CN105624049B - 一种草坪币斑病菌的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草坪币斑病菌的分离方法，包括如下步骤：病样采集：切取具有典型币斑病症状的病健交接处植株及土壤样本作为病样；病样保湿培养；病原菌分离：使用接种针挑取在病样表面长出的细丝状菌丝，置于APDA培养基上，22‑25℃黑暗条件培养2d；病原菌纯化：待气生菌丝长出后，切取菌落边缘的菌丝尖端，转入新的APDA培养基上，22‑25℃黑暗条件培养3‑5d，得到目的病原菌。本发明通过对病样进行保湿培养前处理，并结合酸化PDA培养基的使用，可解决币斑病菌分离过程中各种非目标真菌污染的问题，且操作简单，整个过程无需严格的消毒杀菌操作。与传统币斑病菌分离方法相比，分离效率及成功率显著提高。

Description

一种草坪币斑病菌的分离方法

技术领域

本发明属于植物病原微生物领域，涉及一种草坪币斑病菌的分离方法。

背景技术

草坪币斑病菌(Sclerotinia homoeocarpa)是一种重要的植物病原真菌，其寄主种类繁多，可以侵染多种冷季型以及暖季型草坪草。自1932年首次在美国发现并报道以来，现已在全世界范围内分布广泛。前期调查结果显示草坪币斑病在我国20多个省区均有发生。币斑病主要危害草坪草的叶片，造成草坪草的枯黄直至死亡，严重影响草坪的景观美景度。

币斑病主要有初夏和初秋两个发病高峰期，当土壤温度高于18℃、夜间湿度较大时币斑病开始发病，发病初期在草坪上形成约硬币大小的近圆形黄斑块，发病严重时，斑块可连接成大片的枯草区。

币斑病菌不产生孢子，其初侵染来源主要包括潜伏在种子内的病菌组织，越冬休眠的菌丝体或无侵染症状的植株体。病原菌多从寄主的伤口侵入，再侵染主要通过人为或机械的方式传播。侵染后期，受侵染的草坪叶片上常混有多种腐生真菌或细菌，因此在币斑病菌的实际分离过程中常难以快速、准确的分离出目标菌。

常规的币斑病菌分离对病样的采集至分离的时间要求严格，通常在采集的24h之内需要进行病原菌的分离以提高分离成功率，然而实际操作过程中，病样采集后需要长距离运输至实验室才能有条件进行病原菌的分离，此时其它病原杂菌就容易滋生，从而降低目标菌分离成功率；此外常规的分离方法需要对病组织进行严格的消毒处理，而消毒处理的同时可能会杀死目的病菌，致使病原菌的分离效率大大降低。为了有效开展草坪币斑病菌抗药性监测、群体遗传以及致病性等相关的研究，开发一种快速、高效的分离草坪币斑病菌是进行相关研究的必要前提条件。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种高效的草坪币斑病菌的分离方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供的技术方案如下：

一种草坪币斑病菌的分离方法，包括如下步骤：

(1)、病样采集：切取具有典型币斑病症状的病健交接处植株及土壤样本作为病样；

(2)、病样保湿培养：将步骤(1)获得的病样保湿培养2-3天，培养条件为22-25℃光照16h/18-20℃黑暗8h交替培养；；

(3)、病原菌分离：使用接种针挑取经过保湿培养后在病样表面长出的细丝状菌丝，置于APDA培养基上，22-25℃黑暗条件培养2-3d；

(4)、病原菌纯化：待气生菌丝长出后，切取菌落边缘的菌丝尖端，转入新的APDA培养基上，22-25℃黑暗条件培养3-5d，得到目的病原菌。

步骤(1)中，病样采集工具为土壤取样器。所述的土壤样本的直径为4-5cm、高度为6-10cm。所述的病样装入信封中，室温(温度20-30℃)运输至实验室，置于4℃冰箱中保存。病样装于纸质保存袋如信封中，运输过程透气不易使病样腐烂。

步骤(2)中，将病样置于经过灭菌处理的花盆或穴盘中，喷施无菌水使其湿度不低于80％，优选为88％-95％，使用封口膜密封后将病样置于光照培养箱中进行保湿培养2-3d，培养条件为22-25℃光照16h/18-20℃黑暗8h交替培养。保湿培养的条件为草坪币斑病菌适宜的生长条件。

所述的花盆或穴盘在80℃下烘干2h进行灭菌处理。

一般分离病样时，每个样本都需要做几个重复以提高分离效率。步骤(3)中，使用接种针挑取草坪草或土壤表面经过保湿培养后长出的细丝状菌丝，每个病样挑取2-4个菌丝体，置于APDA培养基上。

本发明所述的APDA培养基的制备方法为：称取马铃薯200g，削皮切块后置于去离子水中加热煮沸20min，用双层纱布过滤收集滤液后定容到1L，加入15g琼脂和18g葡萄糖混匀后，121℃湿热灭菌20min，待培养基温度降至55-60℃，调节培养基的pH为3.8-4.2。通过加入醋酸调试培养基的pH，并用pH试纸检测培养基的pH。

