CN114642169B - 一种从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株的方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株的方法和用途，所述方法包括如下步骤：1)筛选无锁状联合和不出菇的单核菌株，由若干所述单核菌株组成群；2)将所述单核菌株两两配对配制成多个杂交组，将单个所述杂交组接种于培养料中，在黑暗条件下进行菌丝培养；3)菌丝成熟后，在光照条件下进行出菇培养，得到子实体；出菇培养期间观察出菇情况，测定所述子实体的腺苷含量；4)根据出菇情况和腺苷含量测定结果，筛选能出菇和腺苷含量高的杂交组，得到所述高腺苷含量的杂交菌株。本发明的单孢杂交育种方法便于操作，缩短了杂交流程，得到的杂交菌株在栽培袋内生长满袋的时间短，出菇时间短，转换率高，且腺苷含量高。

Description

一种从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株的方法 和用途

技术领域

本发明属于菌类栽培技术领域，具体涉及一种从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株的方法和用途。

背景技术

紫灵芝(Ganoderma sinense J.D.Zhao,L.W.Hsu&X.Q.Zhang)，隶属于Ganoderma灵芝属、Polyporaceae多孔菌科、Polyporales多孔菌目、Agaricomycetes伞菌纲、Basidiomycota担子菌门、Fungi真菌界。紫灵芝为我国特有种，子实体1年生，有柄，木栓质至木质；菌盖半圆形或近似匙形，宽2.5～9cm，厚0.4～1.2cm，表面紫黑色至近黑色，或紫褐色，有似漆样光泽，有明显或不明显的同心环沟和纵纹；边缘薄或钝，近截形，较盖面色淡或淡黄褐色；菌肉褐色至深褐色，厚1～3mm；菌管长0.3～lcm，污白色；管口污白色至深褐色。经济价值及栽培状况紫芝为著名药用菌，《神农本草经》早有记载，《圣济总录》和《御药院方》中有“紫芝丸”和“紫芝丹”。性温，味淡。能补中强智，宁心益胃。可用于治疗神经衰弱、失眠、胃痛、消化不良、口疮，并可解毒覃中毒。

研究证明，灵芝中的核苷类化合物能抑制血小板的过度聚集，降低血液的粘度，从而改善人体血液循环，对年老血稠或有瘀血倾向者具有良好的抗血凝效果，能防止血栓病如脑血栓、心肌梗塞等的发生。

本发明主要是筛选并选育高腺苷含量的紫灵芝，从而利用这些优良品种的产高腺苷的优点，为更多的人带来健康。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株的方法和用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的目的在于保护，一种从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株的方法，包括如下步骤：

