CN116024106A - 具有显著促进烟苗生长的烟草内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有显著促进烟苗生长的烟草内生真菌及其应用。烟草是叶用经济作物，是全国财政收入和百姓经济收入的主要来源，但近年来烟草种植生产往往会受到病虫害、重金属胁迫、干旱胁迫等多重因素的限制，导致烟草植株在苗期或大田期生长缓慢，严重威胁烟叶的产质量。通过将K326分离出的这8种内生真菌菌液浇施于不同品种烟苗地上部及根部土壤，能显著提高烟苗的生物量及农艺性状。

Description

具有显著促进烟苗生长的烟草内生真菌及其应用

技术领域

本发明涉及烟草内生真菌领域，特别涉及具有显著促进烟苗生长的烟草内生真菌及其应用。

背景技术

植物内生菌(endophyte)是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物各种组织和器官内部或者组织间隙中的微生物，一般包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。

目前分离到的植物内生细菌大约有120多种，隶属于54个属，其中最为常见的为假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)以及农杆菌属(Agrobacterium),植物内生放线菌的研究上，较多的为弗兰克氏菌属(Frankia)，而对于植物内生真菌的研究，大多数是禾本科植物、药用植物、海洋植物等，但烟草方面的还较少。

内生菌长期生活在烟草体内，且二者共同进化，已有研究表明，烟草内生菌可以产生促生物质，帮助烟草吸收矿质营养，促进烟草生长。Saito等发现梭状芽孢杆菌(Clostridiumsp.)含有大量的固氮酶，可在烟草体内发挥固氮作用，为烟草提供无机氮源，进而提高烟叶的产量和品质。杨珍福等人从烟草体内分离出3株解淀粉芽孢杆菌，对烟草幼苗有一定的促进生长作用。金慧清等人表明镰刀菌菌株YCEF005和棘壳孢菌菌株YCEF053、YCEF191、YCEF193、YCEF199可改善烟株的生物量和生理指标。因此，烟草内生真菌是提高烟叶抗病、抗胁迫能力，改善烟叶产质量的新途径。

在我们对云南烟草优势品种K326和云烟87的内生真菌菌群的研究中。共从不同培养条件下的烟草K326中共分离得到154株内生真菌，鉴定为40属72种。其中，田间生长条件下的烟草K326中分离得到106株内生真菌，鉴定为37属62种，水培养的K326中分离得到23株内生真菌，鉴定为8属11种，无菌土培养的K326中分离得到25株内生真菌，鉴定为4属7种。经筛选，共有8种内生真菌明显促进了不同烟草品种的烟苗生物量和性状指标。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供具有显著促进烟苗生长的烟草内生真菌及其应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

促进烟苗生长的内生真菌，所述烟草内生真菌的分离包括：

A、材料：将从田间采收的K326植株分成上部叶、中部叶、下部叶、烟茎、主根、须根六个部分；

B、消毒：上部叶、中部叶、下部叶：75％酒精浸泡30s—0.1％升汞浸泡15s—无菌水冲洗3次；烟茎：75％酒精擦拭表皮-保留皮层及中柱；粗根、须根：75％酒精浸泡60s—0.1％升汞浸泡20s—无菌水冲洗3次，将最后一次冲洗后的无菌水划线于平板之上，作为对照，以检验样品的消毒是否彻底；

C、接种分离：将烟叶部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面；将烟茎部分用接种刀切成5～8mm小块，铺放在培养基表面；将粗根部分用接种刀切成3～5mm小段，切面朝下铺放在培养基表面；将须根部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面，全部材料放于28℃恒温培养箱中培养5～7天，观察菌落生长状况；由于不同真菌的繁殖速度不同，优先分离纯化生长较快的菌株，生长较慢的待其稳定后再进行分离纯化；

固体培养：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA(46g/L)，加入链霉素(10mg/L)，防止细菌滋生，培养温度28℃，培养时间5～7天；

