CN115786136A - 一种无致病性木霉菌株分离筛选方法和复合木霉菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生防技术领域，具体涉及一种无致病性木霉菌株分离筛选方法和复合木霉菌剂的制备方法。本发明提供了一种从需要防治病害的对象物种的健康植株及其周边分离筛选无致病性木霉菌株，配制复合木霉菌剂用以防治该物种病害的方法，该技术体系中的木霉菌株无须精确鉴定到种，也无须每个种都做对病原的拮抗实验，大大减少了工作量，节约了研究和生产的成本和周期，且复合木霉菌剂菌种来源于该植物物种及其周边，在植株和土壤中能顺利定殖发挥效果，而组成的木霉菌种来源越广、种类越多，其抗病原谱就越宽，对该植物病害的防治效果就越好。

Description

一种无致病性木霉菌株分离筛选方法和复合木霉菌剂的制备 方法

技术领域

本发明属于生防技术领域，具体涉及一种无致病性木霉菌株分离筛选方法和复合木霉菌剂的制备方法。

背景技术

黄连(CoptischinensisFranchet)为毛茛科多年生草本植物，以根茎入药，药材名味连、鸡瓜连，为2015版《中国药典》一部收录，是我国常用大宗中药材。

黄连在生长繁殖过程中，伴随着大量病害的发生，其中最为严重的是根腐病。发病时，黄连从须根开始腐烂，然后传播到主根，最后根全部腐烂，植株枯萎。且根腐病在地块中传播很快，黄连苗常常成片死亡。根腐病常年发病率在30％左右，严重的地块发病率在60～90％，甚至绝收。近十几年来，根腐病在黄连各大产区大面积爆发，严重影响黄连药材的产量和质量，给连农造成极大的经济损失，很多连农放弃种植黄连，黄连产区大面积萎缩，严重阻碍了该产业发展。目前生产上主要用多菌灵、百菌清等化学试剂对黄连根腐病进行防治，但几乎没有效果，且化学农药的大量使用，一方面引起病原菌的耐药性；另一方面导致农药残留和重金属超标等问题，危害黄连饮片安全。

生产上防治黄连根腐病困难，主要是由于根腐病的病原菌情况比较复杂。黄连根腐病主要由镰刀菌属真菌(Fusarium sp.)引起，其他还有土赤壳属(Ilyonectria sp.)、腐霉属(Pythium sp.)的多种真菌，可能还有其它未报道的真菌和细菌，甚至线虫，属于复合侵染病害。且不同的产地、季节、生育时期主要的病原不同，这给防治工作造成了极大的困扰。

发明内容

本发明的目的是提供一种无致病性木霉菌株分离筛选方法和复合木霉菌剂的制备方法，先确定需要防治病害的对象物种，从其不同产地的健康植株组织或根际土壤中分离不同的木霉菌种，配制成复合木霉菌剂，以防治不同产地、不同病原导致的该植物病害。具体到本实施例，是从不同产地的健康黄连根部和根际土壤中分离不同的木霉菌种，配制成复合木霉菌剂，以防治不同产地、不同病原导致的黄连根腐病。

本发明提供了一种从需要防治病害的对象物种的健康植株及其周边分离筛选无致病性木霉菌株的方法，包括以下步骤：将需要防治病害的对象物种的健康植株的组织匀浆或所述健康植株的根际土壤与水混合振荡20～30min，静置澄清后吸取上清液；

将所述上清液稀释后涂布于木霉分离培养基上，暗培养8～10d后光照培养3～4d，挑取所述木霉分离培养基上不同部位长出的绿色孢子团，分别接种于木霉分离培养基上，20～25℃暗培养3～4天；挑取所述绿色孢子团长出的的菌落边缘菌丝接种于新鲜的所述木霉分离培养基上，20～25℃暗培养3～4天，直至得到无污染纯菌种；所述木霉分离培养基包括以下质量浓度的组分：NaNO₃2 g/L、羧甲基纤维素钠5g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、链霉素60mg/L、氯霉素100mg/L和琼脂20g/L；

