ALaboratoryManual，2nded.，Vol.1-3(1989)(Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，第1-3卷，1989年)；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology，F.M.Ausubeletal.，Eds.，CurrentProtocols，ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates，Inc.andJohnWiley&Sons，Inc.(1994)(《分子生物学实验手册》，F.M.Ausubel等人编辑，实验室操作手册，格林出版有限公司和约翰威利父子有限公司合作出版，1994年)。
如本文所用，“有效连接”包括指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般来讲，有效连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
本文所用的术语“植物”包括指涉整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的后代。本文所用的“植物细胞”包括但不限于包含于或分离自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉或小孢子的细胞。可用于本发明的方法中的植物的类别通常与适于转化技术的高等植物的类别一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物在内。特别优选的植物是玉米(Zeamays)。
本文所用的“多核苷酸”包括指具有天然核苷酸的必要性质的脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，它们具有该必要性质是因为它们能在严格杂交条件下杂交至与天然核苷酸会杂交的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，和/或指导翻译成与天然核苷酸(一种或多种)所翻译成的氨基酸(一种或多种)相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指涉指定的序列及其互补序列。因而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是“多核苷酸”(如该术语在本文所意指的)。此外，包含稀有碱基(如次黄嘌呤核苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)(仅举两个例子)的DNA或RNA是多核苷酸(如该术语在本文所用的)。应当理解，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括除了别的以外，简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白/蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的此类类似物的基本性质是，当掺入到蛋白质时，该蛋白质与由相同蛋白质引起产生但全部由天然存在的氨基酸组成的抗体特异性反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质/蛋白”还可以包括如下修饰，包括但不限于：糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟化和ADP-核糖基化。如众所周知并且如上文所指出，应认识到多肽并不总是完全为线性的。例如，多肽可因为遍在蛋白化作用(ubiquitization)而有分支，并且它们通常可因为翻译后事件而呈环状，有或没有分支，所述翻译后事件包括天然加工和不天然发生的由人为操纵造成的事件。环状多肽、分支多肽和分支环状多肽可通过非翻译天然过程合成，以及通过完全合成性质的方法来合成。另外，本发明设想了本发明蛋白质的含甲硫氨酸和少甲硫氨酸的氨基末端变体二者的使用。
本文所用的“启动子”包括指涉DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够在植物细胞中起始转录的启动子，无论其来源是否为植物细胞。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌(诸如农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium))获得的那些启动子。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织(如叶、根或种子)中起始转录的启动子。这种启动子称为“组织优选的”。专门在某些组织中起始转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“抑制型”启动子是处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。组织特异性启动子、组织偏好的启动子、细胞类型特异性启动子和诱导型启动子构成“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。
术语“ACC脱氨酶多肽”是本发明的具有ACC脱氨酶活性的多肽，并指一种或多种糖基化形式或非糖基化形式的氨基酸序列。该术语还包括其保持活性的片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“ACC脱氨酶蛋白”是本发明的蛋白质并包含ACC脱氨酶多肽。“ACC脱氨酶活性”意指该多肽能够将ACC转化为[α]-酮丁酸和氨，如通过多种可用的测定法所测量。ACC脱氨酶活性的评估可涉及测量反应底物和/或产物，例如通过测量α-酮丁酸的生成的比色测定法来进行该测量。
本文所用的“重组的”包括指涉已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。如本文所用，术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
本文所用的“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在宿主细胞中转录。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸和启动子等序列。
术语“残基”和“氨基酸残基”和“氨基酸”在本文中可互换使用，指被掺入蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸的非天然类似物。
术语“选择性杂交”包括指涉核酸序列在严格杂交条件下与如其他生物(asotherbiologics)杂交。因此，在规定的免疫测定法条件下，指定的抗体与具有被识别的表位的被分析物结合的程度比其与样品中存在的基本上所有缺乏该表位的被分析物的结合的程度实质上更大(例如至少2倍于背景)。在这种条件下与抗体的特异性结合可能需要这样的抗体，该抗体是根据其与特定蛋白质的特异性而选择的。例如，针对本发明的多肽产生的抗体可选自以获得与本发明的多肽具有特异性反应性的抗体。用作免疫原的蛋白质可呈天然构象或者可进行变性以提供线性表位。
有多种免疫测定法形式可用来选择与特定蛋白质(或其他被分析物)具有特异性反应性的抗体。例如，常规上使用固相ELISA免疫测定法来选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的单克隆抗体。有关可用来确定选择性反应性的免疫测定法形式和条件的描述，参见HarlowandLane，Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications，NewYork(1988)(Harlow和Lane，《抗体实验室手册》，冷泉港出版社，纽约，1988年)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指涉探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。
或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般地讲，探针长度小于约1000个核苷酸，任选地长度小于500个核苷酸。
通常，严格条件将为那些其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少约30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃用30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50℃至55℃于1X至2XSSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在37℃于40％至45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交和在55℃至60℃于＜RTI0.5X至1XSSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃杂交，并在60℃至65℃于0.1XSSC中洗涤。特异性通常与杂交后洗涤密切相关，关键因素为离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可根据MeinkothandWahl，Anal.Biochem.，138：267-284(1984)(Meinkoth和Wahl，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页，1984年)的方程式估计：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)--0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中的鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form为杂交溶液中的甲酰胺的百分数，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％错配，Tm减少约1℃，因而，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有＞90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃下杂交和/或洗涤。利用所述公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指导可在如下文献中找到：Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes，PartI，Chapter2“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays”，Elsevier，NewYork(1993)(Tijssen，《生物化学和分子生物学实验室技术--用核酸探针进行杂交》，第I部分，第2章，“有关杂交原理和核酸探针测定法策略的综述”，爱思唯尔，纽约，1993年)；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chapter2，Ausubel，etal.，Eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《分子生物学实验手册》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版和威利网络科技出版公司，纽约，1995年)。
如本文所用，“转基因植物”包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用于包括其基因型已因异源核酸的存在而变更的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株，包括那些最初产生的转基因植物以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因植物得到的那些转基因植物。如本文所用，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)变更。
本文所用的“载体”包括指涉用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体容许插入其中的核酸的转录。
以下术语用于描述本发明的多核苷酸/多肽与参考多核苷酸/多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分数”。
(a)本文所用的“参考序列”是用作本发明的多核苷酸/多肽的序列比较基础的确定序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完全的cDNA或基因序列。
(b)本文所用的“比较窗口”包括指多核苷酸/多肽序列的连续和指定的区段，其中可将该多核苷酸/多肽序列与参考序列进行比较，并且其中该多核苷酸/多肽序列在比较窗口中的该部分相比于该参考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便该两个序列的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸/氨基酸残基，任选地可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸/多肽序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将序列比对以作比较的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可通过以下方式进行：通过SmithandWaterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)(Smith和Waterman，《应用数学进展》，第2卷，第482页，1981年)的局部同源性算法；通过NeedlemanandWunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)(Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页，1970年)的同源性比对算法；通过PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444(1988)(Pearson和Lipman，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页，1988年)的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化实施，包括但不限于：Intelligenetics(加利福尼亚州山景城(MountainView，California))的PC/Gene程序中的CLUSTAL；GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage(威斯康星遗传学软件包)版本10(可得自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys有限公司(AccelrysInc.，9685ScrantonRoad，SanDiego，California，USA))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。CLUSTAL程序由如下文献充分描述：HigginsandSharp，Gene73：237-244(1988)(Higgins和Sharp，《基因》，第73卷，第237-244页，1988年)；HigginsandSharp，CABIOS5：151-153(1989)(Higgins和Sharp，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页，1989年)；Corpet，etal.，NucleicAcidsResearch16：10881-90(1988)(Corpet等人，《核酸研究》，第16卷，第10881-90页，1988年)；Huang，etal.，ComputerApplicatiohsintheBiosciences8：155-65(1992)(Huang等人，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-65页，1992年)，以及Pearson，etal.，MethodsinMolecularBiology24：307-331(1994)(Pearson等人，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页，1994年)。
可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；和TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chapter19，Ausubel，etal.，Eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《分子生物学实验手册》，第19章，Ausubel等人编辑，格林出版和威利网络科技出版公司，纽约，1995年)；Altschuletal.，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)(Altschul等人，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页，1990年)；以及Altschuletal.，NucleicAcidsRes.25：3389-3402(1997)(Altschul等人，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页，1997年)。
用于进行BLAST分析的软件可公开获得，例如通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的互联网网站(ncbi.nlm.nih.gov/)获得。BLAST算法涉及首先通过在查询序列中确定长度为W的短字串来确定高评分序列对(HSP)，该短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数T。T称为邻近字串分数阈值。这些最初的邻近命中字串充当起始点来开始搜索以寻找含有它们的更长的HSP。然后使命中字串沿每条序列朝两个方向延伸，只要累积比对分数可以增加即可。对于核苷酸序列，累积分数使用参数M(匹配残基对的奖分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)来计算。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积分数。
当在以下情况时暂停命中字串在每个方向的延伸：累积比对分数从其最大达到的值下降数量X；由于一个或多个负分数的残基比对的积累，累积分数到达零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用下列作为默认值：字长(W)为11、期望值(E)为10、截留值为100、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用下列作为默认值：字长(W)为3、期望值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页)。
除计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还执行两个序列之间相似性的统计分析(参见例如Karlin&Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA)，90：5873-5877(1993))(Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页，1993年)。BLAST算法提供的一种相似性量度为最小合计概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率的指示。BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(WootenandFederhen，Comput.Chem.，17：149-163(1993))(Wooten和Federhen，《计算化学》，第17卷，第149-163页，1993年)和XNU(ClaverieandStates，Comput.Chem.，17：191-201(1993))(Claverie和States，《计算化学》，第17卷，第191-201页，1993年)低复杂性过滤程序。
