CN116121082A - 抗旱作用的烟管菌mr-8及其应用 - Google Patents

抗旱作用的烟管菌mr-8及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有抗旱作用的烟管菌MR‑8及其应用。烟草是我国的重要的经济作物之一，对于我国的经济发展有着至关重要的作用，但近年来烟草种植生产往往会受到病虫害、重金属胁迫、干旱胁迫等多重因素的限制，导致烟草植株在苗期或大田期生长缓慢，严重威胁烟叶的产质量。通过将K326中分离出的内生真菌MR‑8菌液浇施于不同品种烟苗地上部及根部土壤，能显著提高烟苗的生物量及农艺性状。

Description

抗旱作用的烟管菌MR-8及其应用
技术领域
本发明涉及烟草内生真菌研究领域，特别涉及抗旱作用的烟管菌MR-8及其应用。
背景技术
植物内生真菌是一种可以促进植物生长，协助其宿主植物对抗恶劣环境胁迫，产生与宿主植物相类似的次级代谢产物及诱导植物次级代谢产物积累的微生物类群，一般包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。
目前，在大量农作物、药用植物和果树等经济作物中已发现超过130种内生细菌，涵盖60个属。常见的内生细菌包括土壤杆菌属(Agrobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、基杆菌属(Methylobacterium)和泛菌属(Pantoea)以及农杆菌属(Agrobacterium),植物内生放线菌的研究上，较多的为弗兰克氏菌属(Frankia)，而对于植物内生真菌的研究，大多数是禾本科植物、药用植物、海洋植物等，但烟草方面的还较少。
内生菌长期生活在烟草体内，且二者共同进化，已有研究表明，惠非琼等人研究发现，在干旱胁迫下，接种印度梨形孢可使烟草细胞膜损伤程度降低，积累更多的细胞渗透调节物质，同时提高烟草中相关抗旱基因的表达，从而使烟草抗旱能力增强。Hamilton等认为内生真菌可以通过改变宿主的抗氧化性来缓解非生物胁迫，在干旱胁迫下，内生真菌定植于宿主中,与宿主植株共生,真菌与植株相互作用，产生生物碱，提高植株的抗氧化性,缓解来自环境中的生物和非生物胁迫。Sun等认为在干旱胁迫下，由内生真菌P.indica定殖的植株类囊体膜相关Ca2+感受器、CASmRNA水平和CAS蛋白数量增加，增加了植株干旱胁迫的耐受。Shukla等研究也发现，内生真菌T.harzianum定殖植株不仅可使植株脯氨酸、MDA和H2O2含量下降，还使植株内的酚类和MSI含量增加。因此，烟草内生真菌是提高烟叶抗胁迫能力，改善烟叶产质量的的新途径。
在我们对云南烟草优势品种K326的内生真菌菌群的研究中，共从不同培养条件下的烟草K326中共分离得到154株内生真菌，鉴定为40属72种。其中，田间生长条件下的烟草K326中分离得到106株内生真菌，鉴定为37属62种，水培养的K326中分离得到23株内生真菌，鉴定为8属11种，无菌土培养的K326中分离得到25株内生真菌，鉴定为4属7种。经筛选，共有1种内生真菌明显促进了不同烟草品种的烟苗生物量和性状指标。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供抗旱作用的烟管菌MR-8及其应用；为提高烟叶的产质量提供新方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
抗旱作用的烟管菌MR-8，该烟管菌MR-8采用如下方法获得：
A、材料：将从田间采收的烟草K326植株分成上部叶、中部下部叶、烟茎、粗根、须根六个部分；
B、消毒：上部叶、中部叶、下部叶：75％酒精浸泡30s—0.1％升汞浸泡15s—无菌水冲洗3次；烟茎：75％酒精擦拭表皮-保留皮层及中柱；粗根、须根：75％酒精浸泡60s—0.1％升汞浸泡20s—无菌水冲洗3次，将最后一次冲洗后的无菌水划线于平板之上，作为对照，以检验样品的消毒是否彻底；
C、接种分离：将烟叶部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面；将烟茎部分用接种刀切成5～8mm小块，铺放在培养基表面；将粗根部分用接种刀切成3～5mm小段，切面朝下铺放在培养基表面；将须根部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面，全部材料放于28℃恒温培养箱中培养5～7天，观察菌落生长状况。由于不同真菌的繁殖速度不同，可以优先分离纯化生长较快的菌株，生长较慢的待其稳定后再进行分离纯化。
固体培养：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(46g/L)，加入链霉素(10mg/L)，防止细菌滋生，培养温度28℃，培养时间5～7天；
将分离出的不同种类的内生真菌接入PDA培养基进行纯化，2～3次点接纯化直到菌落单一，筛选后得到具有抗旱作用的功能性内生真菌烟管菌MR-8。
烟管菌MR-8鉴定：用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株进行rDNA ITS的PCR扩增，并对ITSPCR扩增产物进行测序，将所得序列在GenBank核算序列数据库中进行BLAST搜索，烟管菌(Bjerkanderasp.)MR-8发现测试菌株的ITS区域分别与已报道的同源性最高，结合形态学鉴定，确定菌种。
所述烟管菌(Bjerkanderasp.)MR-8，菌盖半圆形，宽2-7cm，厚0.1-0.6cm，表面淡黄色、灰色到浅褐色，有绒毛，以后脱浇，表面近光滑或稍有粗糙，环纹不明显；边缘薄，波浪形，变黑，下面无子实层。菌肉软革质，干后脆，纤维状，白色至灰色。
具有抗旱功能的烟管菌MR-8菌液的制备方法为：将其菌株接入100ml液体培养基中，装入250ml锥形瓶内，瓶口封膜，于摇床震荡培养，培养温度30℃，转速220rpm，培养时间48～72h；液体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤(25g/L)，加入链霉素(10mg/L)。