将分离出的不同种类的内生真菌接入PDA培养基进行纯化，2～3次点接纯化直到菌落单一，筛选后得到所述内生真菌C-4；

上述内生真菌鉴定：用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株进行rDNA ITS的PCR扩增，并对ITSPCR扩增产物进行测序，将所得序列在GenBank核算序列数据库中进行BLAST搜索，发现测试菌株的ITS区域与已报道极细枝孢同源性最高，结合形态学鉴定，确定该内生真菌的菌种；

所述烟草内生真菌为极细枝孢C-4,在PDA培养基上青绿色，表面短茸毛边缘略有白毛，较厚；菌丝少，分生孢子梗直立，稍弯曲分生孢子侧生呈长椭圆形；由于菌丝少且表面较厚，在纯化过程中可适当连固体培养基的部分挖出进行连续纯化，直至菌落单一无污染；在筛选时，液体培养基中加入菌丝需要在无菌条件下进行，使用接种环轻刮，伸入液体培养基侵泡，确保有一定菌丝进入液体培养基，完成一次加入后应将接种环置于酒精喷灯下充分灼烧灭菌后进行冷却以备下一次接种使用。该菌是从鲜活植物的组织中分离得到，植物组织中内生真菌细菌较多，且不同组织中内生真菌的种类和丰度也不相同，该株是从108株混杂的内生真菌中。

所述的内生真菌，所述内生真菌的应用菌液的制备方法，是将权利要求1所述的内生真菌接入液体培养基，摇床震荡培养，转速220rpm，培养温度30℃，培养时间48～72h，备用；液体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤，其中马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L、链霉素10mg/L。

所述的菌液用于浇施于不同品种烟苗的地上部及根部基质土壤中，促进烟苗的生长；菌液在培养一定时间后，通过血细胞计数板计算，加入无菌培养基统一稀释为20000000个/ml，每个部位分别施入5ml。

所述的菌液均在烟苗生长出5～6片真叶时施加，两周后检测烟苗的生物量和农艺性状；烟苗生长到5～6片真叶时处于生根期，处于此时期的烟苗已具有独立生活的能力，主根开始发育变粗，侧根大量发生，根系的养分吸收能力可提升空间足；叶片脉网已形成，输导组织已完善，具有一定的合成能力和养分运输功能；烟苗生长到5～6片真叶时处于生根期，处于此时期的烟苗已具有独立生活的能力，主根开始发育变粗，侧根大量发生，根系的养分吸收能力可提升空间足；叶片脉网已形成，输导组织已完善，具有一定的合成能力和养分运输功能。

所述的需检测的生物量和农艺性状包括：鲜重、根重、地上部鲜重、株高、最大叶长、最大叶宽、根长。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明所得真菌接种于红花大金元、云烟87、K326、云烟97四个不同品种的烟苗中，根据对烟苗生物量和农艺性状等7项指标的评判，进一步证实该株内生真菌对烟苗生长的促进作用，为进一步应用于生产提供基础支撑。试验表明C-4的促生长作用明显，尤其是促进根部生长效果最为显著，苗期根壮非常有利于烟株后期生长。根部大小是生产上判断苗是否合格的重要标准。作用于四个烟草品种，地上和地下部分均有不同程度的增长，可以缩短烟草苗期的生长时间，保证了烟苗移栽前达到优质烟苗的要求。基于与对照(无菌培养基处理)相比，接种了C-4的云烟87、云烟97、K326、红花大金元四个品种的烟苗株高增长率分别为14.70％、24.77％、23.80％、24.17％；最大叶长增长率分别为17.80％、19.23％、24.70％、13.20％；最大叶宽增长率分别为18.17％、15.00％、15.87％、10.33％；根长增长率分别为55.63％、53.63％、14.43％、10.33％；地下部鲜重增长率分别为156.80％、19.07％、56.07％、100.70％；地上部鲜重增长率分别为68.1％、40.87％、64.73％、29.67％。