1)筛选无锁状联合和不出菇的单核菌株，由若干所述单核菌株组成群；

2)将所述单核菌株两两配对配制成多个杂交组，将单个所述杂交组接种于培养料中，在黑暗条件下进行菌丝培养；

3)菌丝成熟后，在光照条件下进行出菇培养，得到子实体；出菇培养期间观察出菇情况，测定所述子实体的腺苷含量；

4)根据出菇情况和腺苷含量测定结果，筛选能出菇和腺苷含量高的杂交组，得到所述的杂交菌株。

优选地，步骤1)中，所述单核菌株的筛选方法为：

1-1)孢子采集；

1-2)孢子稀释；将孢子和水混合，进行梯度稀释，得到孢子液；

1-3)孢子分离：将所述孢子液涂布于培养基上进行萌发，得到单菌落，挑取单菌落进行培养；

1-4)孢子鉴定：培养后通过镜检，筛选无锁状联合的菌株；将所述无锁状联合的菌株继续培养，筛选出不出菇的菌株；筛选出所述单核菌丝。

更优选地，步骤1-2)中，所述孢子液的浓度为1×10⁵～1×10⁶个/mL。

更优选地，步骤1-4)中，所述镜检的方法为：当单菌落在平板上长至菌落1cm大小时，挑取菌丝于载玻片上进行显微镜镜检，观察菌丝形态，挑选无锁状联合的菌株。

优选地，步骤2)中，所述培养料包括干料，所述干料包括以下重量份的原料组分：

更优选地，所述促进剂选自茶梗、茶渣和甘蔗渣中的一种或多种。

本发明经研究发现，在传统灵芝培养基配方(如麸皮、木屑、玉米粉、石膏和石灰)的基础上，添加促进剂能促进灵芝中腺苷含量的提高。

更优选地，所述干料中促进剂的重量份可以为10～25份，也可以为20～35份，也可以为30～40份。在某个优选的实施方式中，为30份、28份。

更优选地，所述干料中木屑的重量份可以为30～41份，也可以为38～42份，也可以为41～50份。在某个优选的实施方式中，为45份。

更优选地，所述干料中麸皮的重量份可以为15～22份，也可以为17～24份，也可以为23～30份。在某个优选的实施方式中，为20份。

更优选地，所述干料中玉米粉的重量份可以为玉米粉0.5～5.5份，也可以为5.2～8.6份，也可以为7.8～9份。在某个优选的实施方式中，为3份、5份。

更优选地，所述干料中石膏的重量份可以为0.1～0.6份，也可以为0.5～0.8份，也可以为0.7～1.2份。在某个优选的实施方式中，为1份。

更优选地，所述干料中蔗糖的重量份可以为0.2～0.6份，也可以为0.4～1.1份，也可以为1.0～1.5份。在某个优选的实施方式中，为1份。

更优选地，所述干料还包括功能性缓释颗粒；所述功能性缓释颗粒由牡蛎提取液和蚯蚓粪组成。

进一步选地，以干料总质量为基准计，所述功能性缓释颗粒的质量百分比为1～5％。

较佳地，所述功能性缓释颗粒的质量百分比可以为1～2.8％，也可以为2.2～3.8％，也可以为3.7～5％。在某个优选实施方式中，为2.8％。

进一步选地，所述蚯蚓粪与牡蛎提取液的料液比为(6～11)g/mL。

较佳地，所述功能性缓释颗粒的制备方法为：牡蛎提取液和蚯蚓粪混合，干燥后制成颗粒，然后对颗粒热处理，得到。

较佳地，所述热处理为以5～10℃/min的升温速率升温至150～180℃，保持50～70min。采用本发明上述特定的热处理条件，形成较为稳定的功能性缓释颗粒，发挥高效的保水、保肥功效。

本发明中牡蛎提取液可以通过市售渠道获得，也可以通过现有技术获得。本发明中将牡蛎去壳洗净，用超声波处理，经高速离心提取上清液，得到牡蛎提取液，其中离心速度为10000～15000r/min，离心时间5～20min。

本发明的牡蛎提取液中含有大量的氨基酸，能够满足灵芝对于养分的需求，同时，牡蛎提取物中含有大量的锌元素，而锌元素能促进灵芝中腺苷的积累，此外，上述的牡蛎提取物需要采用缓释的方式进行长期有效的释放。而蚯蚓粪具有很多孔隙结构、通气好、排水好和保水性好，同时，蚯蚓粪本身营养成分丰富，其所含的营养成分及微量元素等非常适合灵芝。牡蛎提取与蚯蚓粪的微孔结构互相配合，相辅相成，共同构成了本发明功能性缓释颗粒。

优选地，所述培养料还包括水，所述干料与水的重量份之比为(30～50)：60。

更优选地，所述干料与水的重量份之比可以为(30～42)：60，也可以为(38～46)：60，也可以为(45～50)：60。在某个优选的实施方式中，为40:60。

优选地，步骤2)中，所述菌丝培养的温度为20～37℃。

更优选地，所述菌丝培养的温度可以为20～25℃，也可以为23～32℃，也可以为31～37℃。在某个优选的实施方式中，为25℃。

优选地，步骤2)中，所述菌丝培养的湿度为30～50％。

更优选地，所述菌丝培养的湿度可以为30～38％，也可以为35～45％，也可以为44～50％。在某个优选的实施方式中，为40％。

优选地，步骤2)中，所述培养料装设于栽培袋中。

更优选地，所述栽培袋的尺寸为(3～7)cm×(16～20)cm×(30～40)cm。

更优选地，所述栽培袋的尺寸为5cm×18cm×35cm。

更优选地，所述栽培袋的材质为聚丙烯。

优选地，步骤3)中，所述光照的强度为2000～4000Lux。所述光照为自然光。

更优选地，所述光照的强度可以为2000～3100Lux，也可以为2500～3600Lux，也可以为3500～4000Lux。在某个优选的实施方式中，为3600Lux。