本发明所述的感病植物为草地早熟禾(Poa pratensis)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、海滨雀稗(Paspalum vaginatum)等草坪草。

本发明所述的病原菌为草坪币斑病菌。

本发明通过对病样进行保湿培养前处理可以使币斑病菌迅速扩展，并结合酸化APDA培养基的使用，可以促进币斑病菌生长而抑制大部分杂菌生长，从而解决币斑病菌分离过程中各种非目标真菌污染的问题，同时也解决病样运输过程中需要低温以及病原菌分离需要快速进行(病样采集24小时内分离)的要求，与常规的币斑病菌分离鉴定方法相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明使用取样器切取的发病组织及土壤作为一整体，可保证病原菌在室温及4℃低温条件下长期存活，病样采集后无需立刻进行病原菌的分离，装入信封中室温条件下运输至实验室置于4℃冰箱保存，可以4℃冰箱中保存两个月直至病原菌分离工作的开始，仍能有效的分离出目的病原菌，病原菌分离可分批次进行，操作性强。

(2)本发明无需对病组织进行严格的表面消毒，仅需对病样进行简单的保湿培养即可，操作简单、方便、安全。

(4)本发明病原菌分离效率高，因省去常规的病组织消毒步骤，目的病原菌存活不受影响，使得其分离效率及成功率大大提高。

(5)本发明分离病原菌时无需严格的无菌操作环境，可在实验室操作台面上进行，能同时实现多位人员的操作，比较适合大样本量病原菌的分离。

附图说明

图1为病样保湿培养后的草坪币斑病菌的菌丝形态特征，其中箭头所示为细丝状的草坪币斑病菌菌丝。

图2为病样保湿培养后的杂菌的菌丝形态特征，其中箭头所示为杂菌的菌丝。

图3为本发明方法分离草坪币斑病菌的结果，其中箭头所示为气生状态的草坪币斑病菌，每个培养皿代表1个病样的分离结果。

图4为传统方法分离草坪币斑病菌的结果，其中箭头所示为气生状态的草坪币斑病菌，每个培养皿代表1个病样的分离结果。

图5为草坪币斑病菌ITS的PCR扩增产物电泳图谱。M＝maker，1-8代表不同地理来源的病样分离得到的草坪币斑病菌。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施过程进行描述，所举实施例只用于解释本发明，而不用于限定本发明的范围。

实施例1

1、实验方法

采用本发明方法对草坪币斑病菌进行分离，包括如下步骤：

(1)病样采集：使用土壤取样器切取直径4cm，高度6-8cm具有典型币斑病症状的病健交接处植株及土壤样本作为病样，装入信封中后室温运输，带回实验室后转入4℃冰箱中保存；

(2)病样保湿处理：将步骤(1)所保存病样取出，置于经过灭菌处理(80℃烘干2h)的花盆或穴盘中，喷施无菌水使湿度不低于80％，使用封口膜密封后将病样置于光照培养箱中进行保湿培养2-3d，培养条件为22-25℃光照16h/18-20℃黑暗8h交替培养；

(3)病原菌分离：经过步骤(2)保湿培养后，使用接种针挑取草坪草或土壤表面长出的细丝状菌丝(如图1所示)置于APDA培养基上，每个病样挑取2-4个菌丝体，25℃黑暗条件培养2d；所述的APDA培养基的制备方法为：称取马铃薯200g，削皮切块后置于去离子水中加热煮沸20min，用双层纱布过滤收集滤液后定容到1L，加入15g琼脂和18g葡萄糖混匀后，121℃湿热灭菌20min，待培养基温度降至55-60℃，采用醋酸调节培养基的pH为3.8-4.2；

(4)病原菌纯化：待菌丝长出后，切取菌落边缘的菌丝尖端，转入新的APDA培养基上25℃黑暗条件培养3-5d，最终得到纯化病原菌；

(5)、形态鉴定：币斑病菌菌落形态在培养基上表现为絮状气生菌丝(图3)，在培养基上扩展的同时向培养皿盖上生长，通过生物学特征初步判定为草坪币斑病菌；

(6)、病原菌PCR鉴定：将步骤(4)培养获得的病原菌进行DNA提取用于PCR分子鉴定：

①DNA提取：

a、将步骤(4)培养得到的病原菌转入铺有灭菌玻璃纸的培养基上，25℃黑暗条件培养3d后获得菌丝体，菌丝体使用液氮法研磨粉碎后用于DNA的提取；

b、使用Qiagen Dneasy Plant Mini KitDNA提取试剂盒提取病原菌DNA；

②ITS序列扩增引物：ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，预期扩增片段长度为600bp；

③PCR扩增反应体系：25μL反应体系含有2.5μL 10×Taq Buffer，1μL模板DNA，0.4mM dNTPs，1.25mM MgCl₂，0.5μM ITS4和ITS5 0.5U Taq Polymerase；

④PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后35个循环扩增反应，即95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min；

