CN117887595B - 一种暗褐网柄牛肝菌yafmf008及其分离方法和菌根苗侵染方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种暗褐网柄牛肝菌YAFMF008及其分离方法和菌根苗侵染方法，涉及农业种植技术领域。所述暗褐网柄牛肝菌保存名称为Phlebopus portentosus YAFMF008；保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 20232694，且暗褐网柄牛肝菌对思茅松菌根苗侵染方法主要包括菌种制备、思茅松种子无菌萌发、菌根苗的培育、幼苗移栽等四个步骤。本发明提供的培育方法可以帮助思茅松幼苗提高抗逆性的能力，大大提高幼苗成活率，提高人工林的品质，增强树林的稳定性，进而达到增加木材储量、发挥生态效益、创建优美环境的目的，进而为思茅松菌根化高效定向培育和菌根食用菌产业化培育奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及农业种植技术领域，具体涉及一种暗褐网柄牛肝菌YAFMF008及其分离方法和菌根苗侵染方法。
背景技术
思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis）属于松科（Pineaceae）松属（Pinus）植物，是卡西亚松（Pinus kesiya）的地理变种，天然分布于我国云南南亚热带及准热带的湿润及半湿润地区。具有优良的材质特性，速生、纤维长、高产松脂等特点，是云南热区的优良乡土树种之一，在区域林业中发挥着重要作用，具有重要的经济价值、森林生态服务功能和碳汇效益。然而，思茅松的繁育方式存在一些问题，如幼苗存活率低、移栽适应性差、生长缓慢等。当前，人工林中存在生产率低、林地地力衰退等问题，限制了其产业的进一步发展。
思茅松是典型的外生菌根共生树种，对外生菌根真菌（Ectomycorrhizal fungi，ECF）具有较高的依赖性，这些真菌可能在其营养代谢中发挥重要作用。ECF对于维持生态系统稳定性与多样性、促进植物根际养分循环、恢复生态植被、改良土壤等具有重要生态作用。在林业生产中，菌根技术已广泛应用于引种、育苗、造林和防治苗木根部病害等方面，取得了良好的效果。
暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）是一种隶属于牛肝菌目、小牛肝菌科（Boletinellaceae）的真菌。其子实体个体肥大，味道鲜美，富含丰富的营养价值。暗褐网柄牛肝菌在栽培过程中主要通过降解谷粒获得营养物质。这种真菌具备较完整的淀粉水解酶体系，能够有效地利用谷粒中的米粒成分获取营养物质，同时能够与卡西亚松形成外生菌根。这种共生关系有助于思茅松幼苗提高抗逆性、提高成活率、增强人工林的品质，同时还为菌根食用菌产业化培育提供了基础。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一种暗褐网柄牛肝菌YAFMF008及其分离方法和菌根苗侵染方法，能够提高思茅松幼苗成活率、同时提高菌根食用菌的产量，给农业生产提供产业化基础。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
一种暗褐网柄牛肝菌YAFMF008，所述暗褐网柄牛肝菌YAFMF008保藏名称为暗褐网柄牛肝菌YAFMF008（Phlebopus portentosus YAFMF008），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉大学；保藏编号：CCTCC M 20232694，保藏日期：2023年12月27日。
优选的，所述的暗褐网柄牛肝菌的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
暗褐网柄牛肝菌YAFMF008的分离方法，包括以下步骤：
（1）采集暗褐网柄牛肝菌的子实体样品制备组织破碎液；
（2）将上述组织破碎液稀释后涂布于PDMYKAS平板上培养15d；