对所述无污染纯菌种的基因组DNAITS片段扩增测序进行分子鉴定，根据分子鉴定结果，剔除非木霉菌株和多余的同种的木霉菌株，得到不同种类的纯木霉菌株；

剔除所述纯木霉菌株中对所述对象物种存在致病性的菌株，得到无致病性木霉菌株。

优选的，所述健康植株的组织匀浆或根际土壤与水的质量体积比均为(1～3)g：(20～30)mL。

优选的，所述振荡为在20～25℃恒温条件下进行，所述振荡的频率为130～145rpm。

优选的，所述暗培养的温度为20～25℃；所述光照培养的光照度为800-1000Lx。

优选的，扩增ITS片段所用的引物包括ITS1和ITS4，其中ITS1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，ITS4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种复合木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：收集不同生产基地的对象物种健康植株或根际土壤，利用上述方法从中分离筛选得到不同种类的无致病性木霉菌株，分别置于培养基中先暗培养再光照培养，无菌水洗下培养物，制备得到不同木霉的菌丝和孢子的悬浮液；所述培养基包括粉碎玉米秸秆和糖蜜稀释液；

分别将不同木霉的所述悬浮液在所述培养基上进行扩大培养，待在所述培养基上长满绿色孢子后，将所有木霉的培养物等量混合，得到所述复合木霉菌剂。

优选的，所述暗培养的温度为20-25℃，暗培养至菌丝长满培养料，再在800-1000Lx光照下培养5～7天。

本发明还提供了利用上述制备方法得到的复合木霉菌剂。

本发明还提供了上述无致病性木霉菌株或上述复合木霉菌剂在防治对象物种的病害中的应用。

本发明还提供了一种防治植物病害的方法，在对象物种的生育期内施用上述复合木霉菌剂。

有益效果：本发明提供了一种从目标物种的健康植物组织和周边分离筛选无致病性木霉菌株的方法，利用所述无致病性木霉菌株配制复合木霉制剂，用来防治该植物病害，从该植物健康植株组织或根际土壤中分离真菌，所分离出的菌株通过分子鉴定进行粗略筛选，舍弃非木霉菌株、重复的同种木霉菌株和对本植物具有致病性的菌株，筛选出的木霉菌株混合配制复合菌剂，应用于该物种病害防治。本方法与现有方法相比具有以下有益效果：

(1)木霉无须精确鉴定到种，也无须每种木霉都做对病原的拮抗实验，大大减少工作量，节约了研究生产的成本和周期。

(2)复合木霉菌剂的组成菌种产地、季节来源越广、种类越多，其抗病原谱就越宽，其靶标病原能囊括绝大部分的病原，包括已报道的和未报道的病原，也包括真菌、细菌、线虫等，对该植物病害的抗病效果越好，尤其对于复合侵染病害效果显著，克服了现有药剂成分单一，抗病原谱狭窄的缺点。

(3)本方法制备的复合菌剂包含的木霉来自目标物种自身及其周边，能够在该物种植株和土壤中顺利定殖。

(4)本方法制备的复合菌剂包含的木霉来自不同产地，甚至可以取自不同季节，对生态环境的适应性也更强。在不同的产地，不同的环境生态条件下总有部分菌株能在土壤中顺利定殖，发挥其抗病作用，克服了现有药剂成分单一，效果受季节环境影响大的缺点。

(5)在制备所述复合木霉菌剂时，用玉米秸秆渣、糖蜜(一种制糖工业副产品)作为大规模生产的培养料，有利于废物利用，方法简便，所需设备简单，成本低廉，且生产过程环保无污染。

具体实施方式

本发明提供了一种从健康植物组织及其周边分离筛选无致病性木霉菌株的方法，包括以下步骤：将健康植株组织匀浆或土壤与水混合振荡20～30min，静置澄清后吸取上清液；

将所述上清液稀释后涂布于木霉分离培养基上，暗培养8～10d后光照培养3～4d，挑取绿色孢子团接种于木霉分离培养基上20～25℃暗培养3～4天；挑取所述绿色孢子团长出的的菌落边缘菌丝接种于新鲜的所述木霉分离培养基上20-25℃暗培养3～4天，直至得到无污染纯菌种；

