CN103598087A - 一种猪肚菇低温型菌株选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种猪肚菇低温型菌种选育方法，采用低温驯化猪肚菇单核菌株，选出在较低温度下生长快的单核菌株通过杂交育种，选育出杂交菌株。通过拮抗试验和分子标记技术对杂交菌株进行鉴定，比较不同温度下杂交菌株和栽培菌株的菌丝生长速度，最终选育出子实体形成温度比常规栽培菌株低的3个菌株，其中的2个菌株可以在18℃下形成子实体。本发明采用低温驯化和杂交育种的方法选育低温型猪肚菇菌株，对猪肚菇的育种方法进行试探，探索低温型菌株的选育方法，并且为进一步推广栽培提供低温型菌株。

Description

一种猪肚菇低温型菌株选育方法

技术领域

本发明属于食用菌育种领域，特别涉及一种猪肚菇低温型菌株选育方法。 

背景技术

在食用菌生产中，优良菌种的选用是实现优质高产的基本前提。优良食用菌品种是保证食用菌产业稳步、健康发展的基础。 

食用菌育种技术的研究，近十几年发展相当迅速。无论在野生食用菌驯化方面，还是在栽培食用菌的育种研究方面均有重要进展，但是现有的食用菌育种规模和技术水平都还远远不能满足食用菌生产迅猛发展的需要。 

食用菌的育种方法主要包括选择育种、杂交育种和诱变育种等常规育种技术以及利用原生质体技术和分子生物学技术为手段的现代育种新技术，其中杂交育种最为常见，也最为重要。 

高产、优质、抗逆性强和适应性好是食用菌育种的最基本目标。不过，随着食用菌产业不断向深度和广度发展，对食用菌育种也提出了更高的要求。有时，人们为了解决某一些特殊问题，会相应地制定一些特殊的育种目标。 

拓宽食用菌菌丝发育和出菇的适应温度，使之可以在更广泛的地方栽培。亚洲的两大主要栽培食用菌——香菇（Lentinula edodes）和 草菇（Volvariella volvacea），菇肉细嫩，味道鲜美，颇受市场欢迎。前者主要在温带栽培，通常在20℃以上即难以出菇。后者是典型的热带、亚热带菇类，一般在28℃以下即停止出菇。如果能育成突破出菇上限的“高温型”香菇品种和突破出菇下限的“低温型”草菇品种，那么，香菇“南下”及草菇“北上”的范围将进一步扩大。 

目前在低温型草菇菌株选育有一些报道，而其他高温型食用菌鲜有技术报道。野生猪肚菇（Panus giganteus）分布在我国广东、福建、湖南、海南和浙江等省以及东南亚和大洋洲等热带及亚热带地区，菌丝生长最适温度26–28℃，子实体发育温度23–32℃。其菌丝生长阶段偏向中温型，而子实体发育阶段却属高温型。大规模地利用各种廉价的基质和废物来生产食用菌已被确认为是通过生物的作用，将粗纤维转变为人类可以食用的优质蛋白的一种重要途径。目前猪肚菇的研究报道和栽培推广主要是在我国的福建和浙江等南方省展开，当地每年5-9月份适宜出菇，但是在北方生产猪肚菇的适宜自然气候时间较短，目前尚无适宜在北方地区栽培的猪肚菇菌株，在猪肚菇低温选育方面也鲜有报道。 

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，为了选育适宜在北方地区栽培的猪肚菇菌株，也就是出菇温度较低的菌株，本发明提出了一种猪肚菇低温型菌种选育方法，采用低温驯化和杂交育种的方法选育低温型猪肚菇菌株，对猪肚菇的育种方法进行试探，探索低温型菌株的选育方法，并且为进一步推广栽培提供低温型菌株。 

为达到上述目的，本发明的技术方案为： 

一种猪肚菇低温型菌种选育方法，包括如下步骤： 

步骤一、筛选在20℃下出菇的猪肚菇子实体分离单孢子； 

步骤二、采用低温驯化猪肚菇单核菌株，选出在较低温度下生长快的单核菌株； 

步骤三、通过杂交育种，选育出低温型杂交菌株； 

步骤四、通过拮抗试验和分子标记技术对选育杂交菌株进行鉴定。 

所述步骤一的详细步骤为： 

1）子实体培养：选取棉籽壳83%，麸皮15%，石灰2%，含水量63%作为栽培培养基，将培养基按照配方拌料、装袋，灭菌、接种和培养，菌丝满袋后移入塑料菇棚采用袋内覆土出菇，覆土厚度3－4cm，菇棚每天定时通风，喷水保湿，常规方法进行出菇管理； 

