CN105543267A - 棘孢木霉acc脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法 - Google Patents

棘孢木霉acc脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法 Download PDF

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CN105543267A CN201610053452.5A CN201610053452A CN105543267A CN 105543267 A CN105543267 A CN 105543267A CN 201610053452 A CN201610053452 A CN 201610053452A CN 105543267 A CN105543267 A CN 105543267A
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Abstract

本发明公开了棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法，该毕赤酵母表达载体是将棘孢木霉的ACC脱氨酶基因和质粒pPIC9K连接后，转化毕赤酵母构建而成。本发明克隆了棘孢木霉KpS的acdS基因，构建含有acdS基因的重组质粒，并电转化毕赤酵母，最终在甲醇的诱导下利用毕赤酵母成功表达了ACC脱氨酶，为利用酵母作为生物反应器工业化生产ACC脱氨酶提供了技术支持。该技术通过生产ACC脱氨酶，利用ACC脱氨酶增强植物的抗旱性和耐盐性。

Description

棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法
技术领域
本发明涉及一种棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法，属于生物技术领域。
背景技术
内生菌是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。研究表明，内生菌的用途非常广泛，在农业生产方面，人们利用内生菌来增强其宿主的抗逆性，抗虫害，促进植物的生长，增强宿主植物的环境适应能力，避免宿主受到迫害，这样既减少了化学农药的大面积污染，又保证了农作物的天然性。在医学方面，从内生菌中寻找更多抗癌和抗病的基因也成为现在的研究热点。在工业方面，内生菌产生的某些活性物质，如具有抗性的特殊的酶类，在工业上也具有较大的应用潜力。
一般情况下，内生真菌与宿主是以互惠的方式进行共生，所以通常认为两者是互利共生的关系。一方面，宿主植物为寄生的内生真菌提供生存环境和生长必须的养分；另一方面，内生真菌会产生有利于宿主植物生长和发育的次级代谢产物，这些代谢产物在宿主植物应对抗病虫害、抗旱和对病原体的拮抗时发挥了重要作用。
迄今为止已被发现的内生真菌包括接合菌、卵菌、担子菌、子囊菌、有丝分裂孢子真菌和其无孢菌等多种菌群，其中曲霉属、镰孢霉属和拟茎点霉属为较优势的菌种。而从耐盐植物种直接分离棘孢木霉还属于空白。
植物在逆境下产生的大量逆境乙烯阻碍其正常生长发育，严重时可导致植株死亡。ACC脱氨酶可将植物乙烯合成的直接前体ACC水解为α-酮丁酸和氨，阻止植物内体乙烯的过量产生，有效促进逆境下植物的正常生长发育及延缓植物组织的衰老。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法，该毕赤酵母表达载体能够成功表达ACC脱氨酶，具有良好的耐盐性。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体，将棘孢木霉的ACC脱氨酶基因和质粒pPIC9K连接后，转化毕赤酵母构建而成。
所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)KpS，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015770，保藏日期：2015年12月23日。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)根据棘孢木霉菌株T203ACC脱氨酶基因，设计特异性引物ACC，以棘孢木霉KpS基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收纯化，并连接T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，得到大肠杆菌菌液，进行质粒抽提并测序；
(2)根据步骤(1)的测序结果，设计特异性引物T-acdS，以步骤(1)大肠杆菌菌液为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物和载体质粒pPIC9K同时双酶切，两个酶切产物连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，质粒抽提并酶切鉴定，酶切鉴定正确的命名为重组质粒pPIC9K-acds；