所述木霉分离培养基包括以下浓度的组分：NaNO₃2 g/L、羧甲基纤维素钠5g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、链霉素60mg/L、氯霉素100mg/L和琼脂20g/L；

对所述无污染纯菌种的基因组DNAITS片段扩增测序进行分子鉴定，根据分子鉴定结果剔除非木霉菌株和重复的同种木霉菌株，得到不同种类的纯木霉菌株；

剔除所述纯木霉菌株中对本植物存在致病性的菌株，得到无致病性木霉菌株。

本发明所述无致病性木霉菌株从需要防治病害的对象物种的健康植株组织或根际土壤中分离得到，在分离时，将健康植株组织的匀浆或根际土壤与水混合振荡20～30min，静置澄清后吸取上清液。本发明所述对象物种优选包括粮食、中药材、果树及花卉苗木等，并且可根据所述无致病性木霉菌株的应用目标，对采集部位进行适当调整，如应用于根部病害防治的可以从该植物的根部和根际土壤同时分离木霉配制复合菌剂后施用于根部；应用于地上部分病害防治的可以从茎叶分离木霉配制复合菌剂后施用于茎叶。所分离的材料可以从众多产地，甚至不同季节取样，产地、取样时期越多，所分离的木霉抗病原谱越广，对生态环境的适应性越强，防病效果越稳定。本发明实施例中以从黄连须根和根际土壤中分离得到的木霉为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。

本发明在收集不同产地或基地的健康植株组织或根际土壤时，用自封袋分别保存，注意不要交叉污染，每个地块用五点法(四个角加中间点)收集植物组织5个混合成1个样本，根际土壤5个混合成一个样本，优选称取植物组织1～3g，用匀浆器匀浆，或根际土壤1～3g。将茎叶组织匀浆(防治该植物的茎叶病害取样部位)或根组织匀浆加根际土壤(防治该植物的根部病害取样部位)置于150ml三角瓶中，并向所述三角瓶中加无菌塑料球2个，与无菌水混合后进行恒温振荡，所述植物组织匀浆或根际土壤与无菌水的质量体积比优选为(1～3)g：(20～30)mL。本发明所述恒温振荡优选在恒温振荡器上进行，并设置温度为25℃，130～145rpm振荡20～30分钟，取出静置澄清，吸取上清液。

得到所述上清液后，本发明将所述上清液稀释后涂布于木霉分离培养基上，本发明优选吸取100μL所述上清液，稀释100倍后，取150～200μL涂布12cm平皿中的木霉分离培养基上，3皿/样品。本发明优选将上述平皿置于25℃，黑暗条件下培养8～10天左右，待培养基上长出菌落，置于25℃，光照1000Lx下促使木霉产孢，3～4天后，平皿上长出的绿色孢子团，挑取不同部位的孢子，分别接种于木霉分离培养基，20～25℃暗培养3～4天。

本发明优选挑取所述绿色孢子团长出的菌落边缘菌丝接种于新鲜的所述木霉分离培养基上，25℃，黑暗条件下培养，直至得到无污染纯菌种。

本发明在得到所述无污染纯菌种后，对所述无污染纯菌种进行分子鉴定，优选包括将所有分离出的菌株分别提取基因组DNA，用PCR技术扩增ITS片段，引物序列如下：

ITS1(SEQ ID NO.1)：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；

ITS4(SEQ ID NO.2)：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

扩增体系(50μL)：ddH₂O 20μL；PCR premix 25μL；真菌DNA模板4μL；ITS1和ITS4Primer各0.5μL。

扩增条件：94℃4min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，循环39次；72℃延伸10min。