上述的具有抗旱功能的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用内生真菌菌液15ml(带菌丝和孢子)均匀的浇施在烟苗的地上部和根部基质土壤中。
上述真菌接种于红花大金元、云烟87、K326、云烟97四个不同品种的烟苗中，根据对烟苗相对含水量和酶活性等指标的评判，进一步证实烟管菌MR-8菌液对烟苗的抗旱作用，为进一步应用于生产提供基础支撑。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
经烟管菌MR-8处理过的云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的POD浓度活性均有提高，烟管菌作用下K326的POD浓度高于其他烟草品种；烟管菌作用下的云烟97和K326的POD浓度高于其它菌株。
烟管菌MR-8能提高云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的SOD活性，烟管菌能显著提高云烟87的SOD浓度，四个烟草品种中，烟管菌抗旱菌株作用下的红花大金元SOD浓度均高于其他品种；对云烟97和红花大金元的作用最强的是烟管菌。
烟管菌MR-8能提高云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的GSH浓度,烟管菌能够显著提高云烟97和红花大金元GSH的浓度。对云烟97和红花大金元作用最强的是烟管菌。
经烟管菌MR-8处理后的云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的CAT浓度均有提高，烟管菌能够显著提高红花大金元CAT浓度，对另外三个烟草品种的CAT浓度没有显著提高。
经烟管菌MR-8处理后的云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的MDA浓度显著降低，烟管菌能够显著降低云烟87、云烟97、K326和红花大金元四个烟草品种的MDA浓度。烟管菌能显著降低云烟87的MDA浓度，对云烟97、K326和红花大金元作用最强的是烟管菌。
附图说明
图1为本发明烟草育苗盘及播种方式；
图2为本发明烟草内生真菌MR-8的形态；
图3本发明烟草内生真菌MR-8对不同品种烟苗生长的抗旱作用图，其中图3a-图3f分别为：烟苗相对含水量、烟苗POD浓度、烟苗SOD浓度、烟苗GSH浓度、烟苗CAT浓度、烟苗MDA浓度；
图4本发明烟草内生真菌MR-8的发酵图；
图5接种本发明内生真菌的烟苗与未接种内生真菌烟苗长势对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
如图1-5所示，实施例1：植物材料的培养；
发明选用红花大金元、云烟87、K326、云烟97四个不同品种的烟草包衣种子，播种于3*4的小型育苗盘上(如图2)，每穴播种3粒种子，育苗所用营养土经高压灭菌处理，于培养箱内进行光照黑暗交替培养，光照培养16h，光强18000LX，28℃；黑暗培养8h，16℃；育苗盘底部加入营养液，每两天需补足营养液。
实施例2：内生真菌菌液浇施应用
将分离纯化得到的的内生真菌取1.5cm2左右大小的菌块接种于100ml液体培养基中,培养基装于250ml锥形瓶，于摇床中震荡培养，培养温度30℃，转速220rpm，培养时间48～72h；待烟苗生长到5～6片真叶时，取菌液对烟苗的地上部分和根部土壤进行浇施处理，浇施处理前育苗盘中每穴保留一株烟苗，确保每盘烟苗长势一致，每穴取3ml菌液浇于烟苗，取前将菌液摇晃均匀；浇菌后，育苗盘上部盖上透明隔离罩，三天后取下透明隔离罩在培养箱中继续培养，即在整个过程总均不添加培养液和水；另设置对照烟苗，对照烟苗只浇施同等体积的液体培养基，不浇施菌液。待烟苗生长到7片真叶时，对烟苗的相对含水量、POD、SOD、GSH、CAT、MDA等指标进行测量。
实施例3：
3.1烟管菌(Bjerkanderasp.)MR-8对不同烟苗品种相对含水量的影响。
结果显示，烟草K326经烟管菌(Bjerkanderasp.)MR-8处理后相对含水量较对照高出14.26％；云烟97经烟管菌(Bjerkanderasp.)MR-8处理后分别高出对照15.86％；K326经烟管菌(Bjerkanderasp.)MR-8处理后高出16.28％；红花大金元经烟管菌(Bjerkanderasp.)MR-8处理后为24.62％；其中红花大金元相对含水量增加最多。
3.2烟管菌(Bjerkanderasp.)MR-8对不同烟苗品种POD、SOD、GSH、CAT、MDA等酶活性的的影响。
结果显示，经烟管菌MR-8处理过的云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的POD浓度活性均有提高，烟管菌作用下K326的POD浓度高于其他烟草品种；烟管菌作用下的云烟97和K326的POD浓度高于其它菌株。
烟管菌MR-8能提高云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的SOD活性，烟管菌能显著提高云烟87的SOD浓度，四个烟草品种中，烟管菌抗旱菌株作用下的红花大金元SOD浓度均高于其他品种；对云烟97和红花大金元的作用最强的是烟管菌。
烟管菌MR-8能提高云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的GSH浓度,烟管菌能够显著提高云烟97和红花大金元GSH的浓度。对云烟97和红花大金元作用最强的是烟管菌。
经烟管菌MR-8处理后的云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的CAT浓度均有提高，烟管菌能够显著提高红花大金元CAT浓度，对另外三个烟草品种的CAT浓度没有显著提高。
经烟管菌MR-8处理后的云烟87、云烟97、K326和红花大金元四种烟草的MDA浓度显著降低，烟管菌能够显著降低云烟87、云烟97、K326和红花大金元四个烟草品种的MDA浓度。烟管菌能显著降低云烟87的MDA浓度，对云烟97、K326和红花大金元作用最强的是烟管菌。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (6)