(3)用Sacl线性化重组质粒pPIC9K-acdS，然后电转化毕赤酵母感受态细胞即得。
步骤(1)的特异性引物ACC为：
正向引物ACC-FP：5’-CACCATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’
反向引物ACC-RP：5’-GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGTTCAAC-3’。
步骤(2)的特异性引物T-acdS为：
正向引物T-acdS-FP：5’-TACGTAATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’
反向引物T-acdS-RP：5’-GCGGCCGCGTCTAAAAGAGAGGAATACGCGT-3’。
步骤(1)的PCR反应体系为：2×EsTaqMasterMix12.5μl，基因组DNA0.5μl、10μM正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，补水到25μl；步骤(1)的PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。
步骤(2)的PCR反应体系为：2×EsTaqMasterMix12.5μl，大肠杆菌菌液1μl、10μM正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，补水到25μl；步骤(2)的PCR反应条件为：94℃预变性8min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。
步骤(2)的双酶切体系为：10×QuickCutBuffer5μl、载体质粒pPIC9K或PCR产物1μg，5U/μl的SnaBⅠ和NotⅠ各1μl，补水到50μl；双酶切条件为：37℃金属浴消化1h。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的蛋白表达方法，具体步骤为：将棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体接种到BMGY液体培养基中，振荡培养至OD600为2-6，离心，弃上清，加BMMY液体培养基重悬，并加入100％甲醇诱导表达即得。
本发明有益效果
1、本发明首次从盐生植物海滨锦葵块根中分离出棘孢木霉，该棘孢木霉的ACC脱氨酶活性较高，能够通过降解乙烯合成前体，从而减少植物合成乙烯，间接提高生长素和乙烯的比例，促进植物的生长。
2、本发明从海滨锦葵块根中分离内生真菌，并将分离纯化的内生真菌接种在ADF平板上，筛选得到10种海滨锦葵内生真菌，通过高通量比色法和2,4-二硝基苯肼比色法，最终筛选得到菌株KpS，结合显微镜观察菌落、孢子观察及测序结果，确认菌株KpS为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)。实验表明，本发明最终筛选的棘孢木霉KpS在ADF平板上的ACC脱氨酶活性可达4557.92nMαKBmg-1h-1，高于其它几种海滨锦葵块根内生真菌，甚至是其中绝大多数内生真菌的几倍甚至是十几倍。
3、本发明的棘孢木霉KpS接种海滨锦葵根系后，能够增强海滨锦葵的耐盐性，在高盐条件下，显著提高海滨锦葵叶绿素含量，使海滨锦葵的叶片生长加快，叶片增厚，能够减少水分蒸腾，提高幼苗的含水量，增加了海滨锦葵幼苗的干重和鲜重。
4、本发明克隆了棘孢木霉KpS的acdS基因，构建含有acdS基因的重组质粒，并电转化毕赤酵母，最终在甲醇的诱导下利用毕赤酵母成功表达了ACC脱氨酶，为利用酵母作为生物反应器工业化生产ACC脱氨酶提供了技术支持。该技术通过生产ACC脱氨酶，利用ACC脱氨酶增强植物的耐盐性。
5、本发明方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点。同时，本发明原料来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产。
附图说明
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为海滨锦葵块根内生菌的ACC脱氨酶活性检测结果。
图2为菌株KpS的菌落形态图。
图3为菌株KpS的孢子形态图。
图4为菌株KpS的PCR扩增产物电泳图，图中，M为Marker，1为PCR扩增产物。
图5为棘孢木霉KpS对大豆幼苗生长影响的分析图。
图6为不同盐浓度下棘孢木霉KpS对海滨锦葵幼苗鲜重影响的分析图。
图7为不同盐浓度下棘孢木霉KpS对海滨锦葵幼苗干重影响的分析图。
图8为不同盐浓度下棘孢木霉KpS对海滨锦葵幼苗含水量影响的分析图，图中，EF为对照组，EI为菌处理组。
图9为不同盐浓度下棘孢木霉KpS对海滨锦葵幼苗叶绿色含量影响的分析图，图中，EF为对照组，EI为菌处理组。
图10为棘孢木霉KpS的acdS基因的PCR扩增产物电泳图，图中，M为Marker，1-3为PCR扩增产物。