片段送公司测序后，与NCBI中的序列进行比对，剔除非木霉菌株，舍弃多余的分子鉴定结果为同种的木霉菌株，得到基因型有较大差异的木霉菌株。

本发明对上述得到的基因型差异较大的木霉菌株进行安全性测试，剔除其中对本植物具有致病性的菌株。本发明实施例中，优选利用上述从不同产地的黄连须根和根际土壤中分离到的木霉菌株对黄连苗进行安全性测试，优选包括：麦粒水中浸泡24h，捞出沥干水分，与湿润木屑按麦粒：木屑＝1:10混合，装300mL罐头瓶，121℃灭菌1h，24h后再灭菌1h，冷却，分别接入各种木霉菌种。25℃避光培养，直至菌丝长满培养料，再在1000Lx光照培养5～7天，使培养物长出绿色孢子，得到各种木霉的固体制剂。取部分木霉固体制剂，分别用无菌水洗下菌丝和孢子，得到各种木霉的液体制剂；长宽各6厘米，高7厘米的花钵用1‰高锰酸钾溶液浸泡1h消毒，流水冲洗后沥干备用；腐殖土在120℃温度下烘3h，24h后同样温度和时间再烘一次，无菌水润湿，冷却备用；在黄连基地采集健康1年生黄连幼苗，清水洗净根部泥土备用。进行以下2个处理：

MM：接种木霉制剂。花钵底部先放置少量腐殖土，将黄连幼苗的茎叶蘸木霉液体制剂，栽入小花钵，取与液体制剂同种木霉固体制剂2g/钵，与腐殖土混合，填入苗周围以固定根部，浇透无菌水，注意接种过程中不同木霉菌株之间不要交叉污染。

CK：灌施无菌水25ml/钵。

以上处理2株/钵，10钵/菌种，置于温室，25℃，光照1500Lx，10h/d；黑暗14h/d，生长25-30天后观察统计黄连茎叶、根部有无发病情况，统计发病率、病情指数等。从而剔除致病的木霉菌株，得到无致病性的木霉菌株。

在本发明中，所分离的材料可以从众多产地，甚至不同季节取样，产地、取样时期越多，所分离的木霉越全面，抗病原谱越广，对生态环境适应性越强，防病效果越稳定。分离出的木霉通过分子鉴定剔除重复菌株后，剩余的菌株只需要对植物做安全性测试，选取无致病性的木霉菌株，配制复合菌剂，应用于该植物病害防治。出于木霉的定殖能力考虑，从根部组织加根际土壤中分离的木霉配制的复合菌剂应用于该植物根部病害防治，从茎叶分离的木霉配制的复合菌剂应用于该植物茎叶病害防治。

本发明还提供了一种复合木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：将利用上述方法从取自不同生产基地的对象物种健康植株或根际土壤中分离筛选得到的不同种类的无致病性木霉菌株，分别置于培养基中先暗培养再光照培养，无菌水洗下培养物，制备得到不同木霉的菌丝和孢子的悬浮液；所述培养基包括粉碎玉米秸秆和糖蜜稀释液；

分别将不同木霉的所述悬浮液在所述培养基上进行扩大培养，待在所述培养基上长满绿色孢子后，将所有木霉的培养物等量混合，得到所述复合木霉菌剂。

本发明将所述复合木霉菌剂的制备方法划分为种子悬浮液制备和扩大培养两部分，其中种子悬浮液制备，优选包括：玉米秸秆粉碎成渣，糖蜜用无菌水稀释100倍，与玉米秸秆渣混合拌匀，湿度以手捏没有多余水分滴出为度，装500mL罐头瓶，121℃灭菌1h，24h后再灭菌1h，冷却，分别接入不同的木霉菌种。25℃避光培养，直至菌丝长满培养料，再在1000Lx光照下培养5～7天，使培养物长出绿色孢子，无菌水洗下培养物，制成菌丝和孢子的悬浮液，用于扩大培养时接种。

本发明所述扩大培养优选包括：玉米秸秆渣+糖蜜培养料(制备方法同“种子悬浮液制备”)，装耐高温塑料托盘(40cm×30cm×5cm)，托盘装入耐高温透明塑料灭菌袋，橡皮筋扎紧袋口，121℃灭菌1h后冷却，松开橡皮筋，在无菌条件下用无菌喷枪喷洒上述木霉种子悬浮液在培养料表面，30～50mL/盘，橡皮筋扎紧袋口，25℃，黑暗条件下培养至菌丝长满培养料，再在1000Lx光照下培养5-7天，使培养物长满绿色孢子。接种时注意不同的木霉菌种不要交叉污染。