除非另外指明，本文提供的核苷酸和蛋白质同一性/相似性值使用GAP(GCG版本10)根据默认值计算。GAP(全局比对程序)也可用于将本发明的多核苷酸或多肽与参考序列比较。GAP使用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.48：443-453，1970)(Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页，1970年)的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大和使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它使得可以提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP必须利用空位产生罚分数来匹配其插入的每个空位。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，威斯康星遗传学软件包(Accelrys公司)的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以以选自0至100的整数来表示。因此，例如空位产生和空位延伸罚分可各自独立地为：3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60或更大。
GAP给出该家族中的具有最佳比对的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因素：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了将序列进行比对而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短片段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将相应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。威斯康星遗传学软件包版本10中所用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页)。
多个序列比对可使用CLUSTAL比对方法(HigginsandSharp(1989)CABIOS.5：151-153)(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页))通过默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行。使用CLUSTAL方法进行双序列比对的默认参数是KTUPLE1、空位罚分＝3、窗口＝5以及对角线保存＝5。
(c)在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”包括指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分数序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据MeyersandMiller，ComputerApplic.Biol.Sci.，4：11-17(1988)(Meyers和Miller，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页，1988年)的算法计算保守置换的分数，例如<RTI如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics，MountainView，California，USA))中所执行的。
(d)本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口范围内比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比较窗口中的部分包含添加或缺失(即空位)，以便最佳比对两个序列。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
本文公开的各实施方案涉及可用于改善植物的产量和/或胁迫耐受性的ACC脱氨酶基因的鉴定、表征和操纵。在一个实施方案中，产量和/或胁迫耐受性的改善可通过降低乙烯生成来实现。但是，抑制的程度或调节的幅度取决于负多效性效应。
本文示出本发明的ACC脱氨酶序列的多核苷酸、相关多肽和所有保守修饰的变体。包括真菌的、细菌的和植物的ACC脱氨酶基因序列，包括从小麦壳针孢(Septoriatretici)、Burkholderiaxenovorans、荧光假单胞菌(Pseudomonas.fluorescens)和根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)分离的序列在内，以及它们的截短版本、改组版本和其他版本。在一些实施方案中，作出一个或多个定向修饰以变更氨基酸序列；这种修饰可影响酶结构和功能性。
Karthikeyan等人(2009年)说明了假单胞菌ACCD的结构。在本文的某些实施方案中，根据已知的结构模拟ACCD序列，以确定活性位点和关键调节氨基酸残基出现在哪里。将突变选择成围绕可能调节活性的关键位点。在某些实施方案中，选择环状氨基酸或带电氨基酸残基用于突变以引起对蛋白质相互作用和结构的最大影响。
在某些实施方案中，可将来源于非植物物种的多核苷酸(如细菌序列)进行修饰以至少部分地优化植物中的密码子用法。有关宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。
本发明还包括变更作物植物例如玉蜀黍的遗传组成，使得此类作物可具有更高产量和/或使其更能耐受胁迫条件的方法。由此，本发明的效用包括通过调节乙烯生成和/或调节乙烯介导的响应同时增加产量和改善胁迫耐受性。
乙烯介导的响应包括但不限于那些涉及拥挤耐受性、种子结实和种子发育、在紧实土壤中的生长、淹水耐受性、成熟和衰老、干旱耐受性以及病害抗性的响应。本发明提供方法和组合物以在植物的乙烯生成和乙烯介导的响应方面实现一个或多个变更，以便在正常或胁迫条件下得到改进的农学性能。
因此，在一个方面，本发明涉及包含编码ACC脱氨酶的分离多核苷酸序列的分离核酸，该ACC脱氨酶会将ACC转化为α-酮丁酸和氨。本发明的一个实施方案是分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：(a)包含SEQIDNO：1、3、4、5、6、7或9的核苷酸序列的多核苷酸；(b)包含编码包含SEQIDNO：2、8或10的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；(c)与编码本发明的多肽的多核苷酸具有指定的序列同一性的多核苷酸；(d)与(a)的多核苷酸互补的多核苷酸；以及(e)包含指定数目的来自(a)或(b)的多核苷酸的连续核苷酸的多核苷酸。分离核酸可以是DNA。
在某些实施方案中，SEQIDNO：1、3、4、5、6、7或9的多核苷酸序列被变更以实现所编码的酶中的关键位点处氨基酸序列的变化。在某些实施方案中，酶结构中的一个或多个变化导致该酶的活性的变更。这样，可定制酶活性的水平以实现植物中期望的乙烯生成水平。
本发明的组合物包含分离的多肽，该分离的多肽包含选自以下的氨基酸序列：(a)包含SEQIDNO：2、8或10的氨基酸序列以及(b)与SEQIDNO：2、8或10具有指定的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有ACC脱氨酶活性。
在某些实施方案中，变更的ACC脱氨酶含有以下所示的变更中的一者或多者：
Glu308变更为Ala308
Tyr307变更为Ala307
Asp317变更为Ala317
Val49变更为Pro49
Lys59变更为Ala59
Phe294变更为Ala294
Ser297变更为Ala297
Ser86变更为Ala86
Pro68变更为Ala68
Asp76变更为Ala76
在另一个方面，本发明涉及包含所描述的核酸的重组表达盒。另外，本发明涉及含有该重组表达盒的载体。此外，含有该重组表达盒的载体可有利于该核酸在宿主细胞中的转录和翻译。本发明还涉及能够表达本发明的多核苷酸的宿主细胞。有多种宿主细胞可以使用，如但不限于微生物、动物、植物或昆虫细胞。
在又另一个实施方案中，本发明涉及含有本发明的核酸的转基因植物或植物细胞。优选的含有本发明多核苷酸的植物包括但不限于玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、西红柿和稷。在某些实施方案中，转基因植物是玉蜀黍植物或植物细胞。一个具体的实施方案是来自该转基因植物的转基因种子。
本发明的植物与对照植物相比可具有变更的乙烯生成。在一些植物中，变更的乙烯生成涉及营养组织、繁殖组织、或营养组织和繁殖组织。本发明的植物可具有以下表型中的至少一者：与对照植物相比，拥挤耐受性改进、种子结实增加、种子发育变更、在紧实土壤中的生长改进、淹水耐受性改进、干旱耐受性改进、成熟和/或衰老变更以及病害抗性改进。
提供了通过向植物中引入ACC脱氨酶从而减少ACC氧化(其为乙烯合成途径中的一个步骤)的底物，来降低该植物中的乙烯合成的方法。该方法可包括将本发明的ACC脱氨酶多核苷酸引入该植物中。
本发明尤其提供用于调节(即提高或降低)本发明的多核苷酸或多肽在植物或植物细胞中的水平的组合物和方法。具体地讲，本发明的多核苷酸和多肽可在时间上或在空间上表达，如在发育阶段、在组织中和/或以一定的量表达，而这不是对照植物或植物细胞的特征。因此，本发明提供在这类示例性的应用中的效用，如下文所提供。
已鉴定了能够促进植物生长的根际细菌。在包含这些细菌的土壤的存在下栽培的植物通常具有更长的根和芽，种子萌发改进并且干旱胁迫的效应降低。已显示这些促进植物生长的细菌产生1-氨基环丙烷-1-甲酸(ACC)脱氨酶，该酶能降低植物中的乙烯的量。例如，细菌ACC脱氨酶的多核苷酸和多肽在SEQIDNO：1至6中提供。本发明包括ACC脱氨酶以转基因方式用于调节植物中的乙烯生成的用途。ACC脱氨酶蛋白、编码该蛋白的核苷酸序列、以及所得的构建体、载体和经修饰的植物细胞、组织、种子和器官是本发明的实施方案。在某些实施方案中，ACC脱氨酶蛋白通过定向突变进行变更。该酶因此在多种胁迫响应应用中具有效用，例如以下：
还鉴定了植物物种天然的ACC脱氨酶。参见例如SEQIDNO：7至10。在某些实施方案中，野生型和/或经修饰的植物脱氨酶的变更的表达调节植物中的乙烯生成或水平。该脱氨酶对于其中乙烯生成或水平被调节的植物而言可以是天然的或异源的。如果该脱氨酶是经修饰的，它可被修饰成变更所述酶的关键位点处或附近的氨基酸。
拥挤耐受性
作物植物的农学性能通常随其耐受种植密度的程度而变化。过度拥挤胁迫可以是由于营养物、水和/或阳光的限制所致。拥挤胁迫还可由于植物之间的接触的增加所致，这可导致生长较慢和组织较厚。
已将乙烯与植物拥挤耐受性相关联。例如，乙烯不敏感性烟草属植物在接触相邻植物时不表现出较慢的生长(Knoesteretal.，PNASUSA，95：1933-1937(1998))(Knoester等人，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第1933-1937页，1998年)。还有证据显示，乙烯涉及缺水胁迫，并且乙烯可导致植物中出现变化，所述变化限制植物的生长并且加剧超出缺水本身的干旱胁迫症状。
本发明通过提供和/或调节一种多种ACC脱氨酶多核苷酸或多肽的表达或活性来提供植物尤其是谷类(如玉蜀黍)中的乙烯生成降低，以促进密植耐受性而减少胁迫和产量损失。
玉蜀黍中的种子结实和种子发育
乙烯在种子发育中具有多个作用。例如，在玉蜀黍中，乙烯与发育的胚乳细胞的程序性细胞死亡相关(Youngetal.，PlantPhysio.，115：737-751(1997))(Young等人，《植物生理学》，第115卷，第737-751页，1997年)。此外，乙烯与籽粒败育有关，例如出现在穗尖，尤其是在胁迫条件下生长的植物中(ChengandLur，Physiol.Plant，98：245-252(1996))(Cheng和Lur，《植物生理学》，第98卷，第245-252页，1996年)。籽粒结实减少无疑是产量减少的影响因素。因此，本发明通过提供和/或调节ACC脱氨酶多核苷酸或多肽的表达或活性来提供具有降低的乙烯或乙烯效应的植物，特别是玉蜀黍植物。
在紧实土壤中的生长
植物生长受到土壤密度和紧实度的影响。当遇到机械胁迫如紧实土壤时，乙烯促进组织增厚和生长延迟。这可同时影响根和芽。推测该效应适于一些环境，因为其产生更强、更紧实的组织，可强行穿过或绕过障碍物例如紧实土壤。然而，在此类条件下，乙烯的产生和乙烯通路的活化可超越紧实土壤的机械胁迫的适应调节需要。任何所产生的不必要生长抑制均是不期望的农学结果。
本发明通过提供和/或调节一种多种ACC脱氨酶多核苷酸或其蛋白产物的表达或活性来提供植物尤其是谷类(如玉蜀黍)中的乙烯生成降低。这种经调节的植物能够比对照植物更好地在紧实土壤中萌发和生长。
淹水耐受性
淹水和积水土壤每年在世界范围内导致作物产量的大量损失。淹水可以是广泛的或局部的、短暂的或长期的。在淹水条件下乙烯的生成可增加。该增加有两个主要原因：1)在淹水条件下，造成缺氧，植物产生更多的乙烯，以及2)在淹水条件下，乙烯离开植物的扩散减缓，因为乙烯微溶于水，使植物间乙烯水平升高。
淹水玉蜀黍根中的乙烯也可抑制向重力性，向重力性是正常适应性生长，它使根向下、苗向上。向重力性是确定根构造的一个因素，而根构造在从土壤获取营养物和水中具有重要作用。乙烯水平的操纵可用来影响根角度(对于干旱耐受性)、淹水耐受性、更大的直立性和/或改进的营养物吸收。例如，以更竖直的角度生长的根将很可能更深地生长在土壤中，因此以更大的深度获得水分，从而改进干旱耐受性。在不存在干旱胁迫的情况下，可作出更平行于土壤表面的根在土壤剖面上层中更有效地由根摄入营养物和水的相反论点。一般来讲，几乎竖直(陡峭)角度的根比浅角度(平行于表面)的根对根倒伏也更敏感。
除抑制向重力性之外，淹水条件下的乙烯释放可抑制生长，尤其是根的生长。此类抑制可能导致植物总体生长不良，因此是不利的农学性状。
本发明通过提供和/或调节一种多种ACC脱氨酶多核苷酸或其蛋白产物的表达或活性来提供植物尤其是谷类(如玉蜀黍)中的乙烯生成降低，从而改进在淹水条件下或在积水土壤中的植物性能。
植物成熟和衰老
乙烯涉及衰老控制、果实成熟和脱落。乙烯在促进果实成熟中的作用是非常确定的并且在行业中得到应用。主要针对双子叶植物研究了脱落。乙烯介导的衰老大多数也在双子叶植物中进行研究，但衰老的控制对于双子叶植物和单子叶植物作物物种二者都具有农学重要性。乙烯不敏感性可延缓但不阻止衰老。乙烯介导的衰老过程与疾病症状和脱落区的细胞死亡过程具有一些相似性。
通过控制一个或多个ACC脱氨酶基因来控制乙烯生成，可导致作物植物如玉蜀黍的成熟速率的调节。这对于将作物品种置于不同的成熟区可能是合乎需要的。
本发明通过提供和/或调节一种多种ACC脱氨酶多核苷酸或其蛋白产物的表达或活性来提供植物尤其是谷类(如玉蜀黍)中的乙烯生成降低。
其他非生物胁迫的耐受性
某些其他的对植物的胁迫，如寒冷、酷热、创伤、污染、干旱和高盐度会引发乙烯的生成(参见MorganandDrew，Physiol.Plant，100：620-630(1997))(Morgan和Drew，《植物生理学》，第100卷，第620-630页，1997年)。一种共同的机制可涉及多种响应。例如，干旱和拥挤两者都可能引发缺水响应，冷却也可能引发缺水响应。(JanowaikandDorffling，J.PlantPhysiol.，147：257-262(1995))(Janowaik和Dorffling，《植物生理学杂志》，第147卷，第257-262页，1995年)。
胁迫后的一些乙烯生成可通过调节植物中的乙烯介导的过程服务于适应性目的，该过程使得以此类方式重组的植物更好地适应所遇到的胁迫。然而，有证据表明，胁迫期间的乙烯生成可导致胁迫例如黄化、组织死亡和衰老产生的阴性症状恶化。
就胁迫期间的乙烯生成导致或增强负胁迫相关的症状来说，产生出乙烯生成更少和/或对乙烯的敏感性更低的植物将是合乎需要的。本发明的某些实施方式通过提供和/或调节一种多种ACC脱氨酶多核苷酸或其蛋白产物的表达或活性来提供植物尤其是谷类(如玉蜀黍)中的乙烯生成降低。
病害抗性
作物植物可能易受众多病原体的影响，导致全世界作物产量大量损失。作物育种工作者一直努力培育可抵挡病原体攻击的更具有抗性或耐受性的品种。另外的遗传工程策略也是为了达到相同目的。在许多植物-病原体相互作用中，病害的症状，最通常来说组织坏死和由此所致的植物生长不良，已知是植物对病原体的积极防御响应的结果；也即，症状是由植物直接造成的，而不仅仅是由病原体造成。从所有作物植物的名单中以及它们的潜在病原体名单中可见到，抗性是常规，而易感性是例外。易感的相互作用常被认为由植物的不恰当或不充分的激活防御产生，不恰当或不充分的激活防御导致症状发展失控和不能够遏制病原体。
乙烯与植物病原体防御系统有关联，并且可引发与发病机理相关的基因的表达。乙烯和乙烯介导的效应可被视为是对病原体攻击的下游反应的主要部分，如在症状发展中。在易感的相互作用中，乙烯可能实际上促进组织损害。因此，这这种情况中，阻断乙烯生成或作用可实际上导致更少的组织损害，也即更明显的抗性，即使病原体与植物相容。阻断乙烯作用已知可导致更大的易感性(例如Knoesteretal.(1988)(Knoester等人，1988年))或更大的抗性(例如Lundetal.，PlantCell，10：371-382，(1998)(Lund等人，《植物细胞》，第10卷，第371-382页，1998年))，这表明乙烯作用的角色是复杂的，取决于植物和病原体的相互作用。
本发明提供一种或多种ACC脱氨酶多核苷酸或它们的蛋白质产物用于增强植物特别是单子叶植物(如玉蜀黍)对胁迫的抗性的用途。这可涉及通过提供和/或调节ACC脱氨酶多核苷酸或它们的蛋白质的表达或活性来降低乙烯生成。响应胁迫而生成较少的乙烯的植物在暴露于非生物胁迫物后不容易发生组织损害。
植物转化
转基因植物的产生对于作物植物遗传工程策略是至关重要的。基因转移通常涉及通过多种方法(如粒子轰击或农杆菌感染)中的任何一种将外源DNA引入到植物细胞中，接着常常进行组织培育和植物再生。
乙烯作用通常对植物转化具有负面结果。因此，在转化和组织培养中采用各种方案以结合、捕集乙烯或以别的方式阻断乙烯的积累(参见Songstadetal.，PlantCellReports，9：694-702(1991))(Songstad等人，《植物细胞报导》，第9卷，第694-702页，1991年)。粒子轰击方法造成极大的组织/细胞损害，并且这种损害已知会引起乙烯积累。而且，在大多数的组织培养方法中，一些组织比其他组织生长得更好，如在转化株的化学选择中所设计的。这种垂死的组织可散发乙烯并阻止阳性转化株的生长。为了组织再生的目的将植物组织限制在容器中会导致乙烯的积累，从而造成生长延迟。由于已知乙烯会降低组织生长速率并且甚至引起细胞或组织死亡，因此期望拥有在转化期间将乙烯作用阻断或最小化的手段。
因此，本发明的某些实施方案提供提高ACC脱氨酶的表达或活性以短暂地或稳定地降低乙烯作用。
其他效用
本发明还提供包含足够长度的多核苷酸并与本发明的基因互补以用作基因转录物的检测、定量或分离中的探针或扩增引物的分离核酸。例如，本发明的分离核酸可用作检测筛选所需转基因植物的mRNA水平缺陷的探针，用于检测基因突变(如，置换、缺失或添加)，在化合物筛选测定中用于监测表达上调或酶活性变化，用于检测任何数量的基因的等位变体(多态性)、直系同源物或旁系同源物或用于真核细胞中的定点诱变(参见例如美国专利No.5,565,350)。本发明的分离核酸也可用于其编码多肽的重组表达，或用作制备和/或筛选抗体的免疫原。分离核酸也可用于宿主细胞、组织或植物中本发明的一个或多个基因的正义或反义抑制。结合、插入、裂解和/或交联本发明的分离核酸的化学试剂的附着也可用于调节转录或翻译。
本发明的某些实施方案提供包含本发明的多肽(如，前酶原、酶原或酶)的分离蛋白质。本发明还提供包含至少一个来自本发明多肽的表位的蛋白质。本发明的蛋白质可用于酶功能的酶激动剂或拮抗剂的测定或用作获得与本发明的蛋白质发生特异性免疫反应的抗体的免疫原或抗原。此类抗体可用于表达水平的测定，用于从表达文库鉴定和/或分离本发明的核酸，用于从其他物种鉴定同源多肽或用于纯化本发明的多肽。
本发明的分离核酸和多肽可用于大量植物类型，特别是单子叶植物例如禾本科(Gramineae)家族物种，包括大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、小麦属(Tritium)、高粱属(Sorghum)(例如高粱(S.bicolor))和玉蜀黍属(例如玉米(Z.mays))。本发明的分离核酸和蛋白质也可用于如下属的物种：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browallia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)和燕麦属(Avena)。
核酸
本发明尤其提供包含本发明的多核苷酸的RNA、DNA的分离核酸及其类似物和/或嵌合体。
本发明的多核苷酸包括：
(a)SEQIDNO：1、3、4、5、6、7或9的多核苷酸，或者编码SEQIDNO：2、8或10的多肽的多核苷酸及其保守修饰变体和多态性变体；
(b)作为从植物核酸文库扩增的产物的分离多核苷酸，该扩增是使用在严格条件下与本发明的多核苷酸内的基因座选择性杂交的引物对来进行的；
(c)与(a)或(b)的多核苷酸选择性杂交的分离多核苷酸；