图11为目的基因acdS、载体质粒pPIC9K和重组质粒pPIC9K-acdS的电泳图，图中，M为Marker，1为载体质粒pPIC9K，2为重组质粒pPIC9K-acdS的双酶切，3为线性化的重组质粒pPIC9K-acdS，4为目的基因acdS。
图12为毕赤酵母转化子诱导表达产物电泳图，图中，M为Marker，1、2、3、4、5分别为毕赤酵母转化子在甲醇诱导12h、24h、48h、72h、96h的ACC脱氨酶表达量。
图13为毕赤酵母转化子在NaCl浓度0％、3％、6％、9％和12％的YPD平板上的生长情况，图中，a、b、c、d、e分别为NaCl浓度0％、3％、6％、9％和12％的YPD平板，其中，A为转化子A69，B为转化子B11，C为转化子B35，D为转化子B43，CK为未经转化的的毕赤酵母(阴性对照)。
图14为毕赤酵母转化子在NaCl浓度0％、3％、6％、9％和12％的液体培养基中的生长情况。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
PDA平板：马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，过滤，滤液加20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g，搅拌均匀，再补足水分至1000mL，121℃高压灭菌20min，铺平板，冷却即可。
DF无氮培养基(1L)：2g葡萄糖，2g柠檬酸，4ml50％葡萄糖酸溶液，0.2gMgSO4·7H2O，0.1ml微量元素母液，0.1mlMoO3母液，0.1mlFeSO4·7H2O母液，定容至900ml超纯水，pH值调至7.2，121℃灭菌15min后，待冷却，加入100ml已灭菌的10×磷酸盐母液。其中，
微量元素母液(100ml)：10mgH3BO3、11.19mgMnSO4·H2O、124.6mgZnSO4·7H2O和78.22mgCuSO4·5H2O，4℃保存。
MoO3母液：10mgMoO3溶于1ml1MNaOH溶液，4℃保存。
10×磷酸盐母液(100ml)：4gKH2PO4和6gNa2HPO4，121℃灭菌20min。
ADF培养基(1L)：DF无氮培养基中加入6ml已过滤除菌的0.5MACC，现用现配。
YPD平板(质量分数计)：1％YeastExtract(酵母膏)、2％Peptone(蛋白胨)、2％葡萄糖和2％琼脂粉。
MD平板(质量分数计)：1.34％YNB(无氨基酵母氮源)、4×10-5％生物素、2％葡萄糖和1.5％琼脂粉。
MM平板(质量分数计)：1.34％YNB，4×10-5％生物素、0.5％甲醇和1.5％琼脂粉。
BMGY液体培养基(1L)：YeastExtract10g、Peptone20g、K2HPO43.013g、KH2PO411.813g、dH2O890ml，121℃高压灭菌20min，冷却至60℃加YNB3.4g，4×10-5％生物素、甘油10ml。
BMMY液体培养基(1L)：YeastExtract10g、Peptone20g、K2HPO43.013g、KH2PO411.813g、dH2O895ml，121℃高压灭菌20min，冷却至60℃加YNB3.4g，4×10-5％生物素，甲醇5ml。
实施例1海滨锦葵内生真菌的分离、纯化和鉴定
1、海滨锦葵内生真菌的分离、纯化
取黄河滩涂试验田生长5个月的海滨锦葵块根清洗干净，随机选取海滨锦葵块根组织，用无菌滤纸吸去表面水分并去除表皮。用70％乙醇浸泡1min，无菌水清洗三次，次氯酸钠浸泡2min，70％乙醇浸泡30s，最后用无菌水冲洗五次，取最后一次无菌水涂布于PDA培养基上，置于30℃恒温培养。若3-5d内，PDA平板均无任何菌落生成，则表明海滨锦葵块根表面消毒彻底，可以切块培养。若PDA平板内产生任何菌落，表明海滨锦葵块根表面消毒不彻底，需要进一步消毒。重复以上步骤，至PDA平板上无菌落生成。用无菌的滤纸吸干组织表面的水分，用手术刀将组织切成5mm×5mm×5mm见方的小块，接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养3-5d。
将海滨锦葵块根附近不同形态的菌丝或孢子于PDA培养基上，挑去菌丝和菌落时注意不要被其他菌落污染。给新的平板编号，不断挑取不同形态的菌落转移至新的平板中，反复纯化直至得到单一菌株。
分别将纯化的单一菌株接种在ADF平板上，筛选得到10种海滨锦葵内生真菌，分别为KpA、KpB、KpC、KpD、KpE、KpF、KpG、KpH、KpE、KpS，其中菌株KpE和KpS在ADF平板上生长最为良好，用ADF液体培养基诱导培养这10种菌株24h，用高通量比色法检测ACC的消耗量，发现菌株KpE和KpS的ADF液体培养基中ACC含量显著减少。同时用2,4-二硝基苯肼比色法测ACC脱氨酶活性，结果显示，10种菌株的ACC脱氨酶活性差别较大，菌株KpE和KpS的ACC脱氨酶活性较高，分别为4270.33nMαKBmg-1h-1和4557.92nMαKBmg-1h-1(αKB为α-丁酮酸)，其余菌株的ACC脱氨酶活性均较低(见图1)。最终确定筛选得到一株菌株KpS。
2、海滨锦葵内生真菌的鉴定