优选地，步骤3)中，所述出菇培养期间包括催蕾期和育菇期。

更优选地，所述催蕾期的温度为20～33℃。

进一步优选地，所述催蕾期的温度可以为20～28℃，也可以为25～31℃，也可以为27～33℃。在某个优选的实施方式中，为28℃。

更优选地，所述催蕾期的湿度为40～70％。

进一步优选地，所述催蕾期的湿度可以为40～56％，也可以为50～67％，也可以为52～70％。在某个优选的实施方式中，为55％。

更优选地，所述催蕾期的时间为15～25d。

进一步优选地，所述催蕾期的时间可以为15～20d，也可以为19～24d，也可以为20～25d。在某个优选的实施方式中，为20d。

更优选地，所述育菇期的温度为20～33℃。

进一步优选地，所述育菇期的温度可以为20～28℃，也可以为25～31℃，也可以为27～33℃。在某个优选的实施方式中，为28℃。

更优选地，所述育菇期的湿度为75～95％。

进一步优选地，所述育菇期的湿度可以为75～86％，也可以为85～90％，也可以为89～95％。在某个优选的实施方式中，为85％。

更优选地，所述育菇期的时间为10～20d。

进一步优选地，所述育菇期的时间可以为10～15d，也可以为14～18d，也可以为17～20d。在某个优选的实施方式中，为18d。

更优选地，育菇期，每天向喷水2～4次。

本发明的目的之二在于提供，一种高腺苷含量的杂交菌株，其由上文所述的方法得到。

本发明的目的之三在于提供，上文所述的高腺苷含量的杂交菌株在紫灵芝选育中的用途。

本发明的目的之四在于提供，一种高腺苷含量的灵芝的选育方法，在培养料中接种如上文所述的高腺苷含量的杂交菌株，培养，得到所述高腺苷含量的灵芝。

优选地，所述培养料包括干料，所述干料包括以下重量份的原料组分：

更优选地，所述促进剂选自茶梗、茶渣和甘蔗渣中的一种或多种。

更优选地，所述干料中促进剂的重量份可以为10～25份，也可以为20～35份，也可以为30～40份。在某个优选的实施方式中，为30份、28份。

更优选地，所述干料中木屑的重量份可以为30～41份，也可以为38～42份，也可以为41～50份。在某个优选的实施方式中，为45份。

更优选地，所述干料中麸皮的重量份可以为15～22份，也可以为17～24份，也可以为23～30份。在某个优选的实施方式中，为20份。

更优选地，所述干料中玉米粉的重量份可以为玉米粉0.5～5.5份，也可以为5.2～8.6份，也可以为7.8～9份。在某个优选的实施方式中，为3份、5份。

更优选地，所述干料中石膏的重量份可以为0.1～0.6份，也可以为0.5～0.8份，也可以为0.7～1.2份。在某个优选的实施方式中，为1份。

更优选地，所述干料中蔗糖的重量份可以为0.2～0.6份，也可以为0.4～1.1份，也可以为1.0～1.5份。在某个优选的实施方式中，为1份。

更优选地，所述干料还包括功能性缓释颗粒；所述功能性缓释颗粒由牡蛎提取液和蚯蚓粪组成。

进一步选地，以干料总质量为基准计，所述功能性缓释颗粒的质量百分比为1～5％。

较佳地，所述功能性缓释颗粒的质量百分比可以为1～2.8％，也可以为2.2～3.8％，也可以为3.7～5％。在某个优选实施方式中，为2.8％。

进一步选地，所述蚯蚓粪与牡蛎提取液的料液比为(6～11)g/mL。

较佳地，所述功能性缓释颗粒的制备方法为：牡蛎提取液和蚯蚓粪混合，干燥后制成颗粒，然后对颗粒热处理，得到。

较佳地，所述热处理为以5～10℃/min的升温速率升温至150～180℃，保持50～70min。采用本发明上述特定的热处理条件，形成较为稳定的功能性缓释颗粒，发挥高效的保水、保肥功效。