1.抗旱作用的烟管菌MR-8，其特征在于：该烟管菌MR-8采用如下方法获得：
A、材料：将从田间采收的烟草K326植株分成上部叶、中部叶、下部叶、烟茎、粗根、须根六个部分；
B、消毒：上部叶、中部叶、下部叶：75％酒精浸泡30s—0.1％升汞浸泡15s—无菌水冲洗3次；烟茎：75％酒精擦拭表皮-保留皮层及中柱；粗根、须根：75％酒精浸泡60s—0.1％升汞浸泡20s—无菌水冲洗3次，将最后一次冲洗后的无菌水划线于平板之上，作为对照，以检验样品的消毒是否彻底；
C、接种分离：将烟叶部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面；将烟茎部分用接种刀切成5～8mm小块，铺放在培养基表面；将粗根部分用接种刀切成3～5mm小段，切面朝下铺放在培养基表面；将须根部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面，全部材料放于28℃恒温培养箱中培养5～7天，观察菌落生长状况；由于不同真菌的繁殖速度不同，可以优先分离纯化生长较快的菌株，生长较慢的待其稳定后再进行分离纯化。
2.权利要求1所述烟管菌MR-8及菌液用于促进烟苗的抗旱性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述菌液的制备方法为：是将权利要求1所述的烟管菌MR-8接入液体培养基，摇床震荡培养，转速220rpm，培养温度30℃，培养时间48～72h，备用；液体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤，其中马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L、链霉素10mg/L。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌液用于浇施于不同品种烟苗烟苗的地上部及根部基质土壤中，促进烟苗的抗旱性。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述菌液均在烟苗生长出5～6片真叶时施加，两周后检测烟苗的相对含水量和酶活性。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：需检测的酶活性包括：POD、SOD、GSH、MDA、CAT。
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CN116179370A (zh) * 2023-02-28 2023-05-30 云南农业大学 促进烟苗生长的烟草内生真菌及其应用

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