把菌株KpS点接种法接种到PDA平板上，28℃恒温静置培养，不断观察其菌落特征：菌落大小、形态、颜色边缘等(见图2)，培养3-5天后直接制片观察法观察其孢子形态特征(见图3)，参考《真菌鉴定手册》，结合测序结果，进行菌种的鉴定。
菌株KpS的特征是：培养一周后菌落直径达75-80mm，初期为白色，质地疏松；后期呈灰绿色，絮状，背面无色；分生孢子梗有松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗单生、互生或者束生；分生孢子呈椭圆形，单孢，近于无色，聚集时呈黄绿色，壁光滑。最适pH值8，最适盐浓度2-3％。
用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程有限公司)提取菌株KpS的基因组DNA，用真菌ITS序列测序的通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，SEQIDNO.1)和ITS4(5'-CGTATAGTTATTCGCCTCCT-3’，SEQIDNO.2)进行ITS序列PCR扩增。
PCR反应体系25μl：2×EsTaqMasterMix12.5μl，基因组DNA1μl，ITS1/4(10μM)各0.5μl，补水到25μl。
PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。
PCR扩增产物连接至pMD18-T载体上，将含有PCR扩增的目的片段的载体克隆至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体步骤如下：
(1)在微量离心管中配置如下DNA、载体混合液，全量为5μL。
pMD 18-T Vector 1μL
目的基因片段 0.1pmol-0.3pmol
ddH2O Add to 5μL
(2)加入等体积5μL的SolutionI，16℃连接30min。目的片段在2,000bp以上的DNA克隆时需要延长至数小时。
(3)将全量10μL体系加入至100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30min。
(4)42℃热激90s后，再次放置在冰上3-5min。
(5)加入890μL不含有抗生素的SOC或LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养60min，目的是使菌体复苏。
(6)向含抗生素的SOC或LB固体培养基上加入40μLX-gal和4μLIPTG备用。
(7)吸取100-200μL已转化的大肠杆菌DH5α感受态细胞加到步骤(6)的固体培养基上，均匀的涂开，37℃培养12-16h。
(8)挑取白斑于LB液体培养基中扩大培养，封口摇菌过夜，得到大肠杆菌菌液。以菌液为模板进行PCR扩增，电泳检测(见图4)，合格的菌液抽提质粒送到上海生工生物有限公司测序。
ITS序列的扩增片段为573bp，符合真菌ITS区域一般长度500-750bp。ITS序列的测序结果如下：
GGTATAGCGGAGGATGAGTCCGTAGGTGACCTGCGGAGGAACATTTCCATAAGCGGGGTCACGACCCGGGTGCGTCCCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTCCGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA(SEQIDNO.3)
将以上测序结果与NCBI网站的基因序列进行比对，结果表明：菌株KpS和Genbank登录号为No.KC859432.1的序列的同源性高达99％，结合真菌鉴定手册，确定菌株KpS为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)。
实施例2棘孢木霉KpS对植物的促生作用
1、棘孢木霉KpS对大豆幼苗的生长影响
以大豆为实验材料，检验棘孢木霉KpS对大豆幼苗生长的影响。大豆的培养容器用直径、深度各8cm，底部具有直径1.2cm圆孔的黑色塑料营养钵，营养钵中装入7cm深，121℃灭菌1h的蛭石。
大豆种子消毒处理：体积分数75％乙醇中浸泡1min，用质量分数5％次氯酸钠溶液浸泡两次，每次10min。每个营养钵播种5粒大豆种子，将营养钵置于方形盘内从底部加水使蛭石充分吸水。种子发芽后对营养钵进行1/2Hoagland营养液浇灌，置于5000lux光照强度，22℃培养，光照16h，黑暗8h，交替培养。15天左右，各植株幼苗生长良好。
将棘孢木霉KpS接种至含有30mLLB液体培养基的50mL三角瓶中，30℃180r/min培养12h，至菌液OD600值约等于1.0，使用移液器吸取1mL菌液转移至1000mLLB培养基中(或保持1:1000比例，按需培养)，30℃180r/min培养12-18h，得到棘孢木霉KpS培养液。
大豆营养钵分别设置无盐组和盐处理组，2个组中又分为设置菌处理组对照组。其中，无盐组中，菌处理组用1/2Hoagland营养液和棘孢木霉KpS培养液交替浇灌，对照组只用1/2Hoagland营养液浇灌；盐处理组中，菌处理组用NaCl浓度为0.5％的1/2Hoagland营养液和棘孢木霉KpS培养液交替浇灌，对照组只用NaCl浓度为0.5％的1/2Hoagland营养液浇灌。以上浇灌每次每钵浇20mL，2d一次。