优选地，所述培养料还包括水，所述干料与水的重量份之比为(30～50)：60。

更优选地，所述干料与水的重量份之比可以为(30～42)：60，也可以为(38～46)：60，也可以为(45～50)：60。在某个优选的实施方式中，为40:60。

本发明的目的之五在于提供，一种高腺苷含量的灵芝，其由如上文所述的选育方法得到。

本发明的目的之六在于提供，如上文所述的高腺苷含量的灵芝作为原料在化妆品中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明通过先镜检筛选出无锁状联合的菌株，再将无锁状联合的菌株经过出菇试验筛选出不出菇的菌株，从而更好的确保分离出的菌株为单核菌株。

2)本发明的单孢杂交育种在栽培袋中进行，相比与传统的平板杂交，本发明的杂交育种方法便于操作，且能缩短了杂交流程。

3)本发明人在传统配方的基础上，经过长期研究发现促进剂如茶梗、茶渣和甘蔗渣与玉米粉和蔗糖联合使用，在不使用棉籽壳的情况下同时降低木屑的添加量不仅能促进灵芝的生长，同时还能显著促进灵芝中腺苷含量的提高；进一步，添加功能性缓释颗粒后，不仅实现了培养料中各营养物质的缓慢释放，而且还促进了灵芝中腺苷的积累，提高了灵芝中腺苷含量的提高。

4)本发明的杂交菌株，菌盖为半圆型，紫色、菌盖厚实、菌肉致密；接种后与常规菌株相比，菌丝粗壮、吃料快、生长速度快，满袋时间能缩短5天以上，出菇时间缩短5天以上，且转换率高，腺苷含量高。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规及相关领域的常规技术。

高效液相色谱的测定紫灵芝中腺苷含量的方法，参考文献(来李娟，邓祖磊，葛德洲等.HPLC法测定不同产地灵芝中腺苷的含量[J].,海峡药学,2017(8):54-56)。

实施例1

本实施例中，从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株，培养获得子实体。包括如下：

(一)筛选高腺苷含量的灵芝单核菌株

1-1)收集紫灵芝孢子。

1-2)1mL的离心管装水2/3后，然后与121℃灭菌30min；无菌条件下，将步骤1-1)中的紫灵芝孢子与水混合形成孢子悬液，从第一个离心管吸取1/3的孢子悬液于下一个离心管，摇匀后依次稀释5-6次。

1-3)将第6次稀释的孢子悬液，浓度为1×10⁶个/mL，吸取100μL在PDA平板，使用涂棒涂匀后吹干水分，封口于培养箱内于湿度为85％和温度为25℃培养。

1-4)每天解剖镜下观察萌发状况，萌发后将单菌落挑至新的PDA平板，在培养箱培养并编号。

1-5)培养7d后，于显微镜观察，无锁状联合的菌株保留；将保留的菌株制作出菇包接种，不出菇的即为最终确定的单核菌株。

最终筛选出编号为1、2和3的单核菌株。

(二)紫灵芝单核菌株进行杂交

培养料A由重量份比为40:60的干料和水组成，其中干料的配方为：茶梗30份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉3份、石膏1份和蔗糖1份。

采用培养料A进行灵芝单孢杂交育种，包括如下步骤：

2-1)将培养料A装入规格为5×18×35的栽培袋内，在栽培袋的中间插入打孔棒，用套环将栽培袋封口。

2-2)将步骤2-1)中的装有培养料A后的栽培袋于121℃高压蒸汽灭菌120min，冷却。

2-3)拔出打孔棒，以形成中孔；待培养袋内的培养料的温度降至25℃，将步骤(一)中筛选的单核菌株两两配对配制成多个杂交组，在黑暗条件下于温度为25℃和湿度为30％的条件下进行菌丝培养，直至菌丝长满。对两两配对形成杂交组进行编号，编号为1-2、1-3和2-3。

2-4)菌丝成熟后，打开栽培袋，进行出菇培养，出菇培养期间分为催蕾期和育菇期。催蕾期，光照为2500Lux、湿度为80％和温度为28℃催蕾，同时保持适量的通风，20d长成高为3cm的幼菇；育菇期，加强通风，每天可向菇面喷雾状水2-4次，温度为28℃、湿度为85％和光照为3000Lux，形成子实体。