(d)与(a)、(b)或(c)的多核苷酸具有指定的序列同一性的分离多核苷酸；
(e)编码下述蛋白质的分离多核苷酸，其中所述蛋白质具有指定数目的来自原型多肽的连续氨基酸并且该蛋白质通过由呈现该蛋白质而引起的抗血清被特异性识别，并且其中该蛋白质不会可检测地与已完全免疫吸附了该蛋白质的抗血清发生免疫反应；
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多核苷酸的互补序列；以及
(g)包含至少指定数目的来自(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸的连续核苷酸的分离多核苷酸；
(h)来自具有与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多核苷酸选择性杂交的物理化学性质的全长富集cDNA文库的分离多核苷酸；
(i)通过以下方法制备的分离多核苷酸：1)提供全长富集核酸文库，2)使多核苷酸与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多核苷酸选择性杂交，从而从核酸文库分离多核苷酸。
A.编码本发明的多肽的多核苷酸
如上述(a)所指出的那样，本发明提供包含本发明的多核苷酸的分离核酸，其中所述多核苷酸编码本发明的多肽。本文每个编码多肽的核酸序列还参考遗传密码描述每种可能的核酸沉默变异。普通技术人员将认识到，可修饰核酸中的每种密码子(AUG除外，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子；UGG也除外，其通常为色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并在本发明的范围内。因此，本发明包括本发明的多核苷酸以及编码本发明的多肽的多核苷酸。
B.从植物核酸文库扩增的多核苷酸
如上述(b)所指出的那样，本发明提供包含本发明的多核苷酸的分离核酸，其中所述多核苷酸在核酸扩增条件下从植物核酸文库扩增。
多种扩增方法中的每种的核酸扩增条件是本领域普通技术人员熟知的。植物核酸文库可由单子叶植物例如谷类作物构建。示例性谷类包括玉蜀黍、高粱、苜蓿、卡诺拉油菜、小麦和水稻。植物核酸文库也可由双子叶植物例如大豆构建。玉米品系如B73、A632、W23和Mo17是已知的并且可公开获得。其他已知和公开获得的玉蜀黍品系可从伊利诺伊州厄巴纳玉蜀黍遗传学合作社(MaizeGeneticsCooperation(Urbana，IL))获得。小麦品系从堪萨斯州曼哈顿小麦遗传学资源中心(WheatGeneticsResourceCenter(Manhattan，KS))获得。
核酸文库可以是cDNA文库，它是基因组文库或通常由任何内含子处理阶段的核转录物构建的文库。cDNA文库可以进行均一化以增加相对罕见cDNA的表示。在任选的实施方案中，cDNA文库使用富集全长cDNA合成方法构建。这种方法的例子包括寡聚加帽法(Oligo-Capping)(Maruyama，K.andSugano，S.Gene138：171-174，1994)(Maruyama，K.和Sugano，S.，《基因》，第138卷，第171-174页，1994年)、生物素酰化的CAPTrapper法(Carninci，etal.Genomics37：327-336，1996)(Carninci等人，《基因组学》，第37卷，第327-336页，1996年)和CAPRetention程序(Edery，E.，Chu，L.L.，etal.MolecularandCellularBiology15：3363-3371，1995)(Edery，E.、Chu，L.L.等人，《分子生物学与细胞生物学》，第15卷，第3363-3371页，1995年)。快速生长组织或快速分裂细胞对于用作cDNA文库构建的mRNA来源是优选的。玉米的生长阶段在“HowaCornPlantDevelops，”SpecialReportNumber48，IowaStateUniversityofScienceandTechnologyCooperativeExtensionService，Ames，Iowa，ReprintedFebruary1993(“玉米植物如何发育”，第48篇特别报告，爱荷华州立科学与技术大学合作推广服务，爱荷华州艾姆斯，1993年2月重印)中有描述。
这个实施方案的多核苷酸(或其亚序列)可以例如通过使用扩增引物获得，所述扩增引物在核酸扩增条件下选择性杂交至本发明多核苷酸内的至少两个位点，或杂交至在本发明多核苷酸侧面并且包含本发明多核苷酸的核酸内的两个位点，或杂交至本发明多核苷酸内的位点以及包含本发明多核苷酸的核酸内的位点并进行引物延伸。获得载体插入物的5’和/或3’末端的方法是本领域熟知的。参见例如Frohman，M.A.，inPCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications，M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，T.J.White，Eds.(AcademicPress，Inc.，SanDiego)，pp.28-38(1990))(Frohman，M.A.，载于《PCR方案：方法和应用指南》，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky、T.J.White编辑，学术出版社，圣地亚哥，第28-38页，1990年)中描述的RACE(互补末端的快速扩增)；另参见美国专利No.5,470,722以及CurrentProtocolsinMolecularBiology，Unit15.6，Ausubel，etal.，Eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《分子生物学实验手册》，15.6节，Ausubel等人编辑，格林出版公司与威利网络科技出版公司，纽约，1995年)；FrohmanandMartin，Techniques1：165(1989)(Frohman和Martin，《技术》，第1卷，第165页，1989年)。
任选地，引物与其扩增的靶核酸的亚序列互补，但相对于其设计为退火所得的多核苷酸序列可具有约85％至99％范围内的序列同一性。本领域的技术人员将会知道，选择引物对将选择性杂交至的位点以使得单个邻接核酸可在所需核酸扩增条件下形成。核苷酸中的引物长度选自从至少15至50的整数。因此，引物的长度可为至少15、18、20、25、30、40或50个核苷酸。技术人员将认识到，加长的引物序列可用于增加与靶序列结合(即，退火)的特异性。例如，可添加引物的5’末端(“尾”)的非退火序列，以在扩增子的末端引入克隆位点。
扩增产物可使用本领域的技术人员熟知的表达系统翻译。所得的翻译产物可通过例如测定适当催化活性(如，比活性和/或底物特异性)或证实对本发明的多肽具有特异性的一个或多个表位的存在而确认为本发明的多肽。从PCR来源模板合成蛋白质的方法是本领域已知的，并且可商购获得。参见例如阿默舍姆生活科学有限公司(AmershamLifeSciences，Inc)第97号产品目录，第354页。
C.与(A)或(B)的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸
如上述(c)所指出的那样，本发明提供包含本发明的多核苷酸的分离核酸，其中多核苷酸在选择性杂交条件下与如上所讨论的(A)或(B)节的多核苷酸选择性杂交。因此，该实施方案的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量包含(A)或(B)的多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于鉴定、分离或扩增保藏的文库中的部分或全长克隆。
在一些实施方案中，多核苷酸是分离的或者与来自双子叶植物或单子叶植物核酸文库的cDNA互补的基因组或cDNA序列。
单子叶植物和双子叶植物的示例性物种包括但不限于：玉蜀黍、卡诺拉油菜、大豆、棉花、小麦、高粱、向日葵、苜蓿、燕麦、甘蔗、小米、大麦和水稻。cDNA文库包含至少50％至95％的全长序列(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的全长序列)。cDNA文库可以进行均一化以增加罕见序列的表示。参见例如美国专利No.5,482,845。低严格杂交条件通常(但不唯一)利用相对于互补序列具有减少的序列同一性的序列。中等和高严格条件可任选地用于同一性更高的序列。低严格条件允许具有约70％至80％序列同一性的序列的选择性杂交，并且可用于鉴定直系同源或旁系同源序列。
D.与(A)、(B)或(C)的多核苷酸具有特定序列同一性的多核苷酸
如上述(d)所指出的那样，本发明提供包含本发明的多核苷酸的分离核酸，其中多核苷酸在核苷酸水平上与如上述(A)、(B)或(C)节公开的多核苷酸具有特定同一性。同一性可使用例如BLAST、CLUSTALW或GAP算法在默认条件下计算。与参考序列的同一性百分数为至少60％，并且向上舍入到最近的整数，可以表示为选自从60至99的整数的整数。因此，例如与参考序列的同一性百分数可为至少70％、75％、80％、85％、90％或95％。
任选地，该实施方案的多核苷酸将编码与由(A)、(B)或(C)节的多核苷酸编码的多肽共享表位的多肽。因此，这些多核苷酸编码引起抗血清产生的第一多肽，所述抗血清包含与由(A)、(B)或(C)的多核苷酸编码的第二多肽特异性反应的抗体。然而，当抗血清被第一多肽完全免疫吸附时，第一多肽不结合本身产生的抗血清。因此，该实施方案的多核苷酸可用于生成用于例如筛选核酸的表达文库的抗体，所述核酸包含(A)、(B)或(C)的多核苷酸，或用于纯化(A)、(B)或(C)的多核苷酸编码的多肽或用于对于(A)、(B)或(C)的多核苷酸编码的多肽的免疫测定法。这个实施方案的多核苷酸包含可用于选择性杂交至编码本发明的多肽的多核苷酸的核酸序列。
筛选特异性结合至抗血清的多肽可使用肽展示文库便利地实现。该方法涉及筛选用于具有所需功能或结构的各个成员的大量肽。
肽展示文库的抗体筛选在本领域中是熟知的。展示的肽序列的长度可为3至5000个或更多个氨基酸，在很多情况下长度为5100个氨基酸，并且通常长度为约8至15个氨基酸。除用于生成肽文库的直接化学合成方法之外，还描述了几种重组DNA方法。一种类型涉及在噬菌体或细胞表面上展示肽序列。每种噬菌体或细胞包含编码特定的展示肽序列的核苷酸序列。此类方法在PCT专利公布No.91/17271、91/18980、91/19818和93/08278中有描述。生成肽文库的其他系统具有体外化学合成和重组方法两个方面。参见PCT专利公布No.92/05258、92/14843和97/20078。另参见美国专利No.5,658,754和No.5,643,768。肽展示文库、载体和筛选试剂盒可从例如加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen(Carlsbad，CA))的供应商处商购获得。
E.编码具有来自原型多肽以及与原型多肽交叉反应的亚序列的蛋白质 的多核苷酸
如上述(e)所指出的那样，本发明提供包含本发明的多核苷酸的分离核酸，其中所述多核苷酸编码具有来自本发明的原型多肽(例如上述(a)中所提供)的连续氨基酸亚序列的蛋白质。来自原型多肽的连续氨基酸的长度选自从至少10至原型序列内氨基酸的数量的整数。因此，例如多核苷酸可编码具有至少10、15、20、25、30、35、40、45或50个来自原型多肽的连续氨基酸的亚序列的多肽。另外，本发明实施方案的多核苷酸编码的此类亚序列的数量可以是选自1至20，例如2、3、4或5的任何整数。亚序列可由从1至序列中核苷酸的数量的任何整数核苷酸，例如至少5、10、15、25、50、100或200个核苷酸分隔。
当作为免疫原存在时，该实施方案的多核苷酸编码的蛋白质引起特异性结合至原型多肽的多克隆抗体的产生，所述原型多肽例如但不限于上述(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽。然而，一般来讲，当抗血清被原型多肽完全免疫吸附时，该实施方案的多核苷酸编码的蛋白质不结合原型多肽产生的抗血清。制备和测定抗体结合特异性/亲和力的方法是本领域公知的。示例性的免疫测定法形式包括ELISA、竞争性免疫测定法、放射免疫测定法、蛋白质印迹法、间接免疫荧光测定法等。
在优选的测定方法中，原型多肽引起产生的完全免疫吸附和集中在一起的抗血清可用于竞争性结合测定法，以测试蛋白质。确定抑制50％抗血清与原型多肽的结合所需的原型多肽的浓度。如果抑制结合所需的蛋白质的量小于原型蛋白质的量的两倍，则称蛋白质特异性结合由免疫原引起产生的抗血清。
因此，本发明的蛋白质涵盖等位变体、保守修饰变体以及对原型多肽的微小重组修饰。
本发明的多核苷酸任选地编码这样的蛋白质，该蛋白质作为非糖基化蛋白质具有与本发明的全长非糖基化多肽的分子量偏差在20％之内的分子量。分子量可通过SDS-PAGE在还原条件下轻松测定。任选地，分子量与本发明全长多肽偏差在15％之内，更优选地在10％或5％之内，以及最优选地与本发明全长多肽偏差在3％、2％或1％之内。任选地，该实施方案的多核苷酸将编码具有包含本发明的天然、内源性全长多肽的细胞提取物的至少50％、60％、80％或90％的特异性酶活性的蛋白质。
另外，该实施方案的多核苷酸编码的蛋白质任选地与天然、内源性全长蛋白质具有基本上类似的亲和常数(Km)和/或催化活性(即，微观速率常数，kcat)。本领域的技术人员将认识到kcat/Km值确定了竞争性底物的特异性，通常称为特异性常数。该实施方案的蛋白质可具有本发明全长多肽的至少10％的kcat/Km值，如使用该多肽的内源性底物所确定。任选地，kcat/Km值将为本发明全长多肽的kcat/Km值的至少20％、30％、40％、50％并且最优选地至少60％、70％、80％、90％或95％。
kcat、Km和kcat/Km的确定可通过任何数量本领域技术人员熟知的方式确定。例如，初始速率(即，反应的前5％或更少)可使用与例如分光光度法、荧光光度法、核磁共振或放射性过程的示例性测量方法结合的快速混合和取样技术(如，连续流、停流或快速淬火技术)、闪光光解或松弛法(如，温度跃升)确定。动力学值使用LineweaverBurk或Eadie-Hofstee作图法便利地获得。
F.与(A)至(E)的多核苷酸互补的多核苷酸
如上述(f)所指出的那样，本发明提供包含与上述段落A至E的多核苷酸互补的多核苷酸的分离核酸。本领域的技术人员将认识到互补序列碱基对贯穿(A)至(E)节的多核苷酸的全长(即，在其整个长度上具有100％的序列同一性)。互补碱基通过双链核酸中的氢键关联。例如，以下碱基对是互补的：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。
G.作为(A)至(F)的多核苷酸的亚序列的多核苷酸
如上述(g)所指出的那样，本发明提供包含下述多核苷酸的分离核酸，所述多核苷酸包含至少15个来自上述(A)至(F)节的多核苷酸的连续碱基。多核苷酸的长度以选自从至少15至多核苷酸作为其亚序列的核酸序列的长度的整数给出。因此，例如本发明的多核苷酸包括具有来自(A)至(F)的多核苷酸的长度为至少15、20、25、30、40、50、60、75或100个连续核苷酸的多核苷酸。任选地，本发明实施方案的多核苷酸编码的此类亚序列的数量可以是选自1至20，例如2、3、4或5的任何整数。亚序列可由从1至序列中核苷酸的数量的任何整数核苷酸，例如至少5、10、15、25、50、100或200个核苷酸分隔。
亚序列可通过体外合成、体外生物合成或体内重组方法制备。在任选的实施方案中，亚序列可通过核酸扩增制备。例如，核酸引物构造为与编码区内或与编码区共同延伸的序列(或其互补序列)选择性杂交。
本发明的亚序列可包含结构文库，如本领域所知和下文所简要讨论。cDNA文库包含至少50％至95％的全长序列(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的全长序列)。cDNA文库可从多个来自多个发育阶段的单子叶植物或双子叶植物的组织构建。示例性物种包括玉蜀黍、小麦、水稻、卡诺拉油菜、大豆、棉花、高粱、向日葵、苜蓿、燕麦、甘蔗、小米、大麦和水稻。在选择性杂交条件下将来自富集全长文库的多核苷酸与本发明的多核苷酸选择性杂交的方法是本领域普通技术人员已知的。任何数量的严格条件可用于允许选择性杂交。在任选的实施方案中，严格性允许与杂交区的长度具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的序列同一性的序列的选择性杂交。富集全长cDNA文库可进行均一化以增加罕见序列的表示。
H.通过cDNA分离方法制备的多核苷酸产物
如上述(I)所指出的那样，本发明提供通过如下方法制备的分离的多核苷酸：1)提供富集全长核酸文库，2)使多核苷酸与上述段落(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)或(H)的多核苷酸选择性杂交，从而从核酸文库分离多核苷酸。富集全长核酸文库的构建如段落(G)及下文所讨论。选择性杂交条件如段落(G)所讨论。核酸纯化方法是本领域熟知的。
可使用固相方法便利地实现纯化；此类方法是本领域的技术人员熟知的，并且试剂盒可从例如英国萨里的先进生物技术公司(AdvancedBiotechnologies(Surrey，UK))的供应商处商购获得。例如，段落(A)至(H)的多核苷酸可固定至固相载体例如膜、珠子或粒子。参见例如美国专利No.5,667,976。本发明方法的多核苷酸产物选择性杂交至固定化多核苷酸，并且固相载体随后通过包括但不限于离心、磁力分离、过滤、电泳等等的方法从非杂交多核苷酸分离。
核酸的构建
可用(a)标准的重组方法、(b)合成技术或二者的组合产生分离的本发明核酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸从单子叶植物(例如玉米、水稻或小麦)或者双子叶植物(例如大豆)克隆、扩增或者构建。
所述核酸可便利地包含除本发明多核苷酸之外的序列。例如，可将包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点插入核酸中以助于该多核苷酸的分离。另外，可插入可翻译序列以助于分离翻译了的本发明多核苷酸。例如，六组氨酸标志序列提供了便利的手段来纯化本发明的蛋白质。本发明的多核苷酸可连接至用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、衔接子或接头。可将另外的序列添加至这种克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以助于所述多核苷酸的分离，或改善所述多核苷酸向细胞内的导入。通常，本发明核酸的长度减去其本发明多核苷酸的长度为小于20千碱基对，往往小于15kb，常常小于10kb。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域熟知和广泛描述的。有关各种核酸的描述，参见例如StratageneCloningSystems公司，目录号1999，加利福尼亚州拉荷亚(LaJolla，CA)和安玛西亚生物科技有限公司(AmershamLifeSciences，Inc)，第99号产品目录，伊利诺伊州阿灵顿高地(ArlingtonHeights，IL)。
A.构建核酸的重组方法
本发明的分离核酸组分，例如RNA、cDNA、基因组DNA或其杂交体可使用本领域的技术人员已知的任何数量的克隆方法从植物生物来源获得。在一些实施方案中，在严格条件下与本发明的多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。RNA的分离和cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员熟知的。参见例如PlantMolecularBiology：ALaboratoryManual，Clark，Ed.，Springer-Verlag，Berlin(1997)(《植物分子生物学：实验室手册》，Clark编辑，施普林格出版社，柏林，1997年)和CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel，etal.，Eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《分子生物学实验手册》，Ausubel等人编辑，格林出版和威利网络科技出版公司，纽约，1995年)。
A1.富集全长cDNA文库
多个提供富集全长cDNA文库的cDNA合成方案已有描述。富集全长cDNA文库构建为包含至少60％，更优选地至少70％、80％、90％或95％的包含插入物的克隆中的全长插入物。此类文库中插入物的长度可为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个千碱基对。适应这些大小的插入物的载体是本领域已知的并且可商购获得。参见例如Stratagene的λZAPExpress(具有0至12kb克隆容量的cDNA克隆载体)。构建大于95％纯的全长cDNA文库的示例性方法由以下文献描述：Carnincietal.，Genomics，37：327-336(1996)(Carninci等人，《基因组学》，第37卷，第327-336页，1996年)。其他制备全长文库的方法是本领域已知的。参见例如Ederyetal.，Mol.CellBiol.，15(6)：3363-3371(1995)(Edery等人，《分子细胞生物学》，第15卷，第6期，第3363-3371页，1995年)；以及PCT申请WO96/34981。
