CN114540205A - 一株蜜环菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株蜜环菌SZ‑1菌株及其应用，属于微生物技术领域。本发明所述蜜环菌SZ‑1的保藏编号为：CGMCC No.23249；本发明提供的蜜环菌菌株在母种培养阶段，菌丝萌发快、生长迅速、长势佳；在栽培种培养阶段，菌索粗壮、分叉少、活力强；在天麻栽培阶段，蜜环菌胞外酶活力高，菌索能够快速侵染菌材，抗杂菌能力强，能够有效降低“空窖”现象。蜜环菌SZ‑1菌株对红乌杂交天麻具有较强的亲和力，能够显著提高天麻产量，且箭麻药用成分含量较高。

Description

一株蜜环菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株蜜环菌菌株SZ-1及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
蜜环菌Armillaria mellea，隶属于担子菌亚门(Basdiomyeotina)伞菌纲(Hymenomyeetes)伞菌目(Agaricales)泡头菌科(Physalacriaceae)蜜环菌属(Armillaria)。其子实体一般中等大小。菌盖直径4-14厘米，淡土黄色至浅黄褐色。菌肉白色。菌褶白色或稍带肉粉色，老后常出现暗褐色斑点。菌柄细长，圆柱形，稍弯曲，同菌盖色，纤维质，内部松软变至空心，基部稍膨大。菌环白色，着生于柄上部，幼时常呈双层，松软，后期带奶油色。
蜜环菌广泛分布于北半球的温带地区，在中国东北、西南及华中较高海拔地区均有分布。秋季在很多种针叶或阔叶树树干基部、根部或倒木上丛生。
蜜环菌是传统名贵中药天麻(Gastrodia elata Bl.)的重要共生菌.天麻是一种没有叶绿素的兰科植物，不能通过光合作用积累营养物质，只能依靠蜜环菌分解菌材等提供营养。研究表明用不同特性的蜜环菌菌种栽培天麻，天麻的产量、质量和品质不同。如王永[1]等以5个野生蜜环菌菌株和天麻栽培过程中常用的蜜环菌A9菌株种植红天麻，通过对菌材侵染情况、红天麻主要农艺性状、产量、有效成分含量进行测定，结果表明：不同蜜环菌栽培种对青冈菌材的侵染情况不同，对红天麻农艺性状、产量及质量的影响也不同。其中蜜环菌MHJ-1菌株满袋时间短、上菌速度快，菌材侵染效果好，能够显著提高红天麻产量。陈明义[2]等研究表明不同蜜环菌菌株对天麻产量具有一定的影响，蜜环菌M1菌株能显著提高天麻产量。刘天睿[3]等选择了4个蜜环菌菌株种植乌天麻，对乌天麻产量、天麻素、对羟基苯甲醇、多糖含量测定，筛选出高品质乌天麻伴栽的优质蜜环菌菌株M1。综上分析，蜜环菌是天麻栽培过程中的关键因子，直接影响天麻产量与品质。
天麻主要变种如下:红天麻又名水红杆天麻，株高1.5-2米，根状茎棒槌形或哑铃型，最重达1千克，含水量达85％，茎橙红色，花浅姜黄色，略带淡绿色，花期4-5月，分布于黄河流域与长江流域。
绿天麻又名青天麻，株高1-1.5米，根状莖椭圆形或倒圆锥形，节较密，最重达0.6千克，含水量达70％，茎淡蓝绿色，花淡蓝绿或白色，较为少见，花期6-7月，分布于中国东北至西南各省。
乌天麻又名铁杆天麻，株高1.5-2米，或者更高，根状茎椭圆形或卵圆型，节较密，最长可达15厘米或更长，最重达0.8千克，含水量达60-70％，茎灰褐色，花蓝绿色，花期6-7月，果实形状不同于其他品种，为棱形或倒楔形，分布于云南东北部至西北部、贵州西部。
黄天麻又名草天麻，株高1米或以上，根状茎长椭卵形，最重达0.5千克，含水量达约80％，幼嫩茎淡黄绿色，成熟茎淡黄色，花淡黄色，花期4-5月，分布于云南东北部、贵州西部、河南、湖北。
松天麻株高约1米，根状茎梭形或圆柱形，含水量达90％以上，茎微黄色，花淡黄或白色，花期4-5月，常见于松栎林下，分布于云南西北部。