⑤电泳检测：吸取2μL PCR产物，在1％的琼脂凝胶上进行电泳检测；

⑥分子鉴定：将扩增产物送至公司进行测序，对测序结果进行比对确定病原菌。

2、实验结果

实验结果显示，对150份采自草地早熟禾(20份)、匍匐翦股颖(17份)、海滨雀稗(113份)具有典型币斑病症状的病样进行分离，均能长出具有币斑病菌典型形态特征的病原物(图3)，为进一步确定分离病原物为币斑病菌，对其中8株形态差异明显的分离物进行ITS分子鉴定(图5)。ITS序列比对结果显示所有扩增产物的部分序列与GenBank：HQ449691.1所示的草坪币斑病菌的核糖体rRNA基因区域序列同源性达到100％。综上所述，采用本发明的方法对草坪币斑病菌进行分离时，分离效率高，所有病样均可有效分离出币斑病菌。

实施例2

1、实验方法

采用传统方法分离草坪币斑病菌，包括如下步骤：

(1)病样采集：田间采集具有币斑病典型症状的病样，转至实验室24h内进行病原菌的分离；

(2)病样前处理：选取具有典型发病症状的叶片组织，使用0.5％次氯酸钠消毒60s后用无菌冲洗多次；

(3)病原菌分离：经过步骤(2)消毒处理后，将干净的叶片置于APDA培养基上，25℃黑暗条件培养2d；

(4)病原菌纯化：待菌丝长出后，切取菌落边缘的菌丝尖端转入新的APDA培养基上25℃黑暗条件培养3-5d，最终得到纯化病原菌；

(5)形态鉴定：同实施例1；

(6)病原菌PCR鉴定：同实施例1。

2、实验结果

实验结果显示，对150份采自草地早熟禾(20份)、匍匐翦股颖(17份)、海滨雀稗(113份)具有典型币斑病症状的病样进行分离，仅有30份长出具有币斑病菌典型形态特征的病原物(图5)，对其中5株疑似币斑病菌进行ITS分子鉴定，ITS序列比对结果显示所有扩增产物的部分序列与GenBank：HQ449691.1所示的草坪币斑病菌的核糖体rRNA基因区域序列同源性达到100％。综上所述，采用传统方法对常规采集保存的具有典型币斑病症状的病样进行病原菌分离时，分离效率较低，仅有20％的病样可有效分离出币斑病菌，使分离效率大大降低。

Claims (9)

1.一种草坪币斑病菌的分离方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）、病样采集：切取具有典型币斑病症状的病健交接处植株及土壤样本作为病样；

（2）、病样保湿培养：将步骤（1）获得的病样保湿培养2-3天，培养条件为22-25℃光照16h/18-20℃黑暗8 h交替培养；

（3）、病原菌分离：使用接种针挑取经过保湿培养后在病样表面长出的细丝状菌丝，置于APDA培养基上，22-25℃黑暗条件培养2-3 d；

（4）、病原菌纯化：待气生菌丝长出后，切取菌落边缘的菌丝尖端，转入新的APDA培养基上，22-25℃黑暗条件培养3-5 d，得到目的病原菌。

2.根据权利要求1所述的草坪币斑病菌的分离方法，其特征在于步骤（1）中，病样采集工具为土壤取样器。

3.根据权利要求1所述的草坪币斑病菌的分离方法，其特征在于步骤（1）中，所述的土壤样本的直径为4-5 cm、高度为6-10 cm。

4.根据权利要求1所述的草坪币斑病菌的分离方法，其特征在于步骤（1）中，所述的病样装入信封中，20-30℃温度下运输至实验室，置于4℃冰箱中保存。

5.根据权利要求1所述的草坪币斑病菌的分离方法，其特征在于步骤（2）中，将病样置于经过灭菌处理的花盆或穴盘中，喷施无菌水使病样湿度不低于80%，使用封口膜密封后将病样置于光照培养箱中进行保湿培养2-3 d，培养条件为22-25℃光照16 h/18-20℃黑暗8h交替培养。

6.根据权利要求 5所述的草坪币斑病菌的分离方法，其特征在于所述的花盆或穴盘在80 ℃下烘干2 h进行灭菌处理。

7.根据权利要求1所述的草坪币斑病菌的分离方法，其特征在于步骤（3）中，使用接种针挑取草坪草或土壤表面经过保湿培养后长出的细丝状菌丝，置于APDA培养基上培养。

8.根据权利要求1所述的草坪币斑病菌的分离方法，其特征在于所述的APDA培养基的制备方法为：称取马铃薯200 g，削皮切块后置于去离子水中加热煮沸20 min，用双层纱布过滤收集滤液后定容到1 L，加入15 g琼脂和18 g葡萄糖混匀后，121℃湿热灭菌20 min，待培养基温度降至55-60℃，调节培养基的pH为3.8-4.2。

9.根据权利要求1所述的草坪币斑病菌的分离方法，其特征在于感病植物为草地早熟禾、匍匐剪股颖、海滨雀稗。