出菇培养期间，统计每一个栽培袋的满袋时间、转化率、出菇时间；测定子实体中腺苷含量。结果见表1。

平均转化率＝出菇鲜菇重量/培养料干料重量×100％

经试验发现：编号为1-2和编号为1-3的杂交菌株，经出菇培养后能形成子实体，子实体的腺苷含量高。杂交菌株的菌盖为半圆型，紫色、菌盖厚实、菌肉致密；其满袋时间和出菇时间都快，转换率高，表明杂交成功，因此作为分离菌株待使用；而编号为2-3的未形成子实体，杂交失败。

(三)高腺苷含量的灵芝的选育

培养料B由重量份比为40:60的干料和水组成，其中干料的配方为：茶梗30份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉3份、石膏1份和蔗糖1份。

采用培养料B进行高腺苷含量的灵芝的选育，包括如下步骤：

3-1)将培养料B装入规格为5×18×35的栽培袋内，在栽培袋的中间插入打孔棒，用套环将栽培袋封口。

3-2)将步骤3-1)中的装有培养料B后的栽培袋于121℃高压蒸汽灭菌120min，冷却。

3-3)拔出打孔棒，以形成中孔；待培养袋内的培养料的温度降至25℃，在中孔内分别接种编号为1-2和1-3的杂交菌种，在黑暗条件下于温度为25℃和湿度为30％的条件下进行菌丝培养，直至菌丝长满。每个杂交菌种设置10个重复。

3-4)菌丝成熟后，打开栽培袋，进行出菇培养，出菇培养期间分为催蕾期和育菇期。催蕾期，光照为2500Lux、湿度为80％和温度为28℃，同时保持适量的通风，20d长成高为3cm的幼菇；育菇期，加强通风，每天可向菇面喷雾状水2-4次，温度为28℃、湿度为85％和光照为3000Lux，形成子实体。

测定子实体中腺苷含量，结果见表2。

实施例2

本实施例中，从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株，培养获得子实体。包括如下：

(一)筛选高腺苷含量的灵芝单核菌株

1-1)收集紫灵芝孢子。

1-2)1mL的离心管装水2/3后，然后与121℃灭菌30min；无菌条件下，将步骤1-1)中的紫灵芝孢子与水混合形成孢子悬液，从第一个离心管吸取1/3的孢子悬液于下一个离心管，摇匀后依次稀释5-6次。

1-3)将第5次稀释的孢子悬液，浓度为1×10⁵个/mL，吸取100μL在PDA平板，使用涂棒涂匀后吹干水分，封口于培养箱内湿度为85％和温度为25℃培养。

1-4)每天解剖镜下观察萌发状况，萌发后将单菌落挑至新的PDA平板，在培养箱培养并编号。

1-5)培养7d后，于显微镜观察，无锁状联合的菌株保留；将保留的菌株制作出菇包接种，不出菇的即为最终确定的单核菌株。

最终筛选出编号为5、6、7和8的单核菌株。

(二)紫灵芝单核菌株进行杂交

培养料A由重量份比为40:60的干料和水组成，其中干料的配方为：甘蔗渣30份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉3份、石膏1份、蔗糖1份。

采用培养料A进行灵芝单孢杂交育种，包括如下步骤：

2-1)将培养料A装入规格为5×18×35的栽培袋内，在栽培袋的中间插入打孔棒，用套环将栽培袋封口。

2-2)将步骤2-1)中的装有培养料A后的栽培袋于121℃高压蒸汽灭菌120min，冷却。

2-3)拔出打孔棒，以形成中孔；待培养袋内的培养料的温度降至25℃，将本实施例步骤(一)中筛选的单核菌株两两配对配制成多个杂交组，在黑暗条件下于温度为25℃和湿度为30％的条件下进行菌丝培养，直至菌丝长满。对两两配对形成杂交组进行编号，编号为5-6、5-7、5-8、6-7、6-8和7-8。

2-4)菌丝成熟后，打开栽培袋，进行出菇培养，出菇培养期间分为催蕾期和育菇期。催蕾期，光照为2000Lux、湿度为95％和温度为33℃，同时保持适量的通风，20d长成高为3cm的幼菇；育菇期，加强通风，每天可向菇面喷雾状水2-4次，温度为20℃、湿度为95％和光照为2500Lux，形成子实体。