2）分离单孢子实体的获得：每天观察菇棚温度的变化，当温度较低时观察不同菌株的子实体生长情况，在菇棚温度20℃时选取仍然发生的子实体，采下子实体用于分离单孢； 

3）单孢子分离：采用常规稀释法分离单孢，在收集有孢子的玻璃瓶中加入灭菌的玻璃珠数十粒，加入无菌水剧烈振荡稀释孢子液；同时用血球计数板计数，选取PDA培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；采用梯度稀释涂布100μl孢子浓度10³个/mL的孢子液到PDA平板上；试验时为防止细菌污染在培养基中添加500mg/L卡那霉素。 

所述步骤二的详细步骤为： 

1）低温驯化处理：将涂有孢子的平板置于25℃恒温培养，定期观察孢子萌发情况，当孢子萌发出现肉眼可见的微小白点时，置于4℃冰箱低温驯化45d，然后在无菌条件下将低温驯化处理的单孢挑取至PDA平板上，置于20℃恒温培养； 

2）单核菌株的鉴定：当单孢在平板上长至菌落1cm大小时，挑取菌丝于载玻片上显微镜检，观察显微下菌丝形态，挑选无锁状联合的为单核菌丝体；分别编号； 

3）单核菌株在不同温度下的菌丝生长速度试验 

将单核菌株分别接种到PDA平板培养基的中央，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养，每个菌株三次重复；采用十字画线法，从接种第二天菌丝生长尖端为起点，精确测量菌落直径，观察记录其生长势并按照下列公式计算菌丝生长速度： 

菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d）； 

4）选择在25℃生长最好且在15-25℃之间生长较好的单核菌株作为选育低温型菌株的亲本单核菌株。 

所述步骤三的详细步骤为：选取两亲本单核菌株的菌丝体接入PDA平板上，相距1-2cm，然后放置于25℃恒温培养，待两菌块的菌丝生长至互相交接时，于交接处挑取一块大的菌丝体进行显微观察，出现锁状联合的说明可以杂交，将杂交成功的菌丝体转接到试管斜面上培养备用，后将杂交菌株分别接种到PDA平板培养基的中央，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养，每个菌株三次重 复，采用十字画线法，从接种第二天菌丝生长尖端为起点，精确测量菌落直径，观察记录其生长势并按照下列公式计算菌丝生长速度， 

菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d）， 

以选取的亲本猪肚菇栽培菌株为对照，选取子实体形成温度低于常规菌株的杂交菌株，并记录温度。 

所述步骤四杂交菌株鉴定中，子实体培养基采用麦芽汁培养基。 

相对于现有技术，本发明的有益效果为： 

本发明采用低温驯化和杂交育种的方法选育低温型猪肚菇菌株，对猪肚菇的育种方法进行试探，探索低温型菌株的选育方法，并且为进一步推广栽培提供低温型菌株。采用低温驯化猪肚菇单核菌株，选出在较低温度下生长快的单核菌株通过杂交育种，选育出杂交菌株。通过拮抗试验和分子标记技术对杂交菌株进行鉴定，比较不同温度下杂交菌株和栽培菌株的菌丝生长速度，最终选育出子实体形成温度比常规栽培菌株低的3个菌株，其中的2个菌株可以在18℃下形成子实体。 