本发明将不同木霉的培养物进行等量混合，制成复合木霉菌剂，该菌剂在35℃烘箱烘干，粉碎，装干净塑料袋，密封备用。

本发明还提供了上述复合木霉菌剂在防治植物病害中的应用。

本发明还提供了一种防治植物病害的方法，包括以下步骤：在植物的生育期内施用上述复合木霉菌剂。

本发明实施例中，优选在黄连的生育期内施用从四川、湖北、重庆的70多个黄连生产基地的黄连须根和根际土壤中分离筛选得到的木霉组成的复合菌剂，为了彻底防治根腐病，更优选在黄连播种前和移栽前均施用所述木霉复合菌剂。具体地，在黄连苗圃播种前5～7天，将复合木霉菌剂均匀撒施在土面，施用量20～30kg/亩，整地时翻入土壤中，5～7天后，播种黄连种子。在黄连幼苗移栽前5～7天，将复合木霉菌剂均匀撒施在土面，施用量20～30kg/亩，整地时翻入土壤中，5～7天后，移栽黄连幼苗。此后每年施用1～2次，施用时间5月和10月，将复合木霉菌剂均匀撒施在土面，施用量20～30kg/亩，直到黄连收获。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种无致病性木霉菌株分离筛选方法和复合木霉菌剂的制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1须根和根际土壤木霉分离

到四川、湖北、重庆的70多个黄连产地用五点法取黄连根际土壤和须根，每个地块的5个须根和5个根际土壤分别混合成1个样本，用自封袋分别保存，注意不要交叉污染。每个地方的须根和土壤各称取1～3g，须根用匀浆器匀浆，和根际土壤混合，置于150ml三角瓶，加无菌塑料球2个，加无菌水20～30ml，置于恒温振荡器上，25℃，145rpm振荡20～30分钟，取出静置澄清，吸取上清液100μL，稀释100倍，取150～200μL涂布12cm平皿中的木霉分离培养基，3皿/土样。木霉分离培养基配方如下：

NaNO₃2 g/L、羧甲基纤维素钠5g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、链霉素60mg/L、氯霉素100mg/L和琼脂20g/L；以上平皿置于25℃，黑暗条件下培养8～10天左右，待培养基上长出菌落，置于光照1000Lx下促使木霉产孢，3～4天后，平皿上长出的绿色孢子团，挑取不同部位的孢子，分别接种于木霉分离培养基上，25℃黑暗条件下培养。

在培养基上长出菌落后，再挑取菌落边缘菌丝接种于木霉分离培养基上，直到得到无污染纯菌种，保存备用。

2木霉分子鉴定

所有分离出的菌株分别提取基因组DNA，用PCR技术扩增ITS片段，片段送公司测序后，与NCBI中的序列进行比对，剔除非木霉菌株，舍弃多余的分子鉴定结果为同种的木霉菌株，得到基因型有较大差异的木霉菌株。

3木霉对黄连苗安全性测试

麦粒水中浸泡24h，捞出沥干水分，与湿润木屑按麦粒：木屑＝1:10混合，装300mL罐头瓶，121℃灭菌1h，24h后再灭菌1h，冷却，分别接入各种木霉菌种。25℃避光培养，直至菌丝长满培养料，再在1000Lx光照培养5～7天，使培养物长出绿色孢子，得到各种木霉的固体制剂。

取部分木霉固体制剂，分别用无菌水洗下菌丝和孢子，得到各种木霉的液体制剂；长宽各6厘米，高7厘米的花钵用1‰高锰酸钾溶液浸泡1h消毒，流水冲洗后沥干备用；腐殖土在120℃温度下烘3h，24h后同样温度和时间再烘一次，无菌水润湿，冷却备用；在黄连基地采集健康1年生黄连幼苗，清水洗净根部泥土备用。进行以下处理：