在以上几种天麻中，红天麻种子发芽率和产量均高，适应性和耐旱性强；乌天麻块茎繁殖率、种子发芽率和产量均较低，但含水量低，干品质量好；绿天麻品质虽好，但较为稀少。
红乌杂交天麻用红天麻和乌天麻杂交而成，集合了父母系的优点，抗病虫害力强、适种温度广、天麻形态好、产量高、天麻素含量比纯乌天麻高，比纯红天麻高出一倍多，生长周期比纯乌天麻短，是目前湖南雪峰山区人工种植天麻的主要品种。
但雪峰山区红乌杂交天麻栽培中大多采用蜜环菌A9菌株种植，A9菌株已经传代多次，生活力出现明显衰退迹象，如产量低，抗杂菌能力弱。用于天麻栽培，容易出现“空窖”现象。因此，生产上急需一种能替代A9菌株的活力强的蜜环菌菌株。
参考文献：
[1]王永,王彩云,侯俊,等.不同蜜环菌菌株对红天麻农艺性状、产量及质量的影响[J].微生物学杂志,2020,40(06):59-65.
[2]陈明义,李福后,边银丙.蜜环菌不同菌株对天麻产量的影响[J].食用菌学报,2004，11(01):46-48.
[3]刘天睿,王忠巧,陈向东,等.4株蜜环菌菌株鉴定及其对彝良乌天麻产质量的影响[J].中国中药杂志,2019,44(24):5352-5357.
发明内容
本发明的目的是提供一株生活力强、菌索生长速度快、抗杂菌能力强的蜜环菌菌株，以提高天麻栽培效率。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一株蜜环菌菌株SZ-1，该菌株的科学名称为Armillaria mellea，保藏编号为：CGMCC NO.23249；该蜜环菌SZ-1已于2021年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
该菌株在母种培养阶段中，菌丝萌发快、生长迅速、长势旺；在栽培种培养阶段，菌索粗壮、分叉少、性状优良、活力强；在天麻栽培过程中，蜜环菌胞外酶活力高，菌索能够快速侵染菌材，抗杂菌能力强，能够有效降低天麻栽培过程中“空窖”现象。蜜环菌SZ-1菌株对红乌杂交天麻具有较强的亲和力，用该蜜环菌种植天麻，能够显著提高天麻产量，且商品麻的药用成分含量较高，经济效益显著。
优选的，所述蜜环菌菌株在PDA培养基上的菌株特性为：菌丝较少，为白色，菌索初为白色、后转变为黄褐色至红褐色，生长速度快，菌索吐水晚，活力强。
优选的，蜜环菌菌株的DNA的扩增引物为ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)；ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。
本发明还提供上述蜜环菌菌株SZ-1在红乌杂交天麻栽培中的应用。可采用上述蜜环菌菌株SZ-1通过本领域常规方法栽培获得红乌杂交天麻米麻和箭麻。
实验证明，采用蜜环菌菌株SZ-1栽培红乌杂交天麻，既可以提高天麻产量还可以提高品质。
具体地，本发明还提供一种乌天麻的栽培方法，其具体步骤为：
步骤1：选地挖穴：选择海拔800m以上，郁闭度0.6～0.7的林地作为天麻栽培地。在地面除去灌木和杂木，挖出宽0.3-0.8m，长度1-10m的长条形浅沟作为天麻栽培穴。
步骤2：天麻栽培：在栽培穴内，平整铺垫新鲜的阔叶树修枝材作为底材，菌材长度控制在0.25-0.60m，菌材用量为10.0-20.0kg/m2，然后均匀放置天麻种麻和蜜环菌，种麻用量为0.6-1.5kg/m2，蜜环菌木片菌种用量为0.5-1.5kg/m2。接着均匀平铺上新鲜阔叶树修枝材作为盖材，盖材长度控制在0.25-0.60m，菌材用量为10.0-20.0kg/m2。在整个栽培窖的四周撒上一圈生石灰或其它无公害白蚁驱避剂，防止白蚁等虫害，最后在栽培窖上均匀覆盖5-10cm土层保湿。同时在栽培窖周边开凿引水槽，防止积水。
步骤3：日常管理：注意野兔、老鼠等动物破坏栽培窖，发现有动物扰动栽培窖，应及时修补恢复。干旱时补水，雨季要及时排水。
本发明还提供采用蜜环菌菌株SZ-1栽培所得的天麻，优选为红乌杂交天麻。