测定大豆生长指标：大豆的鲜重、干物质重、株高、根长、叶绿色含量和SOD活性等。鲜重测量：取培养15天后的实验材料，清水冲洗掉根部土壤和蛭石，滤纸吸干表面水分，分析天平测定整株植物重量，至少取三株重复。干物质重测定：将测定过鲜重的植株在105℃下杀青20min，后80℃烘干直至恒重，约8h。株高测定：在培养容器中，从土壤表面测定至植株最高点的高度。根长测定：取出植株后从茎和根的分界点(一般为绿色和白色分界位置)到最长的根尖部分记作根长。
叶绿素含量测定：称取0.2g新鲜叶片于研钵中，加少量石英砂及碳酸钙粉末，用95％乙醇研磨，过滤定容至25ml。以95％乙醇为空白对照，在665nm和649nm波长条件下，测定吸光度值。
Ca＝13.95A665-6.8A649
Cb＝24.96A649-7.32A665
CT＝Ca+Cb
其中，色素的浓度为CT；提取液体积为25ml；样品鲜重为0.2g；稀释倍数为测定吸光度值时将提取液稀释的倍数。
SOD活性测定：称取0.5g试验材料叶片，加入少量碳酸钙和石英砂，用预冷的50μmol·L-1的磷酸缓冲液(pH7.0，含有1％PVP，0.1％巯基乙醇)5mL于冰浴上研磨(研钵在-20℃预冷30min)，定容至10mL，然后在4℃下12,000g离心20min，取上清液为粗酶提取液。
取4支试管，两支作为测定试管，两支为对照管。按表4.1加入相应试剂，混匀。其中一支对照管罩上锡箔纸避光，与其他各个试管同时放置于4000lux日光灯下反应20～30min，温度25～35℃，反应时间视酶活而定，光照样品至少要稀释5倍。
表4.1SOD活性测定反应体系
反应结束后，用铝箔纸罩上各个试管，终止反应。以遮光对照为空白对照，在560nm波长条件下分别测定各管的吸光度，按照下式计算SOD活性：
其中，A0为空白对照的吸光值；As为样品吸光值；VT为样品的总体积；V1为测定时样品用量(mL)；W为样品鲜重(g)。
具体检测见过结果见图5。
在棘孢木霉对盐胁迫下大豆幼苗生长的影响实验中，棘孢木霉在不加盐，和浓度0.5％的盐胁迫下大部分指标显著高于对照。
2、棘孢木霉KpS对海滨锦葵幼苗的生长影响
参照上述方法，以棘孢木霉KpS培养液侵染海滨锦葵幼苗，分别设置无盐组和NaCl浓度为100mmol/、200mmol/L和300mmol/L盐处理组，其中又分为菌处理组和对照组。无盐组中，菌处理组用1/2Hoagland营养液和棘孢木霉KpS培养液交替浇灌，对照组只用1/2Hoagland营养液浇灌；盐处理组中，菌处理组用含有相应浓度NaCl的1/2Hoagland营养液和棘孢木霉KpS培养液交替浇灌，对照组只用含有相应浓度NaCl的1/2Hoagland营养液浇灌。以上浇灌每次每钵浇20mL，2d一次。10d后对照组(CK，0mmol/LNaCl)和100mmol/LNaCl条件下，对照组与棘孢木霉和盐共同处理下海滨锦葵无明显差异，而在200mmol/LNaCl和300mmol/LNaCl处理下，棘孢木霉KpS接种海滨锦葵后，显著减轻盐处理对海滨锦葵的毒害作用。
测量鲜重结果如图6所示，棘孢木霉接种后，0mmol/LNaCl+菌(指棘孢木霉KpS)、200mmol/LNaCl+菌、300mmol/LNaCl+菌处理的植株鲜重比单独相同盐浓度处理植株的鲜重要高，其中无盐条件下的差异显著(P＜0.05)，300mmol/LNaCl差异极显著(P＜0.01)。测量干重结果如图7，300mmol/LNaCl处理组中菌处理组和对照组差异显著(P＜0.05)。含水量如图8所示，0mmol/LNaCl和200mmol/LNaCl盐处理组中对照组与接种棘孢木霉KpS相比差异显著(P＜0.05)，100mmol/LNaCl盐处理组中菌处理组和对照组差异不显著(P＞0.05)，300mmol/LNaCl盐处理组中菌处理组与对照组差异极显著(P＜0.01)，0mmol/LNaCl、200mmol/LNaCl和300mmol/LNaCl处理组中，菌处理组(EI)比对照组的含水量分别增加10.77％、10.34％和20.11％。
海滨锦葵幼苗的叶绿素结果如图9所示，0mmol/LNaCl和100mmol/LNaCl盐处理组中对照组和接种棘孢木霉组差异不显著(P＞0.05)，200mmol/LNaCl盐处理组中菌处理组和对照组差异显著(P＜0.05)，300mmol/LNaCl盐处理组中菌处理组和对照组差异极显著(P＜0.01)，200mmol/LNaCl盐处理组和300mmol/LNaCl盐处理组中菌处理组比对照组分别高出14.27％和33.69％。在低盐或无盐情况下，叶绿素含量没有明显差异，高盐浓度下，菌处理组的叶绿素含量显著高于对照组，这可能是由于低盐或无盐时内生真菌不敏感，高盐环境中内生真菌激活了植物的防御系统，通过菌丝等途径促进根系对水分的吸收，有利于气体交换，增强植物的光合作用。
实施例3棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体
1、棘孢木霉的ACC脱氨酶(acdS)基因的克隆和测序