MM：接种木霉制剂。花钵底部先放置少量腐殖土，将黄连幼苗的茎叶蘸木霉液体制剂，栽入小花钵，取与液体制剂同种木霉固体制剂2g/钵，与腐殖土混合，填入苗周围以固定根部，浇透无菌水。

CK：灌施无菌水25mL/钵。

以上处理2株/钵，20钵/菌种，置于温室，25℃，光照1500Lx，10h/d；黑暗14h/d，生长25～30天后观察统计黄连茎叶、根部有无发病情况，统计发病率、病情指数等。从而剔除致病的木霉菌株，得到无致病性的木霉菌株。

4木霉培养料配方筛选

玉米秸秆粉碎成渣，糖蜜用清水分别稀释20、100、500倍，与玉米秸秆渣混合拌匀，湿度以手捏没有多余水分滴出为度，装150mL三角瓶，121℃灭菌30min，冷却。从分离到的木霉中随机选取15种木霉菌，接种该培养料，3瓶/培养基处理/木霉。置于25℃，黑暗条件下培养6～8d至菌丝长满培养料，再置于1000Lx光照下产孢，5～7d后将培养物取出，40℃烘箱烘5～6h至恒重。取1g干培养物于150mL三角瓶，加入50mL 0.1％土温-80溶液，摇床140rpm振荡20min，在显微镜下用血球计数板统计孢子数目，计算孢子产量。结果如表1。从下表可见，当糖蜜稀释倍数为500倍时，很多木霉的产孢量均显著或极显著低于其余两个稀释度，可见稀释倍数太大，营养不足。而当稀释倍数为100倍时，大多数木霉产孢量与稀释20倍时没有显著差别。综合考虑产孢量和成本，糖蜜稀释100倍最合适。

表1糖蜜不同稀释倍数对木霉产孢量的影响

5复合木霉菌剂制备技术

种子悬浮液制备：玉米秸秆粉碎成渣，糖蜜用无菌水稀释100倍，与玉米秸秆渣混合拌匀，湿度以手捏没有多余水分滴出为度，装500mL罐头瓶，121℃灭菌1h，24h后再灭菌1h，冷却，分别接入不同的木霉菌种。25℃避光培养，直至菌丝长满培养料，再在1000Lx光照下培养5～7天，使培养物长出绿色孢子,无菌水洗下培养物，制成菌丝和孢子的悬浮液，用于扩大培养时接种。

扩大培养：玉米秸秆渣+糖蜜培养料(制备方法同“种子悬浮液制备”)，装耐高温塑料托盘(40cm×30cm×5cm)，托盘装入耐高温透明塑料灭菌袋，橡皮筋扎紧袋口，121℃灭菌1h后冷却，松开橡皮筋，在无菌条件下用无菌喷枪喷洒上诉木霉种子悬浮液在培养料表面，30～50mL/盘，橡皮筋扎紧袋口，25℃，黑暗条件下培养至菌丝长满培养料，再在1000Lx光照下培养5～7天，使培养物长满绿色孢子。接种时注意不同的木霉菌种不要交叉污染。最后将所有木霉的培养物等量混合，制成复合木霉菌剂。该菌剂在35℃烘箱烘干，粉碎，装干净塑料袋，密封备用。

6黄连大田生产施用复合木霉菌剂，设置以下几个处理，随机区组设计：

(1)仅育苗期施用，移栽地块不施用

黄连10-11月播种，采用搭棚育苗，小区面积为6.675m²(1.50m×4.45m)，在播种前5天撒施复合木霉菌剂300g/小区，整地时翻入土壤中，每个小区带沙播种黄连种子500g，3次重复。第三年5月移栽大田，大田小区面积为15m²(5.0m×3.0m)，株行距15cm×l0cm，3次重复。移栽后不施用任何防病药剂。其余管理方式同常规生产。

(2)育苗时不施用，仅移栽地块施用

育苗方式同步骤(1)，不施用任何防病药剂。第三年5月移栽大田，小区面积为15m²(5.0m×3.0m)，株行距15cm×l0cm，移栽前5天撒施复合木霉菌剂600g/小区，整地时翻入土壤中，3次重复。此后，每年5-6月施复合木霉菌剂一次，施用方式、施用量相同。其余管理方式同常规生产。