（3）将上述平板上培养15d后得到的菌落进行鉴定，获得暗褐网柄牛肝菌，再将暗褐网柄牛肝菌的菌丝转接至PDMY固体培养基上继续培养20d，对菌株进行分子鉴定，得到暗褐网柄牛肝菌YAFMF008。
优选的，所述PDMYKAS平板的配方为：新鲜土豆汁500ml/L、酵母提取物1g/L、麦芽浸粉 2.1g/L、葡萄糖 5g/L、卡拉霉素100μg/ml、氨苄青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml、琼脂10g/L。
优选的，所述PDMY固体培养基的配方为：新鲜土豆汁500ml/L、酵母提取物1g/L、麦芽浸粉2.1g/L、葡萄糖5g/L、琼脂16g/L。
暗褐网柄牛肝菌YAFMF008菌根苗侵染方法，所述暗褐网柄牛肝菌对思茅松进行菌根苗侵染，且具体方法包括以下步骤：
（1）菌种制备：将分离纯化的暗褐网柄牛肝菌YAFMF008培养制备液体暗褐网柄牛肝菌菌丝体；
（2）思茅松种子无菌萌发：将思茅松种子无菌处理后置于灭菌后铺有滤纸的培养瓶中进行萌发；
（3）菌根苗培育：待上述培养瓶中种子萌发长出幼根后，于无菌条件下用镊子挑取种子置于含有培养基的组培瓶中，同时在萌发种子根部周围接入1mL液体菌种；封口后，置于光照培养室培养获得菌根苗；
（4）幼苗移栽：将经过高压灭菌的育苗基质装入备用的育苗盘，将上述菌根苗移栽进育苗盘中。
优选的，所述步骤（2）中思茅松种子萌发前，须在-28℃条件下储存5-7d。
优选的，所述步骤（2）中定期于无菌条件下向培养瓶中加入无菌水，保持湿润且种子周围不出现水膜，以胚根突破种皮5mm为种子的萌发标准，记录种子的萌发情况。
优选的，所述步骤（3）中每个组培瓶内装有的培养基组成为：大米10.5g，生土9g，草炭1.5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸钙0.3g，葡萄糖0.6g，自来水55mL。
优选的，所述步骤（4）中育苗基质为蛭石、腐植土、珍珠岩和有机肥的混合物。
本发明提供一种暗褐网柄牛肝菌YAFMF008及其分离方法和菌根苗侵染方法，与现有技术相比优点在于：
本发明提供一种暗褐网柄牛肝菌YAFMF008菌株，并且提供思茅松暗褐网柄牛肝菌侵染方法，充分综合了无菌条件下的菌种制备和菌根苗培育技术，结合成功的接种和无菌基质的移栽操作，显著提高了暗褐网柄牛肝菌的单一侵染率；能够促进思茅松幼苗与暗褐网柄牛肝菌之间的有效菌根合成，为下一步暗褐网柄牛肝菌子实体的形成奠定了坚实的基础；通过思茅松幼苗与暗褐网柄牛肝菌形成菌根后，显著提高了思茅松幼苗的生长指标，这为培育出优良的思茅松苗木创造了有利的条件；这一综合的侵染方法为思茅松和暗褐网柄牛肝菌共生系统的建立提供了创新和可行的途径，为推动相关产业的发展和提高经济效益提供了有力的技术支持。
附图说明
图1为本发明所述的暗褐网柄牛肝菌菌丝生长情况图，其中左侧为暗褐网柄牛肝菌菌丝生长图；右侧为液体培养暗褐网柄牛肝菌；
图2为本发明基于ITS构建了暗褐网柄牛肝菌的系统发育树展示图，红色箭头所表示为暗褐网柄牛肝菌YAFMF008；
图3为本发明所述的思茅松暗褐网柄牛肝菌侵染接种图，其中左侧为接种第一天图，右侧为接种第三天；
图4为本发明所述的思茅松暗褐网柄牛肝菌侵染接种第10d的示意图，其中左侧为菌根苗；右侧为非菌根苗；
图5为本发明所述的思茅松暗褐网柄牛肝菌侵染接种第20d的示意图，其中左侧为菌根苗；右侧为非菌根苗；
图6为本发明所述的思茅松暗褐网柄牛肝菌侵染接种第30d的示意图，其中左侧为菌根苗；右侧为非菌根苗；
图7为本发明所思茅松暗褐网柄牛肝菌侵染实验结果图，其中a为取样图，暗褐网柄牛肝菌菌丝包裹思茅松幼苗根部；b左侧为菌根苗，右为非菌根苗；图c为洗净幼苗根部包裹的菌丝后物镜观察图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
1、研究材料：
1.1暗褐网柄牛肝菌的分离
采集成熟度在70％-80％、无病虫害的暗褐网柄牛肝菌新鲜子实体，小心去掉菌盖及菌柄上粘连的泥土，再用75％的酒精棉球擦拭消毒2次，用流动水冲洗12 h，然后将菌柄切成2cm2小块，用灭菌水冲洗（500 ml），再用75%乙醇浸泡1min后，用无菌水漂洗4次，每次漂洗1min。然后用无菌滤纸吸干表面多余的水分，晾干备用；