提取棘孢木霉KpS基因组DNA，作为模板，根据Genbank中已经注释的TrichodermaasperellumstrainT203ACC脱氨酶基因(登录号：FJ751936)的序列，设计特异性引物ACC，正向引物ACC-FP(5’-CACCATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’，SEQIDNO.4)、反向引物ACC-RP(5’-GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGTTCAAC-3’，SEQIDNO.5)，克隆目的基因acdS。
PCR反应体系25μl：2×EsTaqMasterMix12.5μl、基因组DNA0.5μl、ACC-FP(10μM)和ACC-RP(10μM)各0.5μl，补水到25μl。
PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。
PCR扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，GlodviewⅠ型核酸染色剂染色，320nm紫外光下观察得到单一目的条带，大小约为1118bp。将PCR产物回收纯化，并连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，涂布含IPTG和X-gal的LB平板，培养筛选单克隆，挑取单克隆接种LB液体培养基扩大培养，得到大肠杆菌菌液，进行质粒抽提并测序，结果在NCBI网站进行BLAST比对分析。与Genbank中已经注释的TrichodermaasperellumstrainT203ACC脱氨酶基因的序列进行比对，结果发现完全吻合，测序基因碱基配对率100％。
2、载体质粒和具有酶切位点的acdS基因的获得
根据测序结果，设计在毕赤酵母中表达所需的棘孢木霉acdS基因扩增特异引物T-acdS，在引物两端加特异的酶切位点。
正向引物T-acdS-FP：5’-TACGTAATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’(SEQIDNO.6)，下划线为SnaBⅠ酶切位点；
反向引物T-acdS-RP：5’-GCGGCCGCGTCTAAAAGAGAGGAATACGCGT-3’(SEQIDNO.7)，下划线为NotⅠ酶切位点。
以含有棘孢木霉acdS基因的重组质粒的大肠杆菌菌液(步骤1的大肠杆菌菌液)为模板，PCR扩增目的基因。
PCR反应体系25μl：2×EsTaqMasterMix12.5μl，大肠杆菌菌液1μl，T-acdS-FP(10μM)和T-acdS-RP(10μM)各0.5μl，补水到25μl。
PCR反应程序：94℃预变性8min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。PCR扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，GlodviewⅠ型核酸染色剂染色，320nm紫外光下观察得到单一目的条带，大小约为1129bp，符合预期(图10)。
将PCR产物和载体质粒pPIC9K同时用SnaBⅠ和NotⅠ双酶切。
双酶切体系为：10×QuickCutBuffer5μl、载体质粒pPIC9K或PCR产物1μg，5U/μl的SnaBⅠ和NotⅠ各1μl，补水到50μl。
双酶切条件为：37℃金属浴消化1h。
65℃灭活10min，立即将反应体系放入冰盒中。分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒回收纯化。
PCR扩增的目的基因acdS片段测序，测序结果与棘孢木霉ACC脱氨酶基因进行比对，结果表明，测序基因碱基配对率99％。
3、体外连接和重组质粒转化大肠杆菌
将回收纯化的载体质粒pPIC9K和PCR产物的酶切产物进行体外连接，具体方法为：将200ng酶切回收的载体质粒pPIC9K和100ng酶切回收PCR产物依次加入1.5ml离心管，补水到17μl，轻轻混匀后45℃水浴5min置冰上，加入10×T4DNALigaseBuffer2μl和T4DNALigase1μg，使反应总体系为20μl，轻轻混匀，16℃金属浴连接2h。
将连接产物65℃加热5min灭活，立即冰浴；加入50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴2min；加入37℃预热的LB液体培养基1ml，37℃孵育1h；8000×g离心2min，弃去800μl上清，将剩余菌液吸打混匀，涂布含50mg/L氨苄西林的LB固体平板；37℃过夜培养。挑单克隆接种于LB液体培养基扩大培养，以培养的大肠杆菌为模板，PCR扩增目的基因。
PCR反应体系25μl：2×EsTaqMasterMix12.5μl，大肠杆菌菌液1μl，T-acdS-FP(10μM)和T-acdS-RP(10μM)各0.5μl，补水到25μl。
PCR反应程序：94℃预变性8min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。