本发明还提供红乌杂交天麻生药材，是采用上述蜜环菌菌株SZ-1栽培所得的红乌杂交天麻加工而得。可采用本领域常规方法例如药典方法进行加工。具体例如将红乌天麻采挖后，洗净，蒸透，敞开低温干燥。
本发明还提供上述红乌杂交天麻生药材在制备食品、保健食品或药物上的应用。
实验证明本发明的蜜环菌菌株SZ-1的胞外漆酶活力、胞外纤维素酶活力、胞外木聚糖活力、胞外果胶酶活力、胞外淀粉酶活力显著高于其它菌株，显著缩短萌发时间，较快形成菌索，菌丝生长速度较快。从而能有效抑制其他竞争性杂菌繁殖，从而能够显著降低空窖率和污染率，提高天麻产量。
附图说明
图1为实施例1蜜环菌菌株SZ-1的系统发育N-J树。
图2为实施例1蜜环菌菌株SZ-1的菌丝菌索形态图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
菌株的获得、菌种鉴定
1.1菌株分离
菌种分离：将在湖南省桑植县八大公山镇采集到的新鲜、外观完整的蜜环菌子实体作为菌种分离材料。在超净工作台上，用解剖刀切开菌盖，小心挑出蜜环菌组织，接入到PDA平板中。24℃恒温黑暗培养3天后，挑出被污染的平板。选择没有杂菌的平板继续培养5-6天，待组织块周围长出白色菌丝时按无菌操作规程将纯菌株接种到PDA试管斜面培养基上，24℃恒温培养7-10天，选择菌索发育良好，无杂菌污染的试管放入4℃冰箱保藏。
本菌株特性：该蜜环菌菌种在通用PDA培养基上菌丝较少，为白色，菌索初为白色、后转变为黄褐色至红褐色，生长速度快，分支较少，菌索吐水较晚，活力强，如图2所示。
该菌种的培养特征：在PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上培养10天左右长满整个培养皿(培养皿直径90mm)，培养皿表面有浅黄色菌丝，初生菌索为白色，后转变为黄褐色至红褐色，菌索粗壮，分支多，培养后期有黑色素分泌。
1.2菌种鉴定
选取蜜环菌试管菌株，使用北京康为世纪生物科技有限公司生产的植物基因组提取试剂盒(NO.CW0553)提取蜜环菌DNA。
具体提取方法如下：
步骤1：挑取蜜环菌菌丝约100mg到灭菌的研钵中，加入液氮充分研磨；
步骤2：将研磨后的粉末收集到离心管中，加入700μL65℃预热的Buffer GP1，迅速颠倒混匀后，将离心管管置于65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管混匀样品3次。
步骤3：加入700μL氯仿，充分混匀后，13000rpm离心5分钟。小心将上层水相转入一新离心管中，加入700μL Buffer GP2，充分混匀。
步骤4：将所得溶液全部加入Spin Column DM中，13000rpm离心30秒，弃废液。将Spin Column DM放回Collection Tube中。
步骤5：向Spin Column DM中加入入700μL Buffer GW1，13000rpm离心30秒，弃废液。将Spin Column DM放回Collection Tube中。
步骤6：向Spin Column DM中加入500μL Buffer GW2，13000rpm离心30秒，弃废液。将Spin Column DM放回Collection Tube中。
步骤7：重复步骤6后，13000rpm离心2分钟，弃废液。将Spin Column DM置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的Buffer GW2。
步骤8：将Spin Column DM放到新的离心管中，加入100μLBuffer GE，室温放置5分钟，13000rpm离心1分钟，收集到DNA溶液，-20℃保存DNA。
提取后的蜜环菌DNA以真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系