出菇培养期间，统计每一个栽培袋的满袋时间、转化率、出菇时间；测定子实体中腺苷含量。结果见表1。

平均转化率＝出菇鲜菇重量/培养料干料重量×100％

经试验发现：编号为5-6、5-8、6-7、6-8、7-8的杂交菌株，经催蕾培养后能形成子实体，子实体的腺苷含量高。杂交菌株的菌盖为半圆型，紫色、菌盖厚实、菌肉致密；其满袋时间和出菇时间都快，转换率高，表明杂交成功，因此作为分离菌株待使用。而编号为5-7的未形成子实体且腺苷含量低，杂交失败。

(三)高腺苷含量的灵芝的选育

培养料B由重量份比为40:60的干料和水组成，其中干料的配方为：甘蔗渣30份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉3份、石膏1份、蔗糖1份。

采用培养料B进行高腺苷含量的灵芝的选育，包括如下步骤：

3-1)将培养料B装入规格为5×18×35的栽培袋内，在栽培袋的中间插入打孔棒，用套环将栽培袋封口。

3-2)将步骤3-1)中的装有培养料B后的栽培袋于121℃高压蒸汽灭菌120min，冷却。

3-3)拔出打孔棒，以形成中孔；待培养袋内的培养料的温度降至25℃，在中孔内分别接种编号为5-6、5-8、6-7、6-8、7-8的杂交菌种，在黑暗条件下于温度为22℃和湿度为50％的条件下进行菌丝培养，直至菌丝长满。每个杂交菌种设置10个重复。

3-4)菌丝成熟后，打开栽培袋，进行出菇培养，出菇培养期间分为催蕾期和育菇期。催蕾期，光照为2000Lux、湿度为95％和温度为33℃，同时保持适量的通风，20d长成高为3cm的幼菇；育菇期，加强通风，每天可向菇面喷雾状水2-4次，温度为20℃、湿度为95％和光照为3500Lux，形成子实体。

测定子实体中腺苷含量，结果见表2。

实施例3

本实施例中，从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株，培养获得子实体。包括如下：

(一)筛选高腺苷含量的灵芝单核菌株

1-1)收集腺苷含量高的紫灵芝孢子。

1-2)1mL的离心管装水2/3后，然后与121℃灭菌30min；无菌条件下，将步骤1-1)中的紫灵芝孢子与水混合形成孢子悬液，从第一个离心管吸取1/3的孢子悬液于下一个离心管，摇匀后依次稀释5-6次。

1-3)将第6次稀释的孢子悬液，浓度为1×10⁶个/mL，吸取100μL在PDA平板，使用涂棒涂匀后吹干水分，封口于培养箱内于湿度为85％和温度为25℃培养。

1-4)每天解剖镜下观察萌发状况，萌发后将单菌落挑至新的PDA平板，在培养箱培养并编号。

1-5)培养7d后，于显微镜观察，无锁状联合的菌株保留；将保留的菌株制作出菇包接种，不出菇的即为最终确定的单核菌株。

最终筛选出编号为1、2和3的单核菌株。

(二)紫灵芝单核菌株进行杂交

培养料A由重量份比为40:60的干料和水组成，其中干料的配方为：茶渣28份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉5份、石膏1份、蔗糖1份。

采用培养料A进行灵芝单孢杂交育种，包括如下步骤：

2-1)将培养料A装入规格为5×18×35的栽培袋内，在栽培袋的中间插入打孔棒，用套环将栽培袋封口。

2-2)将步骤2-1)中的装有培养料A后的栽培袋于121℃高压蒸汽灭菌120min，冷却。

2-3)拔出打孔棒，以形成中孔；待培养袋内的培养料的温度降至25℃，将步骤(一)中筛选的单核菌丝两两配对配制成多个杂交组，在黑暗条件下于温度为25℃和湿度为30％的条件下进行菌丝培养，直至菌丝长满。对两两配对形成杂交组进行编号，编号为1-2、1-3和2-3。

2-4)菌丝成熟后，打开栽培袋，进行出菇培养，出菇培养期间分为催蕾期和育菇期。催蕾期，光照为3000Lux、湿度为85％和温度为20℃，同时保持适量的通风，20d长成高为3cm的幼菇；育菇期，加强通风，每天可向菇面喷雾状水2-4次，温度为33℃、湿度为85％和光照为4000Lux，形成子实体。