PCR扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，GlodviewI型核酸染色剂染色，320nm紫外光下观察得到单一目的条带，大小约为1129bp(图11)。将有目的基因条带的单克隆接种于LB液体培养基扩大培养，提取质粒。将提取的质粒双酶切，双酶切体系为：10×QuickCutBuffer5μl、质粒约1μg，5U/μl的SnaBⅠ和NotⅠ各1μl，补水到50μl。双酶切条件为：轻轻混匀反应体系，37℃消化5min，65℃灭活10min，终止反应，立即冰浴。
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明，在约1100bp和9000bp处各有一条明显条带(图11)，酶切鉴定正确的命名为重组质粒pPIC9K-acdS。
4、棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建
4.1重组质粒pPIC9K-acdS线性化
用SacI线性化重组质粒pPIC9K-acdS，体系50μl：10×CutsmartBuffer5μl，重组质粒pPIC9K-acdS30μg，5U/μl的Q.cutSacI2μl，补水到50μl。37℃金属浴消化5min，65℃灭活10min。加入体积量10％的3MpH5.2乙酸钠，1倍体积量的100％乙醇沉淀，-20℃静置30min，离心弃上清，再用75％乙醇洗1次，离心弃上清，干燥，加灭菌水溶解即可。将SacI线性化重组质粒pPIC9K-acdS进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图11。
4.2毕赤酵母感受态细胞的制备：
(1)挑取酵母受体菌的单菌落接种于10mLYPD培养基中，29℃摇床过夜。
(2)以1％接种量转接100mLYPD液体培养基，30℃摇床过夜至OD＝1.3-1.5，4℃2000rpm离心5min，弃上清。
(3)用8mLX液[10mMLiAc，0.6M山梨醇，10mMTris-HCl(PH7.5)](用前加80μl1MDTT)将菌体重悬，4℃2000rpm离心10min，弃上清。
(4)用1mL1M冰预冷的山梨醇将菌体重悬，4℃2000rpm离心10min，弃上清。重复3次。
(5)溶于1mL1M冰预冷的山梨醇，取100μl分装到新的离心管中以备转化。
4.3毕赤酵母的转化
向100μl新制备的毕赤酵母感受态细胞中加入用SacI线性化的重组质粒pPIC9K-acdS1-5μg，混匀后冰浴30min，转入0.2cm电击杯中(冰预冷)冰上放置5min，电击，迅速加入1ml1M的山梨醇，转移至1.5ml离心管中，30℃孵育1-2h，分别取100-600μl涂于MD平板上。29℃培养3-4天，长出肉眼可见的单菌落(转化子)。
4.4遗传霉素筛选转化子
选择长出可分的单菌落的MD平板，并将MD平板上长出的单菌落编号，灭菌牙签挑取单克隆，复制到YPD平板上的划线格中，29℃培养1-2d。并在MD和MM平板鉴定其表型。所有转化子均在MD平板上正常生长而在MM平板上生长缓慢，表明转化子的表型均为甲醇利用型(Mut+)。可以利用含遗传霉素G418的YPD平板筛选，获得抗2.0mg/ml遗传霉素G418的转化子。
将YPD复制培养的单菌落点接种于遗传霉素G418浓度逐渐升高的YPD平板上，遗传霉素G418浓度梯度为0.5、0.75、1.0、1.5、1.75、2.0、3.0及4.0mg/ml。最终筛选出四株转化子A69、B11、B35、B43。
4.5acdS在酵母中的诱导表达
挑取筛选出的四株转化子单菌落，分别接种到50mlBMGY液体培养基中，28℃振荡培养16h，测定其OD600在2～6之间。3000r/min离心5min，弃上清。用20mlBMMY液体培养基重悬菌体，28℃、200r/min振荡培养96h。期间每12h向培养基中加100％甲醇至终浓度为0.5％～1.0％，并且每24h取出1ml培养物，1500r/min离心2min，取上清液-20℃保存备用。SDS-PAGE电泳检测表达产物将诱导表达产物用SDS-PAGE凝胶电泳检测，5％浓缩胶、10％分离胶分离其表达产物，在120kD附近有一条条带(见图12)，符合预期。结果表明，本发明成功构建得到棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体。
实施例4转化子的耐盐性分析
将成功表达ACC脱氨酶的四株转化子分别接种于NaCl浓度0％、3％、6％、9％和12％的YPD平板上，以未经转化的毕赤酵母作为对照(结果见图13)。结果表明，四株转化子在不含盐的YPD平板上正常生长与对照基本无差别，在NaCl浓度3％的平板上对照组的菌落比四株转化子稍小，但是不明显；在NaCl浓度6％和9％的平板上四株转化子菌落明显比对照组大，其中菌株B11、B35、B43菌落更大更厚；在NaCl浓度12％的YPD平板上，对照组和四株转化子都生长较慢，菌圈较小菌落较透明，但是转化子的菌落明显比对照组大，差异肉眼可见。