A2均一化或消减cDNA文库
非均一化cDNA文库表示制备其的组织的mRNA群体。由于独特的克隆不计入来源于其分离难以进行的高表达基因的克隆。cDNA文库的均一化是创建其中每个克隆得以更等同表示的文库的过程。均一化文库的构建在以下文献和专利中有描述：Ko，Nucl.Acids.Res.，18(19)：57055711(1990)(Ko，《核酸研究》，第18卷，第19期，第5705-5711页，1990年)；Patanjalietal.，Proc.Natl.Acad.U.S.A.，88：1943-1947(1991)(Patanjali等人，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第1943-1947页，1991年)；美国专利5,482,685、5,482,845和5,637,685。在Soares等人描述的示例性方法中，均一化使克隆丰度从四个数量级范围减少至仅1个数量级的窄范围。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：9228-9232(1994)(《美国国家科学院院刊》，第91卷，第9228-9232页，1994年)。
消减cDNA文库是增加丰度较低cDNA物质的比例的另一个方法。在该方法中，从一个mRNA池制备的cDNA通过杂交缺失第二mRNA池中存在的序列。移除cDNA：mRNA杂交体，所保留的未杂交的cDNA池富集该池独特的序列。参见Footeetal.in，PlantMolecularBiology：ALaboratoryManual，Clark，Ed.，Springer-Verlag，Berlin(1997)(Foote等人，载于《植物分子生物学：实验室手册》，Clark编辑，施普林格出版社，柏林，1997年)；KhoandZarbl，Technique，3(2)：58-63(1991)(Kho和Zarbl，《技术》，第3卷，第2期，第58-63页，1991年)；SiveandSt.John，Nucl.AcidsRes.，16(22)：10937(1988)(Sive和St.John，《核酸研究》，第16卷，第22期，第10937页，1988年)；CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel，etal.，Eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《分子生物学实验手册》，Ausubel等人编辑，格林出版和威利网络科技出版公司，纽约，1995年)；以及Swaroopetal.，Nucl.AcidsRes.，19)8)：1954(1991)(Swaroop等人，《核酸研究》，第19卷，第8期，第1954页，1991年)。cDNA消减试剂盒可商购获得。参见例如PCR-Select(加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆泰克公司(Clontech，PaloAlto，CA))。
为构建基因组文库，基因组DNA大片段通过片段化如使用限制性内切酶生成，并且连接至载体DNA以形成可包装至适当载体的连环体。实现这些末端的方法以及测序以鉴定核酸序列的方法是本领域熟知的。适当分子生物学技术的例子以及足以指导技术人员完成多种构建、克隆和筛选方法的指导可见于Sambrook，etal.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratoryVols.1-3(1989)(Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，冷泉港实验室，第1-3卷，1989年)，MethodsinEnzymology，Vol.152：GuidetoMolecularCloningTechniques，BergerandKimmel，Eds.，SanDiego：AcademicPress，Inc.(1987)(《酶学方法》，第152卷，“分子克隆技术指南”，Berger和Kimmel编辑，圣地亚哥，学术出版社，1987年)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel，etal.，Eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《分子生物学实验手册》，Ausubel等人编辑，格林出版和威利网络科技出版公司，纽约，1995年)；PlantMolecularBiology：ALaboratoryManual，Clark，Ed.，Springer-Verlag，Berlin(1997)(《植物分子生物学：实验室手册》，Clark编辑，施普林格出版社，柏林，1997年)。构建基因组文库的试剂盒也可商购获得。
cDNA或基因组文库可使用探针基于本发明的多核苷酸序列，例如本文公开的那些进行筛选。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离相同或不同植物物种中的同源基因。本领域的技术人员将会知道各种杂交严格性程度可用于该测定法；并且杂交和洗涤介质都可以是严格的。
目的核酸也可使用扩增技术从核酸样品扩增。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可用于扩增本发明多核苷酸的序列以及直接来自基因组DNA或cDNA文库的相关基因。PCR和其他体外扩增方法也可用于例如克隆编码待表达蛋白质的核酸序列，以将核酸用作检测样品中所需mRNA存在、核酸测序或其他用途的探针。T4基因32蛋白质(BoehringerMannheim)可用于提高长PCR产物的得率。
基于PCR的筛选方法已有描述。Wilfinger等人描述了基于PCR的方法，其中最长的cDNA在第一步鉴定，以从研究中消除不完整克隆。BioTechniques，22(3)：481-486(1997)(《生物技术》，第22卷，第3期：第481-486页，1997年)。此类方法与上述全长cDNA构建方法结合特别有效。
B.构建核酸的合成方法
本发明的分离核酸也可以通过直接化学合成制备，其方法例如Narangetal.，Meth.Enzymol.68：90-99(1979)(Narang等人，《酶学方法》，第68卷，第90-99页，1979年)的磷酸三酯方法；Brownetal.，Meth.Enzymol.68：109-151(1979)(Brown等人，《酶学方法》，第68卷，第109-151页，1979年)的磷酸二酯方法；Beaucageetal.，Tetra.Lett.22：1859-1862(1981)(Beaucage等人，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1862页，1981年)的二乙基亚磷酰胺方法；BeaucageandCaruthers，Tetra.Letts.22(20)：1859-1862(1981)(Beaucage和Caruthers，《四面体通讯》，第22卷，第20期，第1859-1862页，1981年)所描述的固相亚磷酰胺三酯方法，例如使用自动合成仪，例如如在Needham-VanDevanteretal.，NucleicAcidsRes.，12：6159-6168(1984)(Needham-VanDevanter等人，《核酸研究》，第12卷，第6159-6168页，1984年)中所描述的自动合成仪；以及美国专利No.4,458,066的固相载体方法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过将该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变为双链DNA。技术人员将会认识到，虽然DNA的化学合成最好用于约100个碱基或更少碱基的序列，但可通过连接较短的序列来获得较长的序列。
重组表达盒
本发明还提供包含本发明的核酸的重组表达盒。可将编码所需的本发明多肽的核酸序列，例如编码本发明的全长多肽的cDNA或基因组序列用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入到所需的宿主细胞中。重组表达盒将通常包含有效连接至转录起始调控序列的本发明多核苷酸，所述转录起始调控序列将指导所述多核苷酸在预期的宿主细胞(如转化植物的组织)中的转录。
例如，植物表达载体可包含(1)处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆植物基因和(2)显性选择性标志。如果需要，这种植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
可采用会引导本发明多核苷酸在再生植物的所有组织中表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、源自根癌农杆菌T-DNA的1′-或2′-启动子、遍在蛋白1启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、pEmu启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子和源自技术人员已知的各种植物基因的其他转录起始区。
或者，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定组织中或在更精确的环境或发育控制下的表达。这种启动子在这里称为“诱导型”启动子。可通过诱导型启动子实现转录的环境条件包括病原体攻击、厌氧条件或光线的存在。诱导型启动子的例子为Adh1启动子(其可由低氧或冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可由热胁迫诱导)和PPDK启动子(其可由光诱导)。
处于发育控制下的启动子的实例包括只在或者优先在某些组织如叶、根、果实、种子或花中引发转录的启动子。示例性启动子包括花药特异性启动子5126(美国专利No.5,689,049和5,689,051)、glob-1启动子和γ-玉米醇溶蛋白启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。
异源性和非异源性(即，内源性)启动子二者可用于本发明核酸的直接表达。这些启动子也可用于例如重组表达盒，以驱动反义核酸的表达，以减少、增加或变更期望的组织中本发明蛋白质的浓度和/或组成。因此，在一些实施方案中，核酸构建体将包括在植物细胞中(如在玉米中)有功能、有效连接至本发明的多核苷酸的启动子。用于这些实施方案的启动子包括驱动本发明的多肽表达的内源性启动子。
在一些实施方案中，用作启动子或增强子元件的分离核酸可引入本发明多核苷酸的非异源形式的适当位置(通常为上游)，以上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如，内源启动子可通过突变、缺失和/或置换在体内进行变更(参见Kmiec，美国专利5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可将分离的启动子以相对于本发明的基因适当的取向和距离引入到植物细胞中以控制该基因的表达。基因表达可在适于植物生长的条件下调节，以变更植物细胞中本发明多肽的总浓度和/或变更其组成。
因此，本发明提供制备有效连接至本发明多核苷酸的天然、内源性(即，非异源)形式的异源性启动子和/或增强子的组分以及方法。
用于鉴定具有特定表达模式(例如在组织类型、细胞类型、发育阶段和/或环境条件方面)的启动子的方法是本领域熟知的。参见例如TheMaizeHandbook，Chapters114-115，FreelingandWalbot，Eds.，Springer，NewYork(1994)(《玉蜀黍手册》，第114-115章，Freeling和Walbot编辑，施普林格出版社，纽约，1994年)；CornandCornImprovement，3rdedition，Chapter6，SpragueandDudley，Eds.，AmericanSocietyofAgronomy，Madison，Wisconsin(1988)(《玉米和玉米改良》，第3版，第6章，Sprague和Dudley编辑，美国农学会，威斯康星州麦迪逊市，1988年)。
启动子分离方法中的典型步骤是鉴定在靶组织中以一定程度特异性表达的基因产物。包括以下方法：与cDNA文库的差异杂交；减数杂交；差异展示；差异二维蛋白质凝胶电泳；DNA探针阵列；以及已知要在靶组织中以一定的特异性表达的蛋白质的分离。这类方法是本领域技术人员熟知的。用于鉴定启动子的市售产品是本领域已知的，如Clontech公司(美国加州帕洛阿尔托市(PaloAlto，CA))的UniversalGenomeWalkerKit。
对于基于蛋白质的方法，有益的是，获得被鉴定的蛋白质的至少一部分的氨基酸序列，然后使用该蛋白质序列作为基础用于制备可用作探针的核酸，该探针用于直接鉴定基因组DNA或优选地鉴定来自从该靶组织制备的文库的cDNA克隆。一旦鉴定了这种cDNA克隆，可使用该序列来鉴定所指定的基因的转录物的5’末端处的序列。对于差异杂交、减数杂交和差异展示，使用被鉴定为在靶组织中富集的核酸序列来鉴定所指定的基因的转录物的5’末端处的序列。一旦鉴定了这种序列，从蛋白质序列起始或从核酸序列起始，这些被鉴定为来自该基因转录物的序列中的任何一个序列都可用于筛选从该靶生物体制备的基因组文库。用于鉴定和确认转录起始位点的方法是本领域熟知的。
在分离在特定环境条件或胁迫下表达、或在特定组织中表达或在特定发育阶段中表达的启动子的过程中，鉴定到了许多在期望的情况下表达、在期望的组织中表达或在期望的阶段中表达的基因。进一步的分析将揭示每种特定基因在该植物的一个或多个其他组织中的表达。可以鉴定到在期望的组织中或条件下具有活性但在任何其他普通组织中没有活性的启动子。
为鉴定启动子序列，针对本文所描述的克隆的5’部分分析启动子序列的序列特征。例如，启动子序列元件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，其通常为位于转录起始位点上游大约20至40个碱基对处的5至10个碱基对的富含AT的区段。TATA盒的鉴定在本领域中是熟知的。例如，一种预测这个元件的位置的方式是使用标准的RNA作图技术如引物延伸、S1分析和/或RNA酶保护来鉴定转录起始位点。为确认富含AT的序列的存在，可进行结构-功能分析，该分析涉及对假定的区域进行诱变并定量该突变对连锁的下游报道基因的表达的影响。参见例如TheMaizeHandbook，Chapter114，FreelingandWalbot，Eds.，Springer，NewYork，(1994)(《玉蜀黍手册》，第114章，Freeling和Walbot编辑，施普林格出版社，纽约，1994年)。
在植物中，在TATA盒的更上游，在位置-80至-100处，通常有启动子元件(即CAAT盒)，其中有一系列的腺嘌呤围绕着三核苷酸G(或T)NG。J.Messingetal.，inGeneticEngineeringinPlants，Kosage，MeredithandHollaender，Eds.，pp.221-2271983(J.Messing等人，载于《植物中的遗传工程》，Kosage、Meredith和Hollaender编辑，第221-227页，1983年)。在玉蜀黍中，没有充分保守的CAAT盒，但在TATA盒的上游有几个短的保守的蛋白质结合基序。这些基序包括用于参与光调节、厌氧诱导、激素调节或花青苷生物合成的反式作用转录因子的基序，视每种基因所需而定。
一旦知道了启动子和/或基因序列，从位于转录起始位点或翻译起始位点5’的基因组DNA选择合适大小的区域，然后将这类序列连接到编码序列。如果转录起始位点用作融合点，则多个可能的5’非翻译区中的任何一个都可在转录起始位点和部分编码序列之间使用。如果使用位于特定启动子的3’末端的翻译起始位点，则将它与编码序列的甲硫氨酸起始密码子直接连接。
如果多肽表达是所期望的，则通常合乎需要的是在多核苷酸编码区的3′端包括聚腺苷酸化区。聚腺苷酸化区可源于天然基因，源于多个其他植物基因或源于T-DNA。待添加的3′端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或作为另一种选择，源于另一植物基因，或较不优选地，源自任何其他真核基因。
可将内含子序列添加至部分编码序列的5′非翻译区或编码序列以增加胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在动物和植物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白质水平上都能增加基因表达最高达1000倍。BuchmanandBerg，Mol.CellBiol.8：43954405(1988)(Buchman和Berg，《分子细胞生物学》，第8卷，第4395-4405页，1988年)；Callisetal.，GenesDev.1：1183-1200(1987)(Callis等人，《基因与发展》，第1卷，第1183-1200页，1987年)。当设置在接近转录单位的5′端时，这种基因表达的内含子增强通常是最大的。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。一般参见TheMaizeHandbook，Chapter116，FreelingandWalbot，Eds.，Springer，NewYork(1994)(《玉蜀黍手册》，第116章，Freeling和Walbot编辑，施普林格出版社，纽约，1994年)。
包含来自本发明多核苷酸的序列的载体将通常包含标志基因，其对植物细胞赋予选择性表型。通常，选择性标志基因将编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对壮观霉素这种抗生素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这种基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素的抗性，ALS基因突变编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
可用于在高等植物中表达基因的典型载体是本领域熟知的，包括衍自根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，如Rogersetal.，Meth.inEnzymol.，153：253-277(1987)(Rogers等人，《酶学方法》，第153卷，第253-277页，1987年)所描述。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本发明的示例性的根瘤农杆菌载体是以下文献中的pKYLX6和pKYLX7质粒：Schardletal.，Gene，61：1-11(1987)(Schardl等人，《基因》，第61卷，第1-11页，1987年)以及Bergeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：8402-8406(1989)(Berger等人，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第8402-8406页，1989年)。本发明中可用的另一种载体是质粒pBI101.2，其可得自加利福尼亚州帕洛阿尔托的科隆达生物技术实验室有限公司(ClontechLaboratories，Inc.(PaloAlto，CA))。
本发明的多核苷酸可按需要在正义或反义方向表达。可以理解的是，在正义或反义方向控制基因表达可对可观察的植物特征具有直接影响。反义技术可便利地用于抑制植物中的基因表达。为了实现这一点，克隆来自所需基因的核酸片段并且有效连接至启动子，以转录RNA的反义链。然后将构建体转化到植物中，生成RNA的反义链。
在植物细胞中，已证实反义RNA通过防止编码目的酶的mRNA积累而抑制基因表达，参见例如Sheehyetal.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)85：8805-8809(1988)(Sheehy等人，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第8805-8809页，1988年)；以及Hiatt等人，美国专利No.4,801,340。
另一种抑制方法是正义抑制。引入构造为正义方向的核酸已证实是阻断靶基因转录的有效方式。对于使用该方法调节内源性基因表达的例子，参见Napolietal.，ThePlantCell2：279-289(1990)(Napoli等人，《植物细胞》，第2卷，第279-289页，1990年)和美国专利No.5,034,323。