Figure BDA0003532980010000051
Figure BDA0003532980010000061
PCR扩增程序如下：
95℃预热5min；
94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环；
72℃延伸5min；
PCR扩增后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果在NationalCenter for Biotechnology Information网站上进行Blast序列比对(alignment)，结果发现菌株SZ-1序列与NCBI上蜜环菌Armillaria mellea OL411634.1、Armillaria melleaOK161344.1、Armillaria mellea OK161343.1和Armillaria mellea KF032532.1的Querycoverage值为93％、Percent identity值为99.65％。
在NCBI网站上，选取比对后相似性较高的序列用系统发育分析软件MEGA6.0的N-J(Neighbor-joining)方法进行计算和系统发育树构建，结果见附图1。从图1可以看到进化树明显分为2个进化枝，支持率分别为66％和87％。SZ-1菌株与蜜环菌属Armillariasp.MK685107.1和蜜环菌Armillaria mellea OL411635.1,Armillaria melleaKF032532.1,Armillaria mellea FJ664592.1,Armillaria mellea OK161343.1在同一支进化树，遗传距离短，进化关系较近，确定所分离菌株SZ-1为蜜环菌(Armillaria mellea)。
1.3蜜环菌扩大培养：
蜜环菌二级菌种扩繁：按照麦麸30％，碎木屑10％，葡萄糖2％，琼脂2％的比例加水配制成400毫升瓶装蜜环菌固体培养基，pH5.5-6.5。在超净工作台上，将试管种(保藏中心登记入册编号CGMCC No.23249)转接到灭过菌的固体培养基上，24℃恒温黑暗培养，相对湿度控制在70％-80％，培养24-28天后，蜜环菌菌索长满整个培养基，即为蜜环菌二级菌种。
蜜环菌三级菌种生产：基料1：壳斗科碎木屑55％、麦麸30％、石膏10％、蔗糖1％，含水量控制在95％。基料2为浸泡48小时的长度8-10cm、径粗3-5cm的壳斗科修枝条木片。采用14*28cm的聚丙烯菌袋，先在菌袋最底层铺3-5cm厚的基质1，中间层将木片塞满整个菌袋，在最上层再铺3-5cm厚的基质1，经加盖灭菌后，无菌操作接入二级菌种，把接种后的瓶子放进室温23℃-25℃，相对湿度70％-80％的黑暗培养60-70天，蜜环菌菌索长满整个木片，即为蜜环菌三级菌种。生产出的三级菌种可以直接用于红乌杂交天麻栽培。
将以上菌株命名为蜜环菌菌株SZ-1，并于2021年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.23249；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
性能测试
对蜜环菌菌株SZ-1进行培养，对比三个蜜环菌(A9、M6、SZ-1)的性能，实验证明该菌的胞外漆酶活力、胞外纤维素酶活力、胞外木聚糖活力、胞外果胶酶活力、胞外淀粉酶活力显著高于其它菌株，显著缩短萌发时间，较快形成菌索，菌丝生长速度较快。
表1不同蜜环菌菌株胞外酶活力
Figure BDA0003532980010000071
蜜环菌生长速度测定