附图说明

图1烟草育苗盘及播种方式；

图2株云烟87内生真菌的形态；

图3株云烟87内生真菌发酵图；

图4株烟草内生真菌对不同品种烟苗生长的促进作用；

图5接种内生真菌的烟苗与未接种内生真菌烟苗长势对比。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

如图1-5所示，实施例1：植物材料的培养；

发明选用红花大金元、云烟87、K326、云烟97四个不同品种的烟草包衣种子，播种于3*4的小型育苗盘上(如图2)，每穴播种3粒种子，育苗所用营养土经高压灭菌处理，于培养箱内进行光照黑暗交替培养，光照培养16h，光强18000LX，28℃；黑暗培养8h，16℃；育苗盘底部加入营养液，每两天需补足营养液。

实施例2：内生真菌菌液浇施应用

将分离纯化得到的内生真菌取1.5cm2左右大小的菌块接种于100ml液体培养基中,培养基装于250ml锥形瓶，于摇床中震荡培养，培养温度30℃，转速220rpm，培养时间48～72h；待烟苗生长到5～6片真叶时，取菌液对烟苗的地上部分和根部土壤进行浇施处理，浇施处理前育苗盘中每穴保留一株烟苗，确保每盘烟苗长势一致，每穴取3ml菌液浇于烟苗，取前将菌液摇晃均匀；浇菌后，育苗盘上部盖上透明隔离罩，放入培养箱中继续培养；另设置对照烟苗，对照烟苗正常培养，不浇施菌液，待烟苗生长到7片真叶时，对烟苗的地下部鲜重、地上部鲜重、株高、最大叶长、最大叶宽、根长共6个指标进行测量。

实施例3：

3.5极细枝孢(Cladosporiumtenuissimum)C-4对不同品种烟苗生长的促进作用

结果显示，C-4的促生长作用明显，与对照相比，接种了C-4的云烟87、云烟97、K326、红花大金元四个品种的烟苗株高增长率分别为14.70％、24.77％、23.80％、24.17％；最大叶长增长率分别为17.80％、19.23％、24.70％、13.20％；最大叶宽增长率分别为18.17％、15.00％、15.87％、10.33％；根长增长率分别为55.63％、53.63％、14.43％、10.33％；地下部鲜重增长率分别为156.80％、19.07％、56.07％、100.70％；地上部鲜重增长率分别为68.1％、40.87％、64.73％、29.67％。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (5)

1.促进烟苗生长的内生真菌，其特征在于，所述烟草内生真菌的分离包括：

A、材料：将从田间采收的K326植株分成上部叶、中部叶、下部叶、烟茎、主根、须根六个部分；

B、消毒：上部叶、中部叶、下部叶：75％酒精浸泡30s—0.1％升汞浸泡15s—无菌水冲洗3次；烟茎：75％酒精擦拭表皮-保留皮层及中柱；粗根、须根：75％酒精浸泡60s—0.1％升汞浸泡20s—无菌水冲洗3次，将最后一次冲洗后的无菌水划线于平板之上，作为对照，以检验样品的消毒是否彻底；

C、接种分离：将烟叶部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面；将烟茎部分用接种刀切成5～8mm小块，铺放在培养基表面；将粗根部分用接种刀切成3～5mm小段，切面朝下铺放在培养基表面；将须根部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面，全部材料放于28℃恒温培养箱中培养5～7天，观察菌落生长状况；由于不同真菌的繁殖速度不同，优先分离纯化生长较快的菌株，生长较慢的待其稳定后再进行分离纯化；

固体培养：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA(46g/L)，加入链霉素(10mg/L)，防止细菌滋生，培养温度28℃，培养时间5～7天；

将分离出的不同种类的内生真菌接入PDA培养基进行纯化，2～3次点接纯化直到菌落单一，筛选后得到所述内生真菌C-4；

上述内生真菌鉴定：用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株进行rDNA ITS的PCR扩增，并对ITS PCR扩增产物进行测序，将所得序列在GenBank核算序列数据库中进行BLAST搜索，发现测试菌株的ITS区域与已报道极细枝孢同源性最高，结合形态学鉴定，确定该内生真菌的菌种；

所述烟草内生真菌为极细枝孢C-4,在PDA培养基上青绿色，表面短茸毛边缘略有白毛，较厚；菌丝少，分生孢子梗直立，稍弯