催化性RNA分子或核酶也可用于抑制植物基因的表达。可以设计实际上与任何靶RNA特异性配对并且在特定位置裂解磷酸二酯骨架，从而使靶RNA功能性失活的核酶。在进行该裂解时，核酶本身不被变更，因此能够循环和裂解其他分子，使其成为真正的酶。在反义RNA内包含核酶序列赋予其RNA切割活性，从而增加构建体的活性。靶RNA特异性核酶的设计和使用在Haseloffetal.，Nature334：585591(1988)(Haseloff等人，《自然》，第334卷，第585-591页，1988年)中有描述。多种交联剂、烷基化剂和作为本发明多核苷酸侧基的自由基生成物质可用于结合、标记、检测和/或裂解核酸。例如Vlassov，V.V.，etal.，NucleicAcidsRes(1986)14：4065-4076(Vlassov，V.V.等人，《核酸研究》，1986年，第14卷，第4065-4076页)描述了单链DNA片段与互补于靶序列的核苷酸的烷基化衍生物的共价结合。由同一小组进行的类似工作的报告为Knorre，D.G.，etal.，Biochimie(1985)67：785789(Knorre，D.G.等人，《生物化学》，1985年，第67卷，第785-789页)所作的报告。Iverson和Dervan。
本发明还提供包含与本发明多肽具有特定序列同一性的多肽的蛋白质。序列同一性百分数为选自60至99的整数。示例性序列同一性值包括60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％。
技术人员将会知道，本发明包括本发明的催化活性多肽(即，酶)。催化活性多肽具有为天然(非合成)、内源性多肽的比活性的至少20％、30％或40％，优选地至少50％、60％或70％以及最优选地至少80％、90％或95％的比活性。另外，底物特异性(kcat/Km)任选地与天然(非合成)、内源性多肽基本上类似。通常，Km将为天然(非合成)、内源性多肽的至少30％、40％或50％；更优选地至少60％、70％、80％或90％。测定和定量酶活性和底物特异性(heat/Km)大小的方法是本领域技术人员熟知的。
通常，本发明的蛋白质当作为免疫原被呈递时，将引起与本发明多肽特异性反应的抗体的产生。另外，本发明的蛋白质不结合被相同多肽完全免疫吸附的本发明多肽产生的抗血清。用于测定结合的免疫测定法是本领域技术人员熟知的。优选的免疫测定法是竞争性免疫测定法，如下文所讨论。因此，本发明的蛋白质可用作构建对本发明蛋白质具有免疫反应性的抗体的免疫原，所述蛋白质用于例如免疫测定法或蛋白质纯化技术的示例性用途。
蛋白质在宿主细胞中的表达
使用本发明的核酸，可在重组工程细胞如细菌、酵母、昆虫、哺乳动细胞或优选的植物细胞中表达本发明的蛋白质。这类细胞在非天然条件下(例如，在数量、组成、位置和/或时间方面)产生蛋白，因为它们已通过人为干预被遗传变更成在非天然条件下产生蛋白。
可以预期的是，本领域的技术人员会知道多种可用于表达编码本发明的蛋白质的核酸的表达体系。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白质的各种方法。
简单概括而言，编码本发明蛋白质的分离核酸的表达通常可通过使例如DNA或cDNA有效连接至启动子(组成型或调节型)、然后整合进表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有可用于调节编码本发明蛋白质的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为获得克隆基因的高水平表达，需要构建至少含有用于引导转录的强启动子、用于起始翻译的核糖体结合位点以及转录/翻译终止子的表达载体。技术人员将认识到，可对本发明的蛋白质进行修饰而不减低其生物活性。可作出一些修饰，以促进靶向分子的克隆、表达和掺入到融合蛋白中。
这种修饰是本领域技术人员所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端设置额外的氨基酸(例如多聚His)以产生便利地定位的纯化序列。也可引入限制性位点或终止密码子。
A.在原核生物中的表达
原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最通常由大肠杆菌的多种菌株代表；然而，也可使用其他微生物株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核控制序列，包括诸如β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Changetal.，Nature198：1056(1977))(Chang等人，《自然》，第198卷，第1056页，1977年)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddeletal.，NucleicAcidsRes.8：4057(1980))(Goeddel等人，《核酸研究》，第8卷，第4057页，1980年))和λ衍生的PL启动子之类的常用启动子，以及N-基因核糖体结合位点(Shimatakeetal.，Nature292：128(1981))(Shimatake等人，《自然》，第292卷，第128页，1981年)。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标志也是有用的。这种标志的例子包括对氨苄青霉素、四环素或氯霉素具有特定抗性的基因。
选择载体以使得能引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒感染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。可获得使用芽孢杆菌属(Bacillussp.)和沙门氏菌属(Salmonella)的表达系统来用于表达本发明的蛋白质(Palva，etal.，Gene22：229-235(1983)(Palva等人，《基因》，第22卷，第229-235页，1983年)；Mosbach，etal.，Nature302：543545(1983))(Mosbach等人，《自然》，第302卷，第543-545页，1983年))。
B.在真核生物中的表达
多种真核表达系统如酵母细胞系、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简要解释的，可在这些真核系统中表达本发明的多核苷酸。在一些实施方案中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达系统，用于产生本发明的蛋白质。
异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman，F.，etal.，MethodsinYeastGenetics，ColdSpringHarborLaboratory(1982)(Sherman，F.等人，《酵母遗传学中的方法》，冷泉港实验室，1982年)是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方案是本领域已知的并可从商业供应商(例如英杰公司(Invitrogen))获得。
根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)和复制起始区、终止序列等等。
本发明的蛋白质，一旦表达，就可通过裂解细胞并且向裂解物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白印记技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。
还可将编码本发明的蛋白质的序列连接到多种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。可用于产生肽的细胞培养物的例示是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常会是单层细胞的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液。本领域已开发了多种能够表达完整蛋白的合适宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子(例如CMV启动子、HSVtk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queenetal.，Immunol.Rev.89：49(1986))(Queen等人，《免疫学评述》，第89卷，第49页，1986年)和必要的加工信息位点例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(如，SV40大TAg多聚A添加位点)和转录终止子序列。可用于产生本发明蛋白质的其他动物细胞可(例如)从美国典型培养物保藏中心获得。
用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系，例如Schneider细胞系(参见Schneider，J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-365(1987)(Schneider，《胚实验形态学杂志》，第27卷，第353-365页，1987年)。
如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列掺入载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的一个例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague，etal.，J.Virol.45：773-781(1983))(Sprague等人，《病毒学杂志》，第45卷，第773-781页，1983年)。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列整合进载体，例如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些。Saveria-Campo，M.，BovinePapillomaVirusDNAaEukaryoticCloningVectorinDNACloningVol.IIaPracticalApproach，D.M.Glover，Ed.，IRLPress，Arlington，Virginiapp.213-238(1985)(Saveria-Campo，M.，“牛乳头瘤病毒DNA：一种真核克隆载体”，载于《DNA克隆第II卷实用方法》，D.M.Glover编辑，IRL出版社，弗吉尼亚州阿灵顿，第213-238页，1985年)。
提高ACC脱氨酶多肽的活性和/或水平
提供了用于调节本发明的ACC脱氨酶多肽的活性和/或水平的方法。可通过将ACC脱氨酶多肽提供给植物，来实现本发明的ACC脱氨酶多肽的水平和/或活性的调节。该ACC脱氨酶多肽可通过如下方式来提供：将编码该ACC脱氨酶多肽的氨基酸序列引入该植物中，将编码ACC脱氨酶多肽的核苷酸序列引入该植物中，或者修饰编码本发明的ACC脱氨酶多肽的基因组座位。
如本文别处所论述的，本领域已知有多种方法用于将多肽提供给植物，包括但不限于将多肽直接引入植物中，将编码具有增强的活性如的多肽的多核苷酸构建体引入植物中(短暂引入或稳定引入)。还应认识到，本发明的方法可采用不能够在转化的植物中引导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸。因此，可通过变更编码ACC脱氨酶多肽的基因或其启动子来提高ACC脱氨酶多肽的水平和/或活性。参见例如Kmiec，美国专利5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868。因此，提供了携带ACC脱氨酶基因的突变的诱变植物，其中所述突变能提高ACC脱氨酶的表达或者提高编码的ACC脱氨酶多肽的活性。
降低ACC脱氨酶多肽的活性和/或水平
在某些实施方案中，提供了通过用能表达可抑制ACC脱氨酶多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞，来降低或消除本发明的ACC脱氨酶多肽的活性的方法。该多核苷酸可通过防止ACC脱氨酶相关信使RNA的转录或翻译来直接抑制ACC脱氨酶多肽的表达，或者通过编码下述多肽来间接抑制ACC脱氨酶多肽的表达，所述多肽能抑制编码ACC脱氨酶多肽的ACC脱氨酶基因的转录或翻译。用于抑制或消除基因在植物中的表达的方法是本领域所熟知的，任何这种方法可用于本发明中来抑制ACC脱氨酶多肽的表达。
根据本发明，如果ACC脱氨酶多肽的蛋白水平为该同一ACC脱氨酶多肽在未经过遗传修饰或诱变以抑制该ACC脱氨酶多肽的表达的植物中的蛋白水平的不到70％，则ACC脱氨酶多肽的表达被抑制。在本发明的具体实施方案中，该ACC脱氨酶多肽在根据本发明的经修饰的植物中的蛋白水平，为该同一ACC脱氨酶多肽在不属于突变体的植物或者未经过遗传修饰以抑制该ACC脱氨酶多肽的表达的植物中的蛋白水平的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％或不到2％。ACC脱氨酶多肽的表达水平可例如通过测定在植物细胞或植物中表达的ACC脱氨酶多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量植物细胞或植物中的乙烯响应或通过测量植物中的表型变化来间接测量。进行这类测定法的方法在本文别处进行了描述。
在本发明的其他实施方案中，通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除ACC脱氨酶多肽的活性，该表达盒包含编码能抑制ACC脱氨酶多肽的活性的多肽的多核苷酸。如果该ACC脱氨酶多肽的活性小于在未进行修饰以抑制同一ACC脱氨酶多肽的活性的植物中的该多肽的活性的70％，则根据本发明ACC脱氨酶多肽的活性得到抑制。在本发明的具体实施方案中，该ACC脱氨酶多肽在根据本发明的经修饰的植物中的活性，为该同一多肽在未经过修饰以抑制该ACC脱氨酶多肽的表达的植物中的活性的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％或不到5％。ACC脱氨酶多肽的活性当通过本文别处描述的测定方法检测不到时，则根据本发明它“被消除”。测定ACC脱氨酶多肽的活性的变更的方法在本文别处描述。
在其他实施方案中，可通过破坏编码ACC脱氨酶多肽的基因来降低或消除ACC脱氨酶多肽的活性。本发明涵盖携带ACC脱氨酶基因中的突变的诱变植物，其中所述突变能减少相关基因的表达或者抑制所编码的ACC脱氨酶多肽的活性。
因而，有许多方法可用于降低或消除ACC脱氨酶多肽的活性。此外，有不止一种方法可用于减少单种ACC脱氨酶多肽的活性。
1.基于多核苷酸的方法：
在本发明的一些实施方案中，用表达盒转化植物，该表达盒能够表达可抑制本发明的ACC脱氨酶多肽的表达的多核苷酸。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，出于本发明的目的，能够表达可抑制至少一种ACC脱氨酶多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生可抑制本发明的至少一种ACC脱氨酶多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白质或多肽从DNA分子的“表达”或“产生”是指该编码序列的转录和翻译以产生该蛋白质或多肽，而蛋白质或多肽从RNA分子“表达”或“产生”是指该RNA编码序列的翻译以产生蛋白质或多肽。
抑制ACC脱氨酶多肽的表达的多核苷酸和方法的例子包括正义抑制、共抑制、反义抑制、双链RNA干扰、发夹RNA干扰、含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶、小干扰RNA或微RNA。其他抑制方法可包括基于多肽的基因表达抑制或基于多肽的蛋白质活性抑制，以及基因破坏。
活性降低的突变体植物
用于降低或消除植物中的内源基因的表达的另外方法也是本领域已知的，并且可类似地应用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和快中子缺失诱变，快中子缺失诱变以反向遗传学方式(使用PCR)用于鉴别其中内源基因已缺失的植物株系。这些方法的例子参见Ohshima，etal.，(1998)Virology243：472-481(Ohshima等人，1998年，《病毒学》，第243卷，第472-481页)；Okubara，etal.，(1994)Genetics137：867-874(Okubara等人，1994年，《遗传学》，第137卷，第867-874页)；以及Quesada，etal.，(2000)Genetics154：421-436(及Quesada等人，2000年，《遗传学》，第154卷，第421-436页)；将这些参考文献的每一个以引用的方式全文并入本文。此外，一种用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法TILLING(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes(定向诱导基因组局部突变))也适用于本发明，该方法利用变性HPLC或者对选定的PCR产物的选择性内切核酸酶消化。参见McCallum，etal.，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)，将其以引用方式并入本文。
影响基因表达或干扰所编码的蛋白质的功能(增强的活性)的突变是本领域所熟知的。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基的突变在抑制所编码的蛋白质的活性方面是特别有效的。植物ACC脱氨酶多肽的适于以消除活性为目标而进行的诱变的保守残基已得到描述。可根据熟知的程序分离这种突变体，并且可通过遗传杂交对不同ACC脱氨酶相关基因座中的突变进行堆叠。参见例如Gruis，etal.，(2002)PlantCell14：2863-2882(Gruis等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第2863-2882页)。
本发明涵盖另外的用于减少或消除一种或多种ACC脱氨酶多肽的活性的方法。用于变更或突变植物中的基因组核苷酸序列的其他方法的例子是本领域已知的，包括但不限于使用RNA：DNA载体、RNA：DNA突变载体、RNA：DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自互补RNA：DNA寡核苷酸以及重组工程寡核碱基(recombinogenicoligonucleobase)。这种载体和使用方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,565,350；美国专利No.5,731,181；美国专利No.5,756,325；美国专利No.5,760,012；美国专利No.5,795,972；和美国专利No.5,871,984；将这些专利中的每一个以引用的方式并入本文。另参见WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham，etal.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8774-8778(Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第8774-8778页)；将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。
细胞的转染/转化
转化/转染的方法对于本发明而言并不关键；目前有各种转化或转染方法可供采用。随着更新的方法可用于转化作物或其他宿主细胞，可直接应用这类方法。
因此，开发了多种方法将DNA序列插入宿主细胞的基因组，以获得序列的转录和/或翻译，使生物体发生表型变化。因此，可采用任何能提供有效转化/转染的方法。
A.植物转化
编码期望的本发明多肽的DNA序列，例如编码全长蛋白质的cDNA或基因组序列，将被用于构建可被引入到期望的植物中的重组表达盒。
本发明的分离核酸可根据本领域已知的技术引入到植物中。通常，制备如上所描述并且适合于植物细胞的转化的重组表达盒。转化多种高等植物物种的技术是熟知的，并且在技术、科学和专利文献中有描述。参见例如Weisingetal.，Ann.Rev.Genet.22：421-477(1988)(Weising等人，《基因研究年鉴》，第22卷，第421-477页，1988年)。例如，DNA构建体可使用例如电穿孔、聚乙二醇(PEG)穿孔、粒子轰击、硅纤维递送或植物细胞原生质体或胚性愈伤组织显微注射的技术直接引入植物细胞的基因组DNA。参见例如Tomes，etal.，DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment.pp.197213inPlantCell，TissueandOrganCulture，FundamentalMethods.eds.O.L.GamborgandG.C.Phillips.Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork，1995.(Tomes等人，“通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中”，第197-213页，载于《植物细胞、组织和器官培养基本方法》，O.L.Gamborg和G.C.Phillips编辑，施普林格出版社，柏林/海德堡/纽约，1995年)。作为另一种选择，可将DNA构建体与合适的T-DNA侧翼区组合，并且引入到常规的根瘤农杆菌宿主载体中。当细胞被细菌感染时，根瘤农杆菌宿主的毒性功能将引导构建体和相邻标志插入植物细胞DNA。参见美国专利No.5,591,616。