按照麦麸30％，碎木屑10％，葡萄糖2％，琼脂2％的比例加水配制成400毫升瓶装蜜环菌固体培养基，pH5.5-6.5。选择雪峰山地区天麻栽培过程中常用的蜜环菌菌株A9和M6，蜜环菌菌株SZ-1三个蜜环菌菌株制作蜜环菌二级菌种。在超净工作台上，将三个蜜环菌试管种(A9、M6、SZ-1)转接到灭菌的固体培养基上，24℃恒温黑暗培养，相对湿度控制在70％-80％。观察蜜环菌菌丝萌发时间和生长情况，分别测定7-14、14-21天菌丝的生长速度，计算3个菌株的平均生长速度。
结果如表2所示。
表2三种菌株生长情况
Figure BDA0003532980010000072
蜜环菌SZ-1菌株与现有菌株A9、M6相比，在二级种生产过程种能够显著缩短萌发时间，较快形成菌索，菌丝生长速度较快。
实施例3
红乌杂交天麻栽培试验
选择雪峰山地区天麻栽培过程中常用的蜜环菌菌株A9和M6，蜜环菌菌株SZ-1三个蜜环菌菌株制作蜜环菌三级菌种。基料1：壳斗科碎木屑55％、麦麸30％、石膏10％、蔗糖1％，含水量控制在95％。基料2为浸泡48小时的长度8-10cm、径粗3-5cm的壳斗科修枝条木片。采用14*28cm的聚丙烯菌袋，先在菌袋最底层铺3-5cm厚的基质1，中间层将木片塞满整个菌袋，在最上层再铺3-5cm厚的基质1，经加盖灭菌后，无菌操作接入二级菌种，把接种后的瓶子放进室温23℃-25℃，相对湿度70％-80％的黑暗培养60-70天，蜜环菌菌索长满整个木片，即为蜜环菌三级菌种。三级菌种可以直接用于红乌杂交天麻栽培。
天麻栽培方法：天麻栽培试验地位于湖南省邵阳市绥宁县，海拔800m～900m，土壤为板岩发育的壤质土，植被为常绿落叶阔叶混交林，郁闭度0.6～0.7。栽培穴的大小规格为1.67m×0.30m，总面积0.50m2。每穴天麻菌材单层排列，菌材用量为15.00kg，麻种为红乌杂交天麻，用量为0.40kg，蜜环菌木片菌种用量为0.30kg。每个蜜环菌菌株栽培天麻20穴，随机排列，共60穴。4月上旬播种杂交天麻原种，12月初收获全部天麻，测定空窖率、杂菌污染率、天麻产量、天麻素、对羟基苯甲醇和多糖等指标。
结果如表3所示
表3三种菌株的培养的天麻指标
Figure BDA0003532980010000081
蜜环菌SZ-1菌株与现有菌株A9、M6相比，在天麻栽培过程中，SZ-1菌株菌索生长速度快，菌材侵染率高，能够在栽培窖内迅速形成优势菌群，有效抑制其他竞争性杂菌繁殖，从而能够显著降低空窖率和污染率，提高天麻产量和品质。对采收的天麻参照《中国药典》2020版进行药用成分检测，结果表明，用蜜环菌SZ-1菌株种植的天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、多糖的含量都高于对照组，天麻品质较高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1. 一株蜜环菌菌株，其特征在于，该菌株的保藏编号为：CGMCC NO.23249。
2.根据权利要求1所述的蜜环菌菌株，其特征在于，所述蜜环菌菌株在PDA培养基上的菌株特性为：菌丝较少，为白色，菌索初为白色、后转变为黄褐色至红褐色，生长速度快，菌索吐水晚，活力强。
3.根据权利要求1所述的蜜环菌菌株，其特征在于，蜜环菌菌株的DNA的扩增引物为ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）；
ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。
4.如权利要求1所述的蜜环菌菌株SZ-1在天麻栽培中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述天麻为乌红杂交天麻。
6.一种红乌杂交天麻生药材，其特征在于，采用如权利要求1所述的蜜环菌菌株SZ-1栽培所得的红乌杂交天麻加工而得。
7.如权利要求6所述的红乌杂交天麻生药材在制备食品、保健食品或药物上的应用。
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