出菇培养期间，统计每一个栽培袋的满袋时间、转化率、出菇时间；测定子实体中腺苷含量。结果见表1。

平均转化率＝出菇鲜菇重量/培养料干料重量×100％

经试验发现：编号为1-2和编号为1-3的杂交菌株，经催蕾培养后能形成子实体，吃料速度快、转换率高且腺苷含量高，表明杂交成功，因此作为分离菌株待使用；而编号为2-3的未形成子实体且腺苷含量低，杂交失败。

(三)高腺苷含量的灵芝的选育

培养料B由重量份比为40:60的干料和水组成，其中干料的配方为：茶渣28份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉5份、石膏1份、蔗糖1份。

采用培养料B进行高腺苷含量的灵芝的选育，包括如下步骤：

3-1)将培养料B装入规格为5×18×35的栽培袋内，在栽培袋的中间插入打孔棒，用套环将栽培袋封口。

3-2)将步骤3-1)中的装有培养料B后的栽培袋于121℃高压蒸汽灭菌120min，冷却。

3-3)拔出打孔棒，以形成中孔；待培养袋内的培养料的温度降至25℃，在中孔内分别接种编号为1-2和1-3的杂交菌种，在黑暗条件下于温度为25℃和湿度为30％的条件下进行菌丝培养，直至菌丝长满。每个杂交菌种设置10个重复。

3-4)菌丝成熟后，打开栽培袋，进行出菇培养，出菇培养期间分为催蕾期和育菇期。催蕾期，光照为2500Lux、湿度为95％和温度为20℃，同时保持适量的通风，20d长成高为3cm的幼菇；育菇期，加强通风，每天可向菇面喷雾状水2-4次，温度为33℃、湿度为85％和光照为4000Lux，形成子实体。

测定子实体中腺苷含量，结果见表2。

实施例4

同实施例1，不同点在于，培养料B的成分为：茶渣28份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉5份、石膏1份、蔗糖1份；其余均同实施例1。

实施例5

同实施例2，不同点在于，培养料A的成分为：甘蔗渣30份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉3份、石膏1份、蔗糖1份；其余均同实施例2。

实施例6

同实施例3，不同点在于，培养料B的成分为：茶渣28份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉5份、石膏1份、蔗糖1份3；其余均同实施例3。

实施例7

同实施例3，不同点在于，培养料A的成分为：茶梗30份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉3份、石膏1份、蔗糖1份；其余均同实施例3。

实施例8

同实施例1，不同点在于，培养料A的成分为：茶梗29份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉3份、石膏1份、蔗糖1份、功能性缓释颗粒1份；其余均同实施例1。

其中功能性缓释颗粒的制备方法为：按照蚯蚓粪和牡蛎提取液的料液比为7mg/mL混合，干燥后制成颗粒，然后对颗粒热处理，得到功能性缓释颗粒。热处理的为5℃/min的升温速率升温至180℃，保持70min。

实施例9

同实施例1，不同点在于，培养料A的成分为：茶梗27份、木屑45份、麸皮20份、玉米粉3份、石膏1份、蔗糖1份、功能性缓释颗粒3份；其余均同实施例1。

其中功能性缓释颗粒的制备方法为：按照蚯蚓粪和牡蛎提取液的料液比为11mg/mL混合，干燥后制成颗粒，然后对颗粒热处理，得到功能性缓释颗粒。热处理的为9.8℃/min的升温速率升温至155℃，保持51min。