将转化子B11和B35分别接种于NaCl浓度0％、3％、6％、9％和12％的的YPD液体培养基中，以未经转化的的毕赤酵母作为对照(结果见图14)。结果表明，转化子B11和B35均比对照组繁殖快，其中在NaCl浓度3％时比不含盐的培养基中长势更好，且OD600值分别比对照高出65.78％和45.12％。

Claims (9)

1.棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体，其特征在于，将棘孢木霉的ACC脱氨酶基因和质粒pPIC9K连接后，转化毕赤酵母构建而成。
2.根据权利要求1所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)KpS，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015770，保藏日期：2015年12月23日。
3.一种如权利要求2所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据棘孢木霉菌株T203ACC脱氨酶基因，设计特异性引物ACC，以棘孢木霉KpS基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收纯化，并连接T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，得到大肠杆菌菌液，进行质粒抽提并测序；
(2)根据步骤(1)的测序结果，设计特异性引物T-acdS，以步骤(1)大肠杆菌菌液为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物和载体质粒pPIC9K同时双酶切，两个酶切产物连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，质粒抽提并酶切鉴定，酶切鉴定正确的命名为重组质粒pPIC9K-acds；
(3)用Sacl线性化重组质粒pPIC9K-acdS，然后电转化毕赤酵母感受态细胞即得。
4.根据权利要求3所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)的特异性引物ACC为：
正向引物ACC-FP：5’-CACCATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’
反向引物ACC-RP：5’-GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGTTCAAC-3’。
5.根据权利要求3所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)的特异性引物T-acdS为：
正向引物T-acdS-FP：5’-TACGTAATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’
反向引物T-acdS-RP：5’-GCGGCCGCGTCTAAAAGAGAGGAATACGCGT-3’。
6.根据权利要求3所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)的PCR反应体系为：2×EsTaqMasterMix12.5μl，基因组DNA0.5μl、10μM正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，补水到25μl；步骤(1)的PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。
7.根据权利要求3所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)的PCR反应体系为：2×EsTaqMasterMix12.5μl，大肠杆菌菌液1μl、10μM正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，补水到25μl；步骤(2)的PCR反应条件为：94℃预变性8min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。
8.根据权利要求3-7任一项所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)的双酶切体系为：10×QuickCutBuffer5μl、载体质粒pPIC9K或PCR产物1μg，5U/μl的SnaBⅠ和NotⅠ各1μl，补水到50μl；双酶切条件为：37℃金属浴消化1h。
9.一种如权利要求1所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的蛋白表达方法，其特征在于，具体步骤为：将棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体接种到BMGY液体培养基中，振荡培养至OD600为2-6，离心，弃上清，加BMMY液体培养基重悬，并加入100％甲醇诱导表达即得。
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