在暗褐网柄牛肝菌新鲜子实体的萌盖和菌柄交界处或菌褶处，挑取一小块组织，将其切成约0.5cm2的组织块作为培养组织块，放入离心管，加入钢珠，500 µL的灭菌水，破碎1min（180rpm）。再稀释100倍涂板在10个PDMYKAS（新鲜土豆汁500ml/L、酵母提取物1g/L、麦芽浸粉2.1g/L、葡萄糖5g/L、卡拉霉素100μg/ml、氨苄青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml、琼脂10g/L）平板上，培养15d，长出菌落，挑选菌落，对单菌落进行鉴定，其中一个鉴定为暗褐网柄牛肝菌。
将长出的菌丝转接到PDMY固体培养基20d后，对菌株进行分子鉴定，得到暗褐网柄牛肝菌。该菌株形态如图1左侧所示，真菌在PDMY固体培养基上生长良好，菌落表面呈绒毛状，菌丝是黄色呈放射状向周围生长，生长后期菌丝较密集，且菌层较薄，菌落呈不规则的圆形状。所述PDMY固体培养基包括以下组分：100mL/瓶（新鲜土豆汁500ml/L+酵母提取物1g/L+麦芽浸粉 2.1g/L+葡萄糖 5g/L+琼脂16g/L）。
2、暗褐网柄牛肝菌的鉴定：
（1）形态的鉴定
真菌在PDMY固体培养基上生长良好，菌丝颜色呈现黄色，菌落表面平整呈放射状向周围生长，且菌层较厚，菌落呈不规则形状。
（2）DNA提取
①实验前先将CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）放在65℃水浴锅中加热30min；
②取50mg烘干的高黎贡牛樟芝菌丝体于2mL的离心管中，加入3颗小钢珠，将该离心管放入液氮中浸泡6min，并立即用破碎机破碎1.5min打碎，加入1mL预热的CTAB溶液，用移液枪吹打混匀后全部移入装有200μL PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)的离心管中，在通风橱中悬空添加20μLβ-巯基乙醇，震荡15s以充分研磨，然后放到65℃水浴锅水浴1.5h，每10min上下翻转5-6次，水浴结束后12000r/min，4℃离心10min；
③取1mL上清液到新的离心管中，加入DNA酚试剂、氯仿-异戊醇混合液各500μL，上下翻转10min，离心（4℃、12000r/min）10min（③步骤重复两次）；
④取上清液900μL放入一个新的离心管中，加入50μL 3mol醋酸钠溶液和900μL95%无水冰乙醇（-20℃），摇匀放入-20℃冰箱沉淀3h；
⑤沉淀完离心（4℃、12000r/min）10min，弃上清液，加入500μL 75％酒精上下翻转2-3次，静置3min，弃上清液；
⑥加入500μL 95%酒精上下翻转2-3次，静置3min，常温离心（13000rpm）3min，弃乙醇，放置干；
⑦加入40μL洗脱缓冲液EB，常温离心（13000rpm）1.5min，得到真菌暗褐网柄牛肝菌的基因组DNA。
（3）ITS分析鉴定
用真菌通用引物ITS1（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1区、5.8S区、ITS4区)序列，所得的ITS测序序列如SEQ ID No.1：ACAAATCCATATGACTCCCTGATTTGAGGTCAAGGTTCGATAAGACAGAGGGCATGCGTGACACAAGCCCCTCGCCTTTGATTAGAAGCTAGGACAGACCTTCGCCATCACACTTTTCCCTCCAGCCACGACGATCATTATCACGTCGAAGGCCGTCAGTTCATGCGACGAACACGTCCCTTTTGCTAATGCTTTTGAGGAGAGCTGACATTCCTCCCTCGAAGAGAGGGGGGTCCAACCAGCAAAGCTCCCAAGTCCAAGCCATGCCTCGAAAGTTAACATCAAGACATGGTTGAGAATTCGATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAAAATCTGCAATTCACATTACTTATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATTATAGTTTTGCGTCCAACCCCGTCAAGGGTCGAGATGACTTTCAACGTTCTGTAGACATACATGTAGTGTGATGGAAAGACATAGATCGTCCTCCTACTGCTCGTAGGGGAACAACCTACAACAGGTTCACAGGTGTATTAAGCATTACGCCGAAAGGAAGAGGGGCGAGCCAAGGTTTCGACGTGCACATGCATACGATATATGCCAGCGACAGTCGTCCCACCTAGCATCACCCTCTTTTTTTTCCCCCCTTCGGACTTTGTGCTTTCGATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAGCATTTTTTTTTTTATCAT；
（4）构建发育树
基于ITS利用MEGA软件构暗褐网柄牛肝菌的系统发育树（图2），综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，该真菌与暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）亲缘关系最近，所以将YAFMF008菌株鉴定为暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）。
实施例2：
思茅松暗褐网柄牛肝菌侵染方法：
1、液体培养暗褐网柄牛肝菌：
将暗褐网柄牛肝菌的菌丝体刮取60mm培养皿中四分之一的菌丝放入2mL灭菌离心管中，再加入1mL无菌水，破碎2min，然后取破碎后的样品液500µL分别接种到装有PDMY液体培养基的300mL锥形瓶中，置于28℃，150rpm的恒温摇床中，培养15d（如图1右侧所示）
2、思茅松种子无菌萌发
选取在-28℃条件下储存6d的均匀饱满的思茅松种子，用自来水洗去种子表面灰层，用30% H2O2消毒30 min后用无菌水冲洗2次，再用初始温度 60℃的温水在4℃冰箱浸泡24h，在无菌条件下，使用0.1% HgCl2进行10min的灭菌处理，然后用无菌水冲洗5次。随后，使用75%的乙醇浸泡3min，再次用无菌水冲洗5次；
对铺有滤纸的培养瓶进行高压灭菌后，将处理后的种子置于培养瓶中进行萌发试验。每个培养瓶含有30粒种子，并在培养瓶中添加无菌水以保持湿润，同时避免种子周围出现水膜。
3、思茅松暗褐网柄牛肝菌菌根苗培育
将培养基（大米10.5g，生土9g，草炭1.5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸钙0.3g，葡萄糖0.6g，自来水55mL）装入250mL的组培瓶，高温高压下灭菌2h，移入超净工作台备用。在超净工作台中，于无菌条件下向组培瓶移入备用的提前萌发的思茅松种子（幼根长5-10mm），同时在萌发种子根部周围接入1mL液体暗褐网柄牛肝菌菌种；封口后，置于光照培养室培养。
4、菌根苗幼苗移栽
育苗盘用10％的H2O2溶液消毒10min，用自来水冲洗三遍，最后用无菌水冲洗后晾干水分。育苗基质为蛭石、腐植土、珍珠岩和有机肥的混合物，经高压灭菌后装入备用的育苗盘。菌根苗移栽完成后，做好浇水、除草、施肥工作，除草时禁止使用除草剂，保证苗圃的通风透气，防止病害发生，育苗期间不施用杀真菌药剂。
采用上述实施例2的侵染方法获得的菌根苗进行移栽种植，另设一组移栽常规萌发的思茅松非菌根苗，观察记录生长不同时间的状况，具体见图3、图4、图5、图6、图7所示。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus ）YAFMF008，其特征在于，所述暗褐网柄牛肝菌YAFMF008保藏名称为Phlebopus portentosus YAFMF008，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉大学；保藏编号：CCTCC M 20232694。
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