附图说明

图1不同温度下I组单核菌株的菌丝生长速度。 

图2不同温度下II组单核菌株的菌丝生长速度。 

图3杂交菌株与亲本的拮抗反应。 

图4猪肚菇种间的系统发育树。 

图5不同温度下杂交菌株的菌丝生长速度。 

图6不同温度下栽培菌株的菌丝生长速度。 

图7 P10和P24菌株在麦芽汁培养基上形成的子实体。 

具体实施方式

下面结合附图及具体实验例对本发明做进一步详细说明 

试验例1：猪肚菇杂交亲本单核菌株的筛选 

1.1材料与方法 

1.1.1材料 

供试菌株：猪肚菇菌株来源见表1，保存在PDA试管斜面上。 

表1供试猪肚菇菌株 

PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。 

栽培培养基：棉籽壳83%，麸皮15%，石灰2%，含水量63%，pH自然。 

1.1.2试验方法 

1.1.2.1子实体培养 

将培养料按照配方拌料、装袋，灭菌、接种和培养，菌丝满袋后移入塑料菇棚采用袋内覆土出菇，覆土厚度3－4cm。菇棚每天定时通风，喷水保湿，进行出菇管理。 

1.2.2分离单孢子实体的获得 

每天观察菇棚温度的变化，当温度较低时观察不同菌株的子实体生长情况，在菇棚温度20℃时发现还有1号和7号个别子实体发生，采下子实体用于分离单孢。 

1.1.2.3单孢分离 

采用常规稀释法分离单孢，在收集有孢子的玻璃瓶中加入灭菌的玻璃珠数十粒，加入无菌水剧烈振荡稀释孢子液。同时用血球计数板计数，采用梯度稀释涂布100μl孢子浓度10³个/mL的孢子液到PDA平板上。试验时为防止细菌污染在培养基中添加500mg/L卡那霉素。 

1.1.2.4低温驯化处理 

将涂有孢子的平板置于25℃恒温培养，定期观察孢子萌发情况。当孢子萌发出现肉眼可见的微小白点时，置于4℃冰箱低温驯化45d。然后在无菌条件下将低温驯化处理的单孢挑取至PDA平板上，置于20℃恒温培养。 

1.1.2.5单核菌株的鉴定 

当单孢在平板上长至菌落1cm大小时，挑取菌丝于载玻片上显微镜检，观察显微下菌丝形态，挑选无锁状联合的为单核菌丝体。将供试的1号和7号两种菌株的单核体分别记为I组和II组并分别编号。 

1.1.2.6单核菌株在不同温度下的菌丝生长速度试验 

将单核菌株分别接种到PDA平板培养基的中央，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养，每个菌株三次重复。采用十字画线法，从接种第二天菌丝生长尖端为起点，精确测量菌落直径，观察记录其生长势并按照下列公式计算菌丝生长速度。 

菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d）。 

1.2结果与分析 

1.2.1单核菌株的检出 

将低温驯化处理的单孢菌落进行显微镜检，单核菌丝不具有锁状联合，以此来鉴别单核体。1号菌株子实体获得73株单核菌株（I组）；7号菌株子实体获得86株单核菌株（II组）。 

1.2.2不同温度下单核菌株的生长速度 

分离得到2组单核菌株在不同温度下生长速度不同，具体数据见附录二。不同单核菌株的温度特性不同，大多数在25-30℃之间生长最好。一部分菌株在25℃时生长最快，一部分菌株在30℃时生长最快，还有一部分菌株在15℃不能正常生长，一部分菌株在35℃不能正常生长。 

通过综合比较，选择在25℃生长最好且在15-25℃之间生长较好的单核菌株作为选育低温型菌株的亲本单核菌株，这样从I组中选出1号、2号、4号、15号、25号、47号、57号、58号、60号和64号等10株单核菌株，从II组中选出2号、5号、19号、42号和72号等5株单核菌株分别作为杂交育种的亲本。I组中选出的10株单核菌株在不同温度下的菌丝生长速度见图1，II组中选出10株单核菌株在不同温度下的菌丝生长速度见图2。从图1和图2中可以看出选出的两组单核菌株在25℃时菌丝生长速度最快，并且在15-25℃之间生长也较好。 

试验例2：猪肚菇低温型杂交菌株的选育 

在上一节获得低温型单核菌株的基础上，两组单核菌株之间进行 杂交，选育出低温型杂交菌株，并对杂交菌株进行鉴定和温度特性分析。 

2.1材料与方法 

2.1.1材料 

供试菌株：供试的7个猪肚菇国内栽培菌株见表1，供试的2组15个猪肚菇的单核菌株来自上一节筛选得到的单核菌株，单核菌株保存在PDA试管斜面上。 

PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。 

麦芽汁培养基：每升麦芽汁（手持糖量计测折光5.0）中加入琼脂15g，pH自然。 

2.1.2方法 

2.1.2.1杂交配对 

将供试的2组单核菌株两组之间相互配对，两单核菌株分别挑取一小块单核菌株的菌丝体，接入PDA平板上，相距1-2cm，然后放置于25℃恒温培养，待两菌块的菌丝生长至互相交接时，于交接处挑取一块大的菌丝体进行显微观察，出现锁状联合的说明可以杂交。将杂交成功的菌丝体转接到试管斜面上培养备用。 