使用PEG沉淀引入DNA构建体在以下文献中有描述：Paszkowskietal.，EmboJ.3：2717-2722(1984)(Paszkowski等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第2717-2722页，1984年)。电穿孔技术在Frommetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：5824(1985)(Fromm等人，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第5824页，1985年)。弹道转化技术在Kleinetal.，Nature327：70-73(1987)(Klein等人，《自然》，第327卷，第70-73页，1987年)。
根瘤农杆菌介导转化技术在科学文献中详细描述。参见例如Horschetal.，Science233：496-498(1984)(Horsch等人，《科学》，第233卷，第496-498页，1984年)以及Fraleyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80：4803(1983)(Fraley等人，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第4803页，1983年)。虽然农杆菌属(Agrobacterium)主要用于双子叶植物，但某些单子叶植物也可通过农杆菌属转化。例如，玉蜀黍的农杆菌转化在美国专利No.5,550,318中有描述。
其他转染或转化方法包括(1)毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)介导的转化(参见例如LichtensteinandFullerIn：GeneticEngineering，vol.6，PWJRigby，Ed.，London，AcademicPress，1987(Lichtenstein和Fuller，载于《遗传工程》，第6卷，PWJRigby编辑，伦敦，学术出版社，1987年)；以及Lichtenstein，C.P.，andDraper，J，.In：DNACloning，Vol.II，D.M.Glover，Ed.，Oxford，IRIPress，1985)(Lichtenstein，C.P.和Draper，J.，载于《DNA克隆》，第II卷，D.M.Glover编辑，牛津，IRI出版社，1985年)，PCT专利申请PCT/US87/02512(WO88/02405，公布于1988年4月7日)描述了毛根农杆菌菌株A4及其Ri质粒以及根瘤农杆菌载体pARC8或pARC16的使用，(2)脂质体介导的DNA摄入(参见例如Freemanetal.，PlantCellPhysiol.25：1353(1984)(Freeman等人，《植物细胞生理学》，第25卷，第1353页，1984年))，(3)涡旋方法(参见例如Kindle，Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA)87：1228(1990)(Kindle，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第1228页，1990年)。
DNA也可通过将DNA直接转移到花粉而引入植物，如以下文献所描述：Zhouetal.，MethodsinEnzymology，101：433(1983)(Zhou等人，《酶学方法》，第101卷，第433页，1983年)；D.Hess，InternRev.Cytol.，107：367(1987)(D.Hess，《细胞学国际评论》，第107卷，第367页，1987年)；Luoetal.，PlantMol.Biol.Reporter，6：165(1988)(Luo等人，《植物分子生物学报导》，第6卷，第165页，1988年)。多肽编码基因的表达可通过将DNA注射到植物的繁殖器官获得，如Penaetal.，Nature，325.：274(1987)(Pena等人，《自然》，第325卷，第274页，1987年)。
DNA也可直接注入未成熟胚胎和干燥胚胎再水化形式的细胞，如以下文献所描述：Neuhausetal.，Theor.Appl.Genet.，75：30(1987)(Neuhaus等人，《理论与应用遗传学》，第75卷，第30页，1987年)和Benbrooketal.，inProceedingsBioExpo1986，Butterworth，Stoneham，Mass.，pp.27-54(1986)(Benbrook等人，载于《1986年生物博览会会议录》，巴特沃斯，马萨诸塞州史东罕，第27-54页，1986年)。可用作载体的多种植物病毒是本领域已知的，并且包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒、雀麦花叶病毒和烟草花叶病毒。
B..原核生物、低等真核生物和动物细胞的转染动物和低等真核生物(例如酵母)宿主细胞适于转染，或者通过各种手段使其适于转染。存在若干为人所熟知的将DNA引入动物细胞中的方法。这些方法包括：磷酸钙沉淀、受体细胞与含有该DNA的细菌原生质体融合、用含有该DNA的脂质体处理受体细胞、DEAE糊精法、电穿孔法、基因枪法和将DNA直接显微注射进细胞中。转染的细胞通过本领域熟知的方法培养。Kuchler，R.J.，BiochemicalMethodsinCellCultureandVirology，Dowden，HutchinsonandRoss，Inc.(1977)(Kuchler，R.J.，《细胞培养和病毒学中的生物化学方法》，道登、哈钦森和罗斯公司，1977年)。
蛋白质的合成
本发明的蛋白质可使用非细胞合成方法构建。长度小于约50个氨基酸的蛋白质的固相合成可通过将序列的C-末端氨基酸连接至不溶性支持体，然后按顺序添加序列中其余的氨基酸而实现。固相合成技术在以下文献中有描述：BaranyandMerrifield，Solid-PhasePeptideSynthesis，pp.3-284inThePeptides：Analysis，Synthesis，Biology.Vol.2：SpecialMethodsinPeptideSynthesis，PartA.(Barany和Merrifield，固相肽合成，第3-284页，载于《肽：分析、合成、生物学》，第2卷：肽合成的特殊方法，第A部分)；Merrifield，etal.，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2156(1963)(Merrifield等人，《美国化学学会杂志》，第85卷，第2149-2156页，1963年)以及Stewartetal.，SolidPhasePeptideSynthesis，2nded.，PierceChem.Co.，Rockford，Ill.(1984)(Stewart等人，《固相肽合成》，第2版，皮尔斯化学公司，美国伊利诺伊州罗克福德市，1984年)。更长的蛋白质可通过较短片段的氨基和羧基末端缩合而合成。通过活化羧基末端形成肽键的方法(如，使用偶联剂N,N′-二环己基碳二亚胺)是技术人员已知的。
蛋白质的纯化
本发明的蛋白质可通过本领域的技术人员熟知的标准技术纯化。重组制备的本发明蛋白质可直接表达或以融合蛋白表达。重组蛋白质通过细胞裂解(如，超声、弗氏压碎)和亲和色谱的组合纯化。对于融合产物，随后使用适当蛋白水解酶对融合蛋白的消化释放所需重组蛋白质。
本发明的重组或合成蛋白质可通过本领域熟知的标准技术纯化为实质纯度，所述标准技术包括洗涤剂增溶、采用例如硫酸铵的底物的选择性沉淀、柱层析、免疫纯化方法等等。参见例如R.Scopes，ProteinPurification：PrinciplesandPractice，Springer-Verlag：NewYork(1982)(R.Scopes，《蛋白质纯化：原理与实践》，施普林格出版社，纽约，1982年)；Deutscher，GuidetoProteinPurification，AcademicPress(1990)(Deutscher，《蛋白质纯化指南》，学术出版社，1990年)。例如，抗体可由蛋白质产生，如本文所述。从大肠杆菌的纯化可按照美国专利No.4,511,503中所述的方法实现。然后蛋白质可从表达该蛋白质的细胞分离，并通过如本文所述的标准蛋白质化学技术进一步纯化。表达蛋白质的检测通过本领域已知的方法实现，包括例如放射免疫测定法、蛋白质印迹技术或免疫沉淀。
转基因植物再生
可将通过上述转化技术中的任何一种技术得到的转化植物细胞进行培养以再生出具有转化的基因型的完整植物。此类再生技术通常依赖于在组织培养生长培养基中操作某些植物激素。对于玉蜀黍的转化和再生，参见Gordon-Kammetal.，ThePlantCell，2：603-618(1990)(Gordon-Kamm等人，《植物细胞》，第2卷，第603-618页，1990年)。
转化了植物表达载体的植物细胞可例如按照标准的植物组织培养技术从单个细胞、愈伤组织或叶圆片进行再生。本领域公知，几乎任何植物的各种细胞、组织和器官都可成功地进行培养以再生整株植物。从培养的原生质体再生出植物，这在以下文献中有描述：Evansetal.，ProtoplastsIsolationandCulture，HandbookofPlantCellCulture，MacmillanPublishingCompany，NewYork，pp.124-176(1983)(Evans等人，《植物细胞培养手册，原生质体分离和培养》，麦克米伦出版公司，纽约，第124-176页，1983年)；以及Binding，RegenerationofPlants，PlantProtoplasts，CRCPress，BocaRaton，pp.21-73(1985)(Binding，《植物、植物原生质体的再生》，CRC出版社，伯克莱屯，第21-73页，1985年)。
从叶外植体再生出含有通过农杆菌引入的外来基因的植物，可如Horschetal.，Science，227：1229-1231(1985)(Horsch等人，《科学》，第227卷，第1229-1231页，1985年)。在这个程序中，使转化体在选择剂的存在下和在能诱导被转化的植物物种的苗的再生的培养基中生长，如Fraleyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)，80：4803(1983)(Fraley等人，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第4803页，1983年)。这个过程通常在两到四个星期内产生苗，然后将这些转化体苗转移到含有选择剂和用于防止细菌生长的抗生素的适当的根诱导培养基。本发明的转基因植物可以是能育的或不育的。
也可从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。这种再生技术在以下文献进行了概述：Kleenetal.，Ann.Rev.ofPlantPhys.38：467-486(1987)(Kleen等人，《植物生理学研究年鉴》，第38卷，第467-486页，1987年)。从单纯植物原生质体或者从各种外植体再生出植物，这是本领域公知的。参见例如MethodsforPlantMolecularBiology，A.WeissbachandH.Weissbach，eds.，AcademicPress，Inc.，SanDiego，Calif.(1988)(《植物分子生物学方法》，A.Weissbach和H.Weissbach编辑，学术出版社，美国加州圣地亚哥，1988年)。这个再生和生长过程包括以下步骤：选择转化体细胞和苗，使转化体苗生根，在土壤中生长小植株。对于玉蜀黍细胞培养和再生，主要参见TheMaizeHandbook，FreelingandWalbot，Eds.，Springer，NewYork(1994)(《玉蜀黍手册》，Freeling和Walbot编辑，施普林格，纽约，1994年)；CornandCornImprovement，3rdedition，SpragueandDudleyEds.，AmericanSocietyofAgronomy，Madison，Wisconsin(1988)(《玉米与玉米概率》，第3版，Sprague和Dudley编辑，美国农学会，威斯康星州麦迪逊市，1988年)。
技术人员会认识到，在重组表达盒稳定掺入在转基因植物中并确认有效后，可通过有性杂交将它引入到其他植物中。取决于要杂交的物种，可使用多种标准的育种技术中的任何一种。在无性繁殖的作物中，可通过获取插条或者通过组织培养技术来繁殖成熟的转基因植物以产生多个相同的植株。
可对合乎需要的转基因植株作出选择，并以无性方式获得和繁殖新的品种以供商业用途。在种子繁殖的作物中，可将成熟的转基因植物进行自交以产生纯合的近交植物。近交植物会产生含有新引入的异源核酸的种子。可使这些种子生长以产生出会产生选定的表型的植物。
从再生的植物获得的部分，如花、种子、叶子、枝条、果实等，被本发明所涵盖，前提是这些部分具有包含本发明的分离核酸的细胞。再生植株的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的核酸序列。表达选择性标志的转基因植物可通过例如标准免疫印迹和DNA检测技术来筛选本发明核酸的传输。通常还可评价转基因系的该异源核酸的表达水平。最初可在RNA水平上测定表达，以对表达阳性植物进行鉴定和定量。可采用标准的RNA分析技术，它们包括使用被设计来仅扩增异源RNA模板的寡核苷酸引物的PCR扩增测定法，和使用异源核酸特异性探针的溶液杂交测定法。然后可使用本发明的特异反应性抗体，通过蛋白质免疫印迹分析针对蛋白质表达对RNA阳性植物进行分析。此外，可分别使用异源核酸特异性多核苷酸探针和抗体，根据标准的规程进行原位杂交和免疫细胞化学，以定位转基因组织内的表达部位。一般来讲，通常可针对所掺入的核酸对多个转基因系进行筛选，以鉴定和选择具有最适当的表达谱的植物。
一个优选的实施方案是对于所添加的异源核酸而言纯合的转基因植物；即含有两个添加的核酸序列的转基因植物，在染色体对的每个染色体上的相同基因座有一个基因。纯合的转基因植株可如下获得：将含有单个添加的异源核酸的杂合转基因植株进行有性交配(自交)，使一些所产生的种子发芽，并分析所产生得到的植株相对于对照植株(即，天然、非转基因)而言的本发明多核苷酸表达变更。还设想与亲本植株的回交和与非转基因植株的远交。
多肽水平和/或组成的调节
本发明还提供调节(即，增加或减少)植物或其部分中本发明多肽的浓度或比率的方法。调节可通过增加或减少植物中本发明多肽的浓度和/或比率实现。
该方法包括将包含如上所述本发明多核苷酸的重组表达盒引入植物细胞中以得到转化的植物细胞，在植物细胞生长条件下培养该转化的植物细胞，以及诱导或抑制本发明多核苷酸在该植物中的表达长达一段足以调节该多肽在该植物或植物部分中的浓度和/或比率的时间。
在一些实施方案中，本发明多肽在植物中的浓度和/或比率可通过在体内或体外变更基因启动子而调节，以上调或下调基因表达。在一些实施方案中，可通过置换、添加、插入或缺失来变更本发明的天然基因的编码区以降低所编码的酶的活性。参见例如Kmiec，美国专利5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868。并且在一些实施方案中，将包含启动子序列的分离核酸(如载体)转染进植物细胞中。
随后，通过本领域技术人员已知的手段(例如但不限于DNA印迹、DNA测序或使用对所述启动子和对所述基因特异性的引物并检测由其产生的扩增子的PCR分析)，选择包含与本发明多核苷酸有效连接的所述启动子的植物细胞。将经前述实施例变更或修饰的植物或植物部分在形成植物的条件下生长一段时间，该时间足以调节本发明多肽在该植物中的浓度和/或比率。形成植物的条件是本领域熟知的并在上文进行了简单的描述。
一般来讲，多肽的浓度或比率相对于天然对照植物、植物部分或缺乏前述重组表达盒的细胞增加或减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本发明的调节可在植物生长过程中发生，和/或可在植物生长至所需的发育阶段后发生。暂时调节核酸表达和/或调节在特定组织中的核酸表达可通过采用与本发明多核苷酸以例如有义或反义取向有效连接的适当启动子来控制，如上文中更详细论述的。还可通过外源施用有效量的诱导化合物来控制对本发明多核苷酸表达的诱导。可激活来自这些启动子的表达的诱导型启动子和诱导化合物是本领域所熟知的。在优选的实施方案中，在单子叶植物特别是玉蜀黍中调节本发明的多肽。
UTR和密码子偏好性
总体来说，已发现翻译效率受RNA的5′非编码或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，NucleicAcidsRes.15：8125(1987))(Kozak，《核酸研究》，第15卷，第8125页，1987年)和7-甲基鸟苷帽结构(Drummondetal.，NucleicAcidsRes.13：7375(1985))(Drummond等人，《核酸研究》，第13卷，第7375页，1985年)。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesingetal.，Cell48：691(1987))(Muesing等人，《细胞》，第48卷，第691页，1987年)和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)，Raoetal.，Mol.andCell.Biol.8：284(1988))(Rao等人，《分子和细胞生物学》，第8卷，第284页，1988年)。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′非翻译区。
另外，可修饰本发明多核苷酸的多肽编码区段以变更密码子使用。可采用变更了的密码子使用来变更翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达，例如为了在玉蜀黍中表达而优化异源序列中的密码子使用。本发明多核苷酸的编码区中的密码子使用可用可商购获得的软件包进行统计分析，如“CodonPreference”(可得自威斯康星大学遗传学计算机小组(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup))(参见Devereauxetal.，NucleicAcidsRes.12：387-395(1984)(Devereaux等人，《核酸研究》，第12卷，第387-395页，1984年))或MacVector4.1(康涅狄格州纽黑文的伊士曼柯达公司(EastmanKodakCo.，NewHaven，Conn.))。因而，本发明提供了本发明多核苷酸中的至少一者的编码区的密码子使用频率特性。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目可以为从1至本文所提供的本发明多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
序列改组
本发明提供了使用本发明的多核苷酸进行序列改组的方法以及由此得到的组合物。序列改组在PCT公开No.WO97/20078中进行了描述。另参见Zhang，J.-H.，etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，94：4504-4509(1997)(Zhang，J.-H.等人，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页，1997年)。一般来讲，序列改组提供出用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，该文库可被进行选择或筛选。从一群包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区的相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的多核苷酸的亚群。所述特性可以为任何能够在筛选系统中被选择或检测的性质或属性，可包括：所编码的蛋白质、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白质结合元件等等的性质，例如赋予可选择或可检测性质的任何特征。在一些实施方案中，选择的特性将为相对于本文所提供的野生型蛋白质而言减少的Km和/或增加的KCat。在其他实施方案中，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸具有的配体结合亲和力将比非改组的野生型多核苷酸的高。这类性质的提高可为野生型值的至少110％、120％、130％、140％或至少150％。
通用和共有序列
本发明的多核苷酸和多肽还包括那些具有如下的通用序列/共有序列的多核苷酸和多肽：(a)本发明的分别至少两个同源多核苷酸或多肽的通用序列；以及(b)本发明的分别至少三个同源多核苷酸或多肽的共有序列。本发明的通用序列包括通用多肽或多核苷酸序列分别涵盖的每个物种的多肽或多核苷酸。具有氨基酸或核酸共有序列的多核苷酸涵盖的单个物种可用于生成抗体或生成核酸探针或引物，以筛选其他种、属、科、目、纲、门或界中的同源体。例如，具有来自玉米科基因的共有序列的多核苷酸可用于生成其他禾本科物种例如小麦、水稻或高粱的抗体或核酸探针或引物。