(3)育苗期及移栽地块均施用

在育苗时和移栽时均施用复合木霉菌剂，育苗方式、小区面积、播种量、株行距、药剂施用方式、施用量、移栽时间等均同步骤(1)(2)，3次重复。其余管理方式同常规生产。

(4)不施用任何防病药剂

不施用任何防病药剂，育苗方式、小区面积、播种量、株行距、移栽时间等均同步骤(1)(2)，3次重复。其余管理方式同常规生产。

以上处理在移栽后第3年9月(7-8月是根腐病高发时段)调查根腐病发生率，病情指数。在移栽后第5年收产，测定产量。结果如表2。可见，在育苗时和移栽后都施用复合木霉菌剂的处理根腐病发生率、病情指数最低，产量最高。因此，这两个时期均需要施用该药剂。

表2复合木霉菌剂对黄连根腐病发病情况和产量的影响

处理	根腐病发病率(％)	病情指数	产量(kg/小区)
				(1)	35.44Bb	37.01Bb	2.87Ab
(2)	27.93Bb	33.56Bb	2.65Ab
				(3)	16.39Cc	28.45Bc	3.54Aa
(4)	68.32Aa	85.34Aa	1.38Bc

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种从需要防治病害的对象物种的健康植株及其周边分离筛选无致病性木霉菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：将需要防治病害的对象物种的健康植株的组织匀浆或所述健康植株的根际土壤与水混合振荡20～30min，静置澄清后吸取上清液；

将所述上清液稀释后涂布于木霉分离培养基上，暗培养8～10d后光照培养3～4d，挑取所述木霉分离培养基上不同部位长出的绿色孢子团，分别接种于木霉分离培养基上，20～25℃暗培养3～4天；挑取所述绿色孢子团长出的的菌落边缘菌丝接种于新鲜的所述木霉分离培养基上，20～25℃暗培养3～4天，直至得到无污染纯菌种；所述木霉分离培养基包括以下质量浓度的组分：NaNO₃2 g/L、羧甲基纤维素钠5g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、链霉素60mg/L、氯霉素100mg/L和琼脂20g/L；

对所述无污染纯菌种的基因组DNAITS片段扩增测序进行分子鉴定，根据分子鉴定结果，剔除非木霉菌株和多余的同种的木霉菌株，得到不同种类的纯木霉菌株；

剔除所述纯木霉菌株中对所述对象物种存在致病性的菌株，得到无致病性木霉菌株。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述健康植株的组织匀浆或根际土壤与水的质量体积比均为(1～3)g：(20～30)mL。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述振荡为在20～25℃恒温条件下进行，所述振荡的频率为130～145rpm。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述暗培养的温度为20～25℃；所述光照培养的光照度为800-1000Lx。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，扩增ITS片段所用的引物包括ITS1和ITS4，其中ITS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ITS4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.一种复合木霉菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将利用权利要求1～5任一项所述方法从取自不同生产基地的对象物种植株组织或根际土壤中分离筛选得到的不同种类的无致病性木霉菌株，分别置于培养基中先暗培养再光照培养，无菌水洗下培养物，制备得到不同木霉的菌丝和孢子的悬浮液；所述培养基包括粉碎玉米秸秆和糖蜜稀释液；

分别将不同木霉的所述悬浮液在所述培养基上进行扩大培养，待在所述培养基上长满绿色孢子后，将所有木霉的培养物等量混合，得到所述复合木霉菌剂。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述暗培养的温度为20～25℃，暗培养至菌丝长满培养料，再在800～1000Lx光照下培养5～7天。

8.利用权利要求6或7所述制备方法得到的复合木霉菌剂。

9.权利要求6或7所述无致病性木霉菌株或权利要求8所述复合木霉菌剂在防治对象物种的病害中的应用。

10.一种防治植物病害的方法，其特征在于，包括以下步骤：在对象物种的生育期内施用权利要求8所述复合木霉菌剂。