2.1.2.2拮抗试验 

将杂交菌株与亲本单核菌株的母本菌株分别两两配对，接种在同一PDA平板上。两者相距0.5cm，培养观察交接区的反应，看是否产生拮抗。 

2.1.2.3杂交菌株在不同温度下的菌丝生长速度试验 

将杂交菌株分别接种到PDA平板培养基的中央，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养，每个菌株三次重复。采用十字画线法，从接种第二天菌丝生长尖端为起点，精确测量菌落直径，观察记录其生长势并按照下列公式计算菌丝生长速度。以收集的7个猪肚菇栽培菌株为对照。 

菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d） 

2.1.2.4杂交菌株不同温度下的子实体结实试验 

将杂交菌株接种于装有麦芽汁培养基的三角瓶中，置于25℃下恒温培养菌丝，待菌株长满培养基后，再分别置于15℃、18℃、20℃、22℃、25℃温度的培养箱中，自然光照射，观察子实体形成的情况。以收集的7个猪肚菇栽培菌株为对照。 

2.2结果与分析 

2.2.1杂交菌株的检出 

将I组中选出的1号、2号、4号、15号、25号、47号、57号、58号、60号和64号等10株单核菌株与从II组中选出的2号、5号、19号、42号和72号等5株单核菌株相互之间进行两两杂交，通过显微镜检最终获得8个杂交菌株。将8个杂交菌株转接到试管斜面上培养，观察发现其中有三个菌株菌丝长势旺盛，分别为I组的2号×II组的42号（编号P6）、I组的2号×II组的72号（编号P10）和I组的4号×II组的5号（编号P24），初步筛选这三个菌株为选育的杂交菌株。 

2.2.2拮抗反应 

三个杂交菌株与供试母本菌株（MY、LS）相互之间拮抗反应如图 3。从图中可以看出各试验菌株之间相互皆产生拮抗，各菌株的菌丝长势也有所差别。拮抗反应初步说明三个杂交菌株各自不同，并与其母本菌株存在一定差异。 

2.2.3杂交菌株的分子鉴定 

在拮抗试验的基础上，通过分子标记技术对杂交菌株在分子水平上进行进一步的鉴定。总DNA提取主要采用改进的CTAB法，PCR扩增反应产物送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。系统发育分析用贝叶斯分析。 

基于ITS序列的贝叶斯分析得到的猪肚菇不同菌株的系统树见图4。 

从猪肚菇种间的系统发育树上可以看出，3个杂交菌株P6、P10和P24与母本菌株以及其他菌株存在一定遗传差异，从分子水平上证明3个杂交菌株为试验得到的新菌株。 

2.2.4不同温度下的菌丝生长速度 

试验菌株在不同温度下的菌丝生长速度见图5和图6。 

试验结果表明温度对杂交菌株和其他栽培菌株菌丝的生长有明显的影响。从图5看出3个杂交菌株在15℃-35℃均可以生长，最适生长温度为25℃，15℃时的菌丝生长速度好于35℃。从图6可以收集的其他7个栽培菌株也在15℃-35℃均可以生长，其中LS、XY1、XY3、CX和ZZ等5个菌株的最适生长速度为30℃，MY和HZ菌株最适生长速度为25℃，但是MY菌株在25℃和30℃时菌丝生长速度相差不大，且35℃时的菌丝生长速度明显好于15℃时；HZ菌株在15℃时菌丝生长速度快于35℃时。通过比较不同温度下各菌株的菌丝 生长速度，可以得出杂交菌株的温度特性和HZ菌株相一致，低于其他菌株的适宜生长温度。 

2.2.5不同温度下的子实体形成比较 

在不同温度条件下，各供试菌株在麦芽汁培养基上子实体形成温度特性不同。 

表2不同温度下子实体结实情况 

注：“+”形成子实体；“-”不形成子实体。 

“+”forming fruiting body;“-”cannot forming fruiting body. 