或者，具有直系同源基因产生的共有序列的多核苷酸可用于鉴定或分离其他分类单元的直系同源体。通常，具有共有序列的多核苷酸的长度将为至少25、30或40个氨基酸，或长度为20、30、40、50、100或150个核苷酸。本领域的技术人员将会知道，保守氨基酸置换可用于如上讨论的不同于比对序列，但来自相同保守置换基团的氨基酸。任选地，每10个氨基酸长度共有序列被置换不超过1或2个保守氨基酸。
用于生成共有或通用序列的类似序列包括本文提供的相同基因、直系同源或旁系同源序列的任何数量的等位变体和组合。任选地，用于生成共有或通用序列的类似序列使用BLAST算法的最小合计概率(P(N))鉴定。序列分析软件的各个供应商在F.M.Ausubel等人编辑的《分子生物学实验手册》，实验室操作手册，格林出版有限公司和约翰威利父子有限公司合作出版(补编30)(CurrentProtocolsinMolecularBiology，F.M.Ausubeletal.，Eds.，CurrentProtocols，ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates，Inc.andJohnWiley&Sons，Inc.(Supplement30))第7章中列出。
如果测试核酸与参考核酸比较的最小合计概率小于约0.1，更优选地小于约0.01或0.001，最优选地小于约0.0001或0.00001，则多核苷酸序列视为类似于参考序列。类似的多核苷酸是可进行比对的，并且是使用得自多个供应商例如威斯康星州麦迪逊遗传学计算机集团(GeneticsCompurerGroup(Madison，WI))的PILEUP软件、马里兰州北贝塞斯达VectorNTI公司(VectorNTI(NorthBethesda，MD))的ALIGNX或密歇根州安娜堡基因密码公司(Genecode(AnnArbor，MI))的SEQUENCHER的多个序列比对软件生成的共有或通用序列。便利地，此类软件的默认参数可用于生成共有或通用序列。
核酸标记及检测方法
对本发明的核酸进行标记的手段不是本发明的关键方面，可通过多种目前已知的或以后开发的方法来完成。适用于本发明的可检测标记包括可通过光谱、放射性同位素、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方式检测的任何组分。
在本发明中有用的标记包括生物素(用于用经标记的链霉亲和素缀合物来染色)、磁珠、荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32p)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)以及比色标记如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶)珠粒。
本发明的核酸可通过几种通常用来检测杂交的核酸存在的方法中的任何一种进行标记。一种普通的检测方法是采用放射自显影术，其中使用带有3H、125I、35S、14C或32p等标记的探针。放射性同位素的选择取决于研究偏好，这是因为所选的同位素的合成难易、稳定性和半衰期。其他标记包括与用荧光团、化学发光剂和酶标记的抗体结合的配体。作为另一种选择，可将探针与标记如荧光团、化学发光剂或酶直接缀合。标记的选择取决于所需的灵敏度、与探针缀合的难易、稳定性要求以及可用的仪器。标记本发明的核酸可例如通过使用经标记的PCR引物容易地实现。
在一些实施方案中，在核酸的制备中的扩增步骤期间同时掺入标记。因此，例如，用经标记的引物或经标记的核苷酸进行聚合酶链式反应(PCR)将提供经标记的扩增产物。在另一个实施方案中，使用经标记的核苷酸(例如荧光素标记的UTP和/或CTP)进行转录扩增会将标记掺入到转录的核酸中。
非放射性探针通常通过间接的手段进行标记。例如，将配体分子与探针共价结合。该配体然后与抗配体分子结合，该抗配体分子要么本来就是可检测的，要么与可检测的信号系统如酶、荧光团或化学发光化合物共价结合。作为标记的目的酶将主要为水解酶，如磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化还原酶，尤其是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮等。化学发光物质包括萤光素和2,3-二氢二氮杂萘二酮，例如鲁米诺。
配体和抗配体可多种多样。在配体具有天然抗配体的情况中，即在诸如生物素、甲状腺素和皮质醇的配体的情况中，它可与它的经标记的天然抗配体联合使用。作为另一种选择，任何半抗原或抗原化合物都可与抗体组合使用。探针还可通过与标记直接缀合来进行标记。例如，已将克隆的DNA探针与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶直接偶联。
检测这种标记的手段是本领域技术人员熟知的。因此，例如，放射性标记可使用照相软片或闪烁计数器进行检测，荧光标志可使用光检测器检测发射光来进行检测。酶标记通常是通过给该酶提供底物并检测由该酶对该底物的作用所产生的反应产物来进行检测，比色标记单单通过使着色的标记显现就能够检测到。
抗蛋白质的抗体
可针对本发明的蛋白质产生抗体，所述蛋白质包括单独变体、等位基因变体、株系变体或物种变体以及它们的片段，既包括天然(全长)形式也包括重组形式。另外，针对天然构型或非天然构型的这些蛋白质产生抗体。许多制备抗体的方法是本领域技术人员知道的。有多种分析方法可用来产生本发明的蛋白质的亲水性概况(profile)。这类方法可用来指导技术人员选择本发明的肽以用于产生或选择在免疫原性条件下与本发明的蛋白质特异性反应的抗体。参见例如J.Janin，Nature，277(1979)491-492(J.Janin，《自然》，第277卷，第491-492页，1979年)；Wolfenden，etal.，Biochemistry20(1981)849-855(Wolfenden等人，《生物化学》，第20卷，第849-855页，1981年)；KyteandDoolite，J.MolBiol.157(1982)105-132(Kyte和Doolite，《分子生物学杂志》，第157卷，第105-132页，1982年)；Rose，etal.，Science229(1985)834838(Rose等人，《科学》，第229卷，第834-838页，1985年)。
构建体和性状的“堆叠”
在某些实施方案中，可将本发明的核酸序列与目的其他多核苷酸序列组合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。本发明的多核苷酸可与任何基因或基因组合进行堆叠，所产生的组合可包括任何一个或多个目的多核苷酸的多个拷贝。所需的组合可影响一个或多个性状；也即，可产生某些组合以调节影响ACC合酶活性和/或乙烯生成的基因表达。可设计其他组合以产生具有多种所需性状的植株，包括但不限于适于动物饲料的性状，如高油基因(例如美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionins，美国专利No.5,990,389；No.5,885,801；No.5,885,802；和No.5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamsonetal.(1987)Eur.J.Biochem.165：99106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)；和WO98/20122)；以及高甲硫氨酸蛋白质(Pedersenetal.(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kiriharaetal.(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)；以及Musumuraetal.(1989)PlantMol.Biol.12：123)(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))；消化性提高(如，改性贮藏蛋白(美国专利申请系列No.10/053,410，2001年11月7日提交)；以及硫氧还蛋白(美国专利申请系列No.10/005,429，2001年12月3日提交))，以上公开内容以引用的方式并入本文。本发明的多核苷酸也可与如下性状堆叠：抗虫、抗病或抗除草剂所需的性状(如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白(美国专利No.5,366,892；No.5,747,450；No.5,737,514；No.5723,756；No.5,593,881；Geiseretal(1986)Gene48：109)(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))；凝集素(VanDammeetal.(1994)PlantMol.Biol.24：825)(VanDamme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页)；伏马毒素解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒性和疾病抗性基因(Jonesetal.(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martinetal.(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinosetal.(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，如草胺膦或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因)；以及对加工或工艺产品而言理想的性状如高油(例如美国专利No.6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如美国专利No.5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubertetal.(1988)J.Bacteriol.170：58375847)(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)，上述公开内容以引用方式并入本文。还可将本发明的多核苷酸与影响农学性状如雄性不育(参见例如美国专利No.5,583,210)、茎秆强度、开花时间或转化技术性状如细胞周期调节或基因靶向(例如WO99/61619；WO00/17364；WO99/25821)的多核苷酸进行组合。
这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交(TopCross)方法或遗传转化来对植物进行杂交育种。如果性状是通过遗传转化植株来堆叠，则目的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包含一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化方案将性状与由转化盒的任何组合提供的目的多核苷酸同时引入。例如，如果要引入两个序列，则可将两个序列包含在分离的转化盒中(反式)或包含在相同转化盒中(顺式)。目的序列的表达可由相同的启动子或由不同的启动子来驱动。在某些情况中，可能合乎需要的是引入会抑制目的多核苷酸的表达的转化盒。这可伴随其他抑制盒或超表达盒的任何组合以在植物中产生所需的特性组合。
在育种方法中的应用
本发明的转化植物可用于植物育种方案中。植物育种的目的是在单个品种或杂种中组合多种期望的性状。对于田地作物，这些性状可包括例如对病害和昆虫的抗性、对热和干旱的耐受性、减少作物成熟的时间、较高产量和更好的农学品质。随着对许多作物的机械化采收，诸如萌发和建植(standestablishment)、生长速率、成熟度以及植株和穗高之类的植物特性的均匀性是所期望的。传统的植物育种是开发新的和改良的商品作物的重要工具。本发明涵盖通过将第一亲本玉蜀黍植株与第二亲本玉蜀黍植株进行杂交来产生玉蜀黍植株的方法，其中所述亲本玉蜀黍植株中的一者或两者是如本文所述表现出保绿表型、不育表型、拥挤抗性表型等的转化植物。
已用转化技术工程转入特定的玉蜀黍植株中的遗传性状，可用植物育种领域公知的传统育种技术转移到另一株系中。例如，常常使用回交方法来将转基因从转化的玉蜀黍植株转移到良种近交系，所得的后代将包含该转基因。另外，如果将近交系用于转化，则可将转基因植物与另一不同的近交系杂交以产生转基因杂种玉蜀黍植株。视上下文而定，本文所用的“杂交”可指简单的X×Y杂交或指回交过程。
调节植物胁迫反应的试剂盒
本发明的某些实施方案可任选作为试剂盒提供给使用者。例如，本发明的试剂盒可含有本文所述的一个或多个核酸、多肽、抗体、诊断用核酸或多肽例如抗体、探针组例如cDNA微阵列、一个或多个载体和/或细胞系。试剂盒常常包装在合适的容器中。试剂盒通常还包含一种或多种另外的试剂，例如底物、用于标记表达产物的标记物、引物等，管子和/或其他附件、用于收集样品的试剂、缓冲液、杂交室、盖玻片等。试剂盒任选还包括说明书或用户手册，详细说明使用试剂盒组件来发现或应用基因集(geneset)的优选方法。当按照说明书使用时，试剂盒可例如用于评估植物样品中的表达或多态性，例如评估ACC合酶、乙烯生成、胁迫响应潜力、拥挤抗性潜力、不育性等。或者，可按照说明书使用试剂盒以使用至少一个ACC脱氨酶多核苷酸序列来影响植物中的乙烯生成或水平。
其他核酸和蛋白质测定法
在本发明的情形中，按照公知的分子生物学方法操作核酸和/或蛋白质。众多这类程序的详细方案在例如以下文献中有描述：Ausubeletal.CurrentProtocolsinMolecularBiology(supplementedthrough2004)Johnwiley&Sons，NewYork(Ausubel等人，《分子生物学实验手册》(增补到2004年)，约翰·威利父子出版公司，纽约)(“Ausubel”)；Sambrooketal.MolecularCloning--ALaboratoryManual(2ndEd.)，Vol.13，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989(Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，第13卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989年(“Sambrook”)；以及BergerandKimmelGuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymologyvolume152AcademicPress，Inc.，SanDiego，Calif.(Berger和Kimmel，《酶学方法，分子克隆技术指南》，第152卷，学术出版社，美国加州圣地亚哥(“Berger”)。
除了以上参考文献之外，有关可用于例如扩增本发明的多核苷酸的体外扩增技术如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其他RNA聚合物介导的技术(例如NASBA)的方案，可在以下文献中找到：Mullis等人，1987年，美国专利No.4,683,202；PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(Innisetal.eds)AcademicPressInc.SanDiego，Calif.(1990)(《PCR方案——方法与应用指南》，Innis等人编码，学术出版社，美国加州圣地亚哥，1990年)(“Innis”)；ArnheimandLevinson(1990)C&EN36(Arnheim和Levinson，1990年，C&EN36)；TheJournalOfNIHResearch(1991)3：81(《美国国家卫生研究所杂志》，1991年，第3卷，第81页)；Kwohetal.(1989)ProcNatlAcadSciUSA86，1173(Kwoh等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第1173页)；Guatellietal.(1990)ProcNatlAcadSciUSA87：1874(Guatelli等人，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第1874页)；Lomelletal.(1989)JClinChem35：1826(Lomell等人，1989年，《临床化学杂志》，第35卷，第1826页)；Landegrenetal.(1988)Science241：1077(Landegren等人，1988年，《科学》，第241卷，第1077页)；VanBrunt(1990)Biotechnology8：291(VanBrunt，1990年，《生物技术》，第8卷，第291页)；WuandWallace(1989)Gene4：560(Wu和Wallace，1989年，《基因》，第4卷，第560页)；Barringeretal.(1990)Gene89：117(Barringer等人，1990年，《基因》，第89卷，第117页)以及SooknananandMalek(1995)Biotechnology13：563(Sooknanan和Malek，1995年，《生物技术》，第13卷，第563页)。可用于在本发明情形中克隆核酸的另外的方法包括Wallace等人，美国专利No.5,426,039。通过PCR扩增大核酸的改进的方法在Chengetal.(1994)Nature369：684(Cheng等人，1994年，《自然》，第369卷，第684页)及其中引用的参考文献中总结。
本发明的某些多核苷酸可利用各种涉及基于单核苷酸和/或基于三核苷酸的亚磷酰胺偶联化学的固相策略来合成。例如，可通过相续添加活化的单体和/或三聚体以延伸多核苷酸链，来合成核酸序列。参见例如Caruthers，M.H.etal.(1992)MethEnzymol211：3(Caruthers，M.H.等人，1992年，《酶学方法》，第211卷，第3页)。代替合成期望的序列的是，几乎任何核酸都可从多个商业来源中的任何一个定制，所述商业来源例如TheMidlandCertifiedReagentCompany(米德兰认证试剂公司)(mcrcoligos.com)(得克萨斯州米德兰市(Midland))、TheGreatAmericanGeneCompany(大美国基因公司)(WWW.genco.com)(加州拉蒙纳市(Ramona))、ExpressGen，Inc.(表达基因有限公司)(www.expressgen.com)(伊利诺伊州芝加哥市)、OperonTechnologies，Inc.(操纵子技术有限公司)(www.operon.com)(加州阿拉米达市(Alameda))及许多其他商业来源。
除了按照在前面的说明书和实例中具体描述的方式以外，本发明还可以以其他方式实施。因此，根据本文的教导对本发明进行的许多修改和变形也在所附的权利要求的范围内。
背景技术、具体实施方式和实例中所引用的每篇文献(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容均以引用的方式全文并入本文。
以下给出的实施例目的在于为本领域普通技术人员提供如何制造与使用主题发明的完整公开和描述，而无意限制本发明所定义的范围。已作出努力以确保所使用的数据(例如，数量、温度、浓度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有指明，否则份为重量份，分子量为平均分子量；温度为摄氏度；并且压力为大气压或接近大气压。
实施例
实施例1.ACC脱氨酶的修饰
将野生型玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodiamaydis)ACC脱氨酶(ACCD)多核苷酸序列(SEQIDNO：1)进行突变以影响该酶的活性，以操纵其对植物中的乙烯生成的作用从而操纵其对植物生长的作用。该壳色单隔孢菌序列根据已知的结构进行模拟以帮助鉴定推定的活性位点和调节性氨基酸残基。在据信调节酶活性的关键位点周围作出选择性突变。通常，选择环状氨基酸或带电氨基酸残基进行突变，以引起对蛋白质相互作用和结构的最大影响。
为在蛋白质内产生突变，将DNA纯化并使用Quik-Change定点诱变试剂盒(美国加州圣克拉拉市安捷伦科技公司(AgilentTechnologies，SantaClara，CA，USA))。然后将DNA进行测序并验证含有预定的突变。
在玉蜀黍壳色单隔孢菌ACCD内作出的突变如下：
Glu308变更为Ala308
Tyr307变更为Ala307
Asp317变更为Ala317
Val49变更为Pro49
Lys59变更为Ala59
Phe294变更为Ala294
Ser297变更为Ala297
Ser86变更为Ala86
Pro68变更为Ala68
Asp76变更为Ala76
实施例2.修饰的脱氨酶在大肠杆菌中的表达
用前面实施例1中列出的每种变更将玉蜀黍壳色单隔孢菌ACC脱氨酶多核苷酸序列(SEQIDNO：1)(DmACCDmod1)进行突变。分别用每种所得的突变ACC脱氨酶多核苷酸转化大肠杆菌细胞。使细菌培养物在含有3mMACC的低盐培养基中生长，并用IPTG诱导。用比色测定法，通过测量α-酮丁酸的生成来测量脱氨酶活性。