对比例1

同实施例3中的步骤(二)和(三)，不同点在于培养料A和B均采用传统培养料中的干料配方，不含有茶渣、玉米粉和蔗糖。

传统培养料中的干料配方为：木屑60份，棉籽壳30份，麸皮8份，石灰1份，石膏1份。

对比例2

同实施例3中的步骤(二)和(三)，不同点在于培养料A和B的干料配方中均不含有蔗糖。

干料配方为：茶渣28份、木屑46份、麸皮20份、玉米粉5份、石膏1份。

对比例3

同实施例3中的步骤(二)和(三)，不同点在于培养料A和B的干料配方中均不含有玉米粉。

干料配方为：茶渣28份、木屑50份、麸皮20份、石膏1份、蔗糖1份。

对比例4

同实施例3中的步骤(二)和(三)，不同点在于培养料A和B的干料配方中均不含有茶渣。

干料配方为：木屑60份、麸皮30份、棉籽壳3份、玉米粉5份、石膏1份、蔗糖1份。

对比例5

同实施例3中的步骤(二)和(三)，不同点在于培养料A和B的干料配方中均不含有茶渣和蔗糖。

干料配方为：木屑60份、棉籽壳14份、麸皮20份、玉米粉5份、石膏1份。

对比例6

同实施例8中的步骤(二)和(三)，不同点在于未添加功能性缓释颗粒。

表1

从表1可知，采用本发明技术方案如实施例1-4和实施例8和9，杂交菌株的满袋时间能缩短至35天以后，出菇时间缩短至50天以内，平均转化率在35％以上，腺苷含量提高至0.256mg/g以上。本发明通过镜检筛选出无锁状联合的单孢菌株，继续培养不出菇的菌株，即为杂交菌株，本发明的二次筛选方法从而更好的确保分离出的菌株为单核菌株；相比与传统的平板杂交，本发明的杂交育种方法便于操作，且能缩短杂交流程，杂交菌株在栽培袋内生长满袋的时间缩短了5天，出菇时间提前了5d；筛选出高腺苷含量的杂交菌株，菌盖为半圆型，紫色、菌盖厚实、菌肉致密，菌丝粗壮、吃料快、生长速度快。

表2

从表2可知，采用本发明的杂交菌株在本发明培养料中进行培养，得到的灵芝腺苷含量高。本发明茶梗、茶渣和/或蔗糖与玉米粉和蔗糖与其他辅料联合使用，在不使用棉籽壳和低添加木屑还能促进灵芝的生长，同时能显著促进灵芝中腺苷含量的提高；进一步，添加功能性缓释颗粒后，不仅实现了培养料中各营养物质的缓慢释放，而且还促进了灵芝中腺苷的积累，提高了灵芝中腺苷的含量。

所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种从灵芝单孢杂交育种获得高腺苷含量的杂交菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)筛选无锁状联合和不出菇的单核菌株，由若干所述单核菌株组成群；

2)将所述单核菌株两两配对配制成多个杂交组，将单个所述杂交组接种于培养料中，在黑暗条件下进行菌丝培养；

3)菌丝成熟后，在光照条件下进行出菇培养，得到子实体；出菇培养期间观察出菇情况，测定所述子实体的腺苷含量；

4)根据出菇情况和腺苷含量测定结果，筛选能出菇和腺苷含量高的杂交组，得到所述高腺苷含量的杂交菌株；

其特征在于，2)中，所述培养料包括干料，所述干料包括以下重量份的原料组分：

所述促进剂选自茶梗、茶渣和甘蔗渣中的一种或多种；

所述干料还包括功能性缓释颗粒，所述功能性缓释颗粒由牡蛎提取液和蚯蚓粪组成；

其特征在于，2)中，所述培养料装于栽培袋内，使得杂交育种在栽培袋中进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述单核菌株的筛选方法为：

1-1)孢子采集；

1-2)孢子稀释：将孢子和水混合，进行梯度稀释，得到孢子液；

1-3)孢子分离：将所述孢子液涂布于培养基上进行萌发，得到单菌落，挑取单菌落进行转接培养；

1-4)孢子鉴定：转接培养后通过镜检，筛选无锁状联合的菌株；将所述无锁状联合的菌株继续培养，筛选出不出菇的菌株；筛选出所述的单核菌株。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养料还包括水，所述干料和所述水的重量比为(30～50)：60。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，以干料总质量为基准计，所述功能性缓释颗粒的质量百分比为1～5％；

和/或，所述蚯蚓粪与牡蛎提取液的料液比为(6～11)g/mL。

5.一种高腺苷含量的杂交菌株，其特征在于，其由如权利要求1-4任一项所述的方法得到。

6.如权利要求5所述的高腺苷含量的杂交菌株在灵芝选育中的用途。

7.一种高腺苷含量的灵芝的选育方法，其特征在于，在培养料中接种如权利要求6所述的高腺苷含量的杂交菌株培养得到所述高腺苷含量的灵芝。