据报道，猪肚菇的子实体发育温度为23℃-35℃。从表2可以看出，除HZ菌株外，收集的其他栽培菌株一般需要在22℃以上才能形成子实体。选育的3个杂交菌株形成子实体温度低于收集的栽培菌株，3个杂交菌株在20℃都能形成子实体，其中P10和P24菌株在18℃就可以形成子实体，由此可以看出选育的3个杂交菌株的出菇温度特性较低，明显低于国内普通的栽培菌株。 

其中在18℃条件下，P10和P24菌株在麦芽汁培养基上形成子实体的情况见图7，从图7可以看出麦芽汁培养基适合猪肚菇子实体形 成，子实体生长状况良好。 

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 

Claims (5)

1.一种猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、筛选在20℃下出菇的猪肚菇子实体分离单孢子；

步骤二、采用低温驯化猪肚菇单核菌株，选出在较低温度下生长快的单核菌株；

步骤三、通过杂交育种，选育出低温型杂交菌株；

步骤四、通过拮抗试验和分子标记技术对选育杂交菌株进行鉴定。

2.如权利要求1所述的猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，所述步骤一的详细步骤为：

1）子实体培养：选取棉籽壳83%，麸皮15%，石灰2%，含水量63%作为栽培培养基，将培养基按照配方拌料、装袋，灭菌、接种和培养，菌丝满袋后移入塑料菇棚采用袋内覆土出菇，覆土厚度3－4cm，菇棚每天定时通风，喷水保湿，常规方法进行出菇管理；

2）分离单孢子实体的获得：每天观察菇棚温度的变化，当温度较低时观察不同菌株的子实体生长情况，在菇棚温度20℃时选取仍然发生的子实体，采下子实体用于分离单孢；

3）单孢子分离：采用常规稀释法分离单孢，在收集有孢子的玻璃瓶中加入灭菌的玻璃珠数十粒，加入无菌水剧烈振荡稀释孢子液；同时用血球计数板计数，选取PDA培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；采用梯度稀释涂布100μl孢子浓度10³个/mL的孢子液到PDA平板上；试验时为防止细菌污染在培养基中添加500mg/L卡那霉素。

3.如权利要求1所述的猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，所述步骤二的详细步骤为：

1）低温驯化处理：将涂有孢子的平板置于25℃恒温培养，定期观察孢子萌发情况，当孢子萌发出现肉眼可见的微小白点时，置于4℃冰箱低温驯化45d，然后在无菌条件下将低温驯化处理的单孢挑取至PDA平板上，置于20℃恒温培养；

2）单核菌株的鉴定：当单孢在平板上长至菌落1cm大小时，挑取菌丝于载玻片上显微镜检，观察显微下菌丝形态，挑选无锁状联合的为单核菌丝体；分别编号；

3）单核菌株在不同温度下的菌丝生长速度试验

将单核菌株分别接种到PDA平板培养基的中央，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养，每个菌株三次重复；采用十字画线法，从接种第二天菌丝生长尖端为起点，精确测量菌落直径，观察记录其生长势并按照下列公式计算菌丝生长速度：

菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d）；

4）选择在25℃生长最好且在15-25℃之间生长较好的单核菌株作为选育低温型菌株的亲本单核菌株。

4.如权利要求1所述的猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，所述步骤三的详细步骤为：选取两亲本单核菌株的菌丝体接入PDA平板上，相距1-2cm，然后放置于25℃恒温培养，待两菌块的菌丝生长至互相交接时，于交接处挑取一块大的菌丝体进行显微观察，出现锁状联合的说明可以杂交，将杂交成功的菌丝体转接到试管斜面上培养备用，后将杂交菌株分别接种到PDA平板培养基的中央，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养，每个菌株三次重复，采用十字画线法，从接种第二天菌丝生长尖端为起点，精确测量菌落直径，观察记录其生长势并按照下列公式计算菌丝生长速度，

菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d），

以选取的亲本猪肚菇栽培菌株为对照，选取子实体形成温度低于常规菌株的杂交菌株，并记录温度。

5.如权利要求1所述的猪肚菇低温型菌种选育方法，其特征在于，所述步骤四杂交菌株鉴定中，子实体培养基采用麦芽汁培养基。

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