图1中总结的数据证明了氨基酸变更对酶活性的影响。某些突变提高了相对于对照(DmMOD1，起点)的活性水平，而其他突变降低了相对于对照的活性水平。这些突变或者这些突变中的两者或多者的各种组合可应用于变更植物中的ACC脱氨酶活性。这种突变或组合可导致变更的乙烯生成或水平，以改进植物生长，特别是在非生物胁迫条件下的生长。在另一个实施方案中，这种突变或组合可导致变更的乙烯生成或提高的产量。
实施例3.转基因植物的转化和再生
将来自温室供体植物的不成熟玉蜀黍胚用这样的质粒进行轰击，该质粒含有ACC脱氨酶序列及该序列有效连接的启动子如干旱诱导启动子RAB17启动子(Vilardell，etal.，(1990)PlantMolBiol14：423-432)(Vilardell等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第423-432页)、组成型启动子、雌性偏好的启动子(如AM-ADF4、EEP1)或根特异性启动子以及赋予对除草剂双丙氨膦的抗性的选择性标志基因MO-PAT或BAR选择性标志。含有ACC脱氨酶序列的质粒可包含SEQIDNO：1、3、4、5、6、7或9中的一者或多者。在一个实施方案中，该选择性标志基因在单独的质粒上提供。可如下进行转化。代表性的培养基配方在上文提供。
靶组织的制备：
将穗去壳并在30％Clorox漂白剂加0.5％Micro洗涤剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水漂洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。
DNA的制备：
制备质粒载体，该质粒载体包含有效连接至遍在蛋白启动子的ACC脱氨酶序列。使用如下的CaCl2沉淀程序将该质粒DNA加上含有PAT选择性标志的质粒DNA沉淀于1.1μm(平均直径)的钨小球上：
100μl制备的钨粒子水溶液
10μlTrisEDTA缓冲液中的(1μg)DNA(1μg总DNA)
100μl2.5MCaCl2
10μl0.1M亚精胺
将每种试剂依序加到钨粒子悬液，同时保持在多管涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理，并且让其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml100％乙醇洗涤，离心30秒。再次移除液体，将105μL100％乙醇加至最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理，并取10μL点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。
粒子枪处理：
将样品板在粒子枪中以水平#4进行轰击。所有样品接受650PSI的单次射击，每管制备粒子/DNA共取十个等分试样。
后续处理：
在轰击之后，将胚保持在560Y培养基上2天，然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2周进行传代培养。在选择大约10个星期后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以启动植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4周)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行萌发并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的平板衬垫(insertsinflats)(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1星期，随后在温室中再生长1-2个星期，然后转移到典型的600个盆(1.6加仑)并生长至成熟。针对提高的耐旱性对植株进行监测和评分。测量改善的耐旱性的测定法是本领域的常规工作，包括例如当与干旱条件下的对照玉蜀黍植株比较时在相同环境条件下的核仁-抽穗能力产量增加。可对植物监测变更的ACC水平和/或变更的乙烯水平。
轰击法和培养基：
轰击培养基(560Y)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；2.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l2,4-D(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨膦(两者均在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/lMS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS维生素母液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)(MurashigeandSkoog，(1962)Physiol.Plant.15：473)(Murashige和Skoog，1962年，《植物生理学》，第15卷，第473页)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在调至pH5.6后用精炼去离子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨膦(在将培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/lMS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS维生素母液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至pH5.6后用精炼去离子水定容)和6g/lbacto-agar(在用精炼去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。
实施例4.农杆菌介导的转化
对于用包含本发明的ACC脱氨酶序列的表达构建体对玉蜀黍进行农杆菌介导的转化，优选的是采用Zhao的方法(美国专利No.5,981,840和PCT专利公布WO98/32326；这两个专利的内容以引用方式并入本文)。简单而言，从玉蜀黍分离出未成熟胚并使该胚接触农杆菌的悬浮液，其中该细菌能够将ACC脱氨酶序列转移到至少一个未成熟胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，优选将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中用于开始接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选地，在感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上培养。在这个共培养期之后，设想到任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加植物转化子的选择剂(步骤3：静息步骤)。优选将未成熟胚在固体培养基上与抗生素一起培养，但不加选择剂，用于消除农杆菌以及用于受感染细胞的静息期。接着，将接种的胚在含有选择剂的培养基上培养，并回收生长出的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并优选将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植株。针对受调节的生长对植株进行监测和评分。
实施例5.ACC脱氨酶序列的变体
A.不变更所编码的氨基酸序列的ACC脱氨酶蛋白的变体核苷酸序列
具有开放阅读框的核苷酸序列的ACC脱氨酶序列，当与相应序列的起始的未变更的开放阅读框核苷酸序列比较时，具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％的核苷酸序列同一性。这些功能性变体用标准的密码子表产生。虽然变体的核苷酸序列被变更，但开放阅读框所编码的氨基酸序列没有改变。
B.ACC脱氨酶多肽的变体氨基酸序列
产生ACC脱氨酶多肽的变体氨基酸序列。在本实施例中，变更一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。通过参考蛋白质比对(与其他直系同源基因或来自各种物种的其他基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择据认为不处于高选择压力下(不是高度保守的)且相当易于用具有类似化学特性(即，类似功能性侧链)的氨基酸进行置换的氨基酸。利用蛋白质比对，可以改变适当的氨基酸。一旦鉴别出目标氨基酸，就随后进行如下C部分中所述的程序。用这个方法产生了具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。
C.ACC脱氨酶多肽的另外的变体氨基酸序列，其中功能不被变更
在本实施例中，产生出相对于参考蛋白质序列而言具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白质序列。这后一尝试要求从比中对鉴别出保守区和可变区，然后明智地应用氨基酸置换表。这些部分将在下文中作更详细的讨论。
主要地，根据ACC脱氨酶蛋白之间或其他ACC脱氨酶多肽之间的保守区作出哪些氨基酸序列要进行变更的决定。基于序列比对，将ACC脱氨酶多肽的很可能被变更的各个区域以小写字母表示，而保守区域用大写字母表示。应认识到，可在以下保守区中作出保守置换而又不变更功能。另外，技术人员将理解，本发明的ACC脱氨酶序列的功能性变体可在保守结构域中具有微小的非保守氨基酸变更。
然后产生出与原始序列在同一性上相差80-85％、85-90％、90-95％和95-100％范围内的人工蛋白质序列。目标定在这些范围的中点，正负偏差近似幅度例如为1％。氨基酸置换将通过定制的Perl脚本来实现。置换表在下表1中提供。
表1.置换表
氨基酸 强相似的和最佳的置换 改变次序 注释
I L，V 1 50：50置换
L I，V 2 50：50置换
V I，L 3 50：50置换
A G 4
G A 5
D E 6
E D 7
W Y 8
Y W 9
S T 10
T S 11
K R 12
R K 13
N Q 14
Q N 15
F Y 16
M L 17 第一个甲硫氨酸不能改变
H Na 无好的置换物
C Na 无好的置换物
P Na 无好的置换物
首先，鉴定出蛋白质中不应改变的任何保守氨基酸并“作上记号”以隔离开来不作置换。起始甲硫氨酸当然将自动被加到这个名单。接着，作出改变。
H、C和P在任何情况下都不改变。该改变将首先以异亮氨酸开始，从N端扫描至C端。然后是亮氨酸，如此按列表往下直至达到所需的目标。可作出中数置换(interimnumbersubstitution)，以便不造成改变的逆转。该名单的顺序是1-17，因此按需以尽可能多的异亮氨酸变化开始，然后是亮氨酸，一直到甲硫氨酸。显然，按此方式，许多氨基酸将不需要改变。L、I和V将涉及两个交替的最佳置换的50：50置换。
将变体氨基酸序列作为输出写出。用Perl脚本计算同一性百分数。使用这个程序，产生出与SEQIDNO：1的起始的未变更的开放阅读框核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的ACC脱氨酶多肽的变体。
D.ACC脱氨酶多肽的另外的变体氨基酸序列，其中功能被变更。
在某些实施方案中，ACC脱氨酶多肽序列的变更是有意进行变更以影响蛋白质功能。将突变选择成围绕可能调节酶活性的关键位点。在某些实施方案中，选择环状氨基酸或带电氨基酸残基用于突变以引起对蛋白质相互作用和结构的最大影响。
表1中提供的信息还可有助于技术人员确定特定的氨基酸置换是否很可能影响功能。
实施例6.转基因玉蜀黍植物
产生了含有在启动子控制下的ACC脱氨酶构建体的T0转基因玉蜀黍植株。将这些植株在FASTCORN系统下在温室条件中栽培，如美国专利申请公开2003/0221212、美国专利申请No.10/367,417中所详细描述的。
然后按以下方式对每棵植株分析以下特性中的一项或多项的可测量的变更：
对源自每个含有单拷贝的每种构建体的To植株的自受精、被发现对于转基因事件1∶1分离的T1后代进行分析；例如分析在干旱条件下生长速率的改善。对生长监测至花期，此时对转基因阳性事件、转基因无效事件和非转化对照事件测定累积植株生长、生长速率和穗重量。将各个单独植株的表型的分布与对照组的分布和与所有其余处理组的分布进行比较。计算每组的方差并用F检验进行比较，将事件方差与非转基因对照组方差和与实验中其余事件的合并方差进行比较。要将阳性结果与事件内的转基因的分布进行比较，以证实响应与转基因分离。
本说明书中的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的普通技能水平。所有出版物和专利申请均以引用方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用方式并入本文一样。
已参考了各种具体的和优选的实施方案和技术描述了本发明。但是，应理解，在保持在本发明的精神和范围内的前提下可作出许多变化和修改。

Claims (29)

1.一种改进作物植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括提高所述作物植物中的ACC脱氨酶的活性并将所述作物植物在植物栽培环境中栽培，在所述栽培环境中所述作物植物暴露于非生物胁迫。
2.一种改进作物植物的干旱耐受性的方法，所述方法包括提高玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodiamaydis)ACC脱氨酶基因在所述作物植物中的表达并将所述作物植物在植物栽培环境中栽培，在所述栽培环境中所述作物植物暴露于干旱胁迫。
3.一种提高作物植物的农学参数的方法，所述方法包括提高玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodiamaydis)ACC脱氨酶基因在所述作物植物中的表达并将所述作物植物在植物栽培环境中栽培，由此提高所述农学参数。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述ACC脱氨酶包含与选自SEQIDNO：1、3-7和9的核苷酸序列具有至少70％至95％同一性的核酸序列。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述ACC脱氨酶包含编码选自SEQIDNO：2、8和10的氨基酸序列或与SEQIDNO：2、8和10之一者具有至少70％至95％同一性的序列的核酸序列，并且其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Tyr307变更为Ala307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。
6.一种耐受非生物胁迫的转基因玉蜀黍植物，所述植物在其基因组中包含重组核酸，所述重组核酸包含编码选自SEQIDNO：2、8和10的多肽的多核苷酸，并且其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Tyr307变更为Ala307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。
7.根据权利要求6所述的玉蜀黍植物，其中所述非生物胁迫是干旱、低氮、热或盐。
8.根据权利要求6所述的玉蜀黍植物，其中所述重组核酸编码包含SEQIDNO：8或10的多肽。
9.一种植物细胞，所述植物细胞从根据权利要求6所述的玉蜀黍植物产生。
10.一种种子，所述种子从根据权利要求6所述的玉蜀黍植物产生。
11.一种提高作物植物在干旱条件下的谷粒产量的方法，所述方法包括降低作物植物中的乙烯的水平，其中所述乙烯水平的降低伴随ACC脱氨酶活性的提高或ACC脱氨酶活性的降低，其中所述作物植物暴露于干旱胁迫，从而提高所述作物植物的谷粒产量。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述作物植物是玉蜀黍。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述乙烯水平是通过提高编码ACC脱氨酶的基因的表达来降低的，其中所述ACC脱氨酶包含编码选自SEQIDNO：2、8和10的多肽的多核苷酸，并且其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Tyr307变更为Ala307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。
14.一种调节植物细胞中的乙烯生成或乙烯水平的方法，所述方法包括：
(a)将包含与启动子有效连接的ACC脱氨酶多核苷酸的重组构建体引入到植物细胞中；
(b)在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；以及
(c)诱导所述多核苷酸的表达长达一段足以调节所述植物细胞中的乙烯合成水平的时间。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述植物细胞是玉蜀黍细胞。
16.一种调节植物中的乙烯生成或水平的方法，所述方法包括：
a.将包含与启动子有效连接的编码ACC脱氨酶蛋白的多核苷酸的核苷酸构建体引入到植物细胞中；
b.在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；以及
c.从所述植物细胞再生植物；其中所述植物中的乙烯生成或水平得到调节。
17.一种转基因植物，所述转基因植物由根据权利要求16所述的方法产生。
18.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物相对于对照具有降低的乙烯生成。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述ACC脱氨酶包含编码与选自SEQIDNO：2、8和10的多肽具有70％至95％同一性的多肽的多核苷酸，并且其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Tyr307变更为Ala307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。
20.根据权利要求1至3或11中的任一项所述的方法，其中所述ACC脱氨酶在根偏好的或干旱胁迫诱导的调节元件的控制下表达。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述乙烯水平是通过提高编码ACC脱氨酶的基因的表达来降低的，其中所述ACC脱氨酶包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与选自SEQIDNO：2、8和10的多肽序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含至少一个选自以下的氨基酸：Ala308、Ala307、Ala317、Pro49、Ala59、Ala294、Ala297、Ala86、Ala68和Ala76。
22.一种编码ACC脱氨酶多肽的分离多核苷酸，所述ACC脱氨酶多肽包含与选自SEQIDNO：2、8和10的多肽序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含至少一个选自以下的氨基酸：Ala308、Ala307、Ala317、Pro49、Ala59、Ala294、Ala297、Ala86、Ala68和Ala76。
23.一种编码ACC脱氨酶多肽的分离多核苷酸，所述ACC脱氨酶多肽包含与选自SEQIDNO：2、8、10的多肽序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中SEQIDNO：2的多肽序列包含选自Glu308变更为Ala308、Tyr307变更为Ala307、Asp317变更为Ala317、Lys59变更为Ala59、Phe294变更为Ala294、Ser297变更为Ala297、Ser86变更为Ala86、Pro68变更为Ala68和Asp76变更为Ala76的突变。
24.根据权利要求23所述的分离多核苷酸，所述分离多核苷酸还包含植物可表达的调节元件。
25.一种分离多核苷酸，所述分离多核苷酸包含与选自SEQIDNO：1、3-7和9的核苷酸序列具有至少70％至95％同一性的核酸序列。
26.一种分离多核苷酸，所述分离多核苷酸编码包含SEQIDNO：8或10的氨基酸序列或与SEQIDNO：8或10具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽。
27.一种改进ACC脱氨酶的活性的方法，所述方法包括使SEQIDNO：2的氨基酸序列中包含氨基酸变化并评估突变的酶的ACC脱氨酶活性。
28.一种基因调节构建体，所述基因调节构建体包含根据权利要求23或25所述的多核苷酸。
29.一种载体，所述载体包含根据权利要求23或25所述的多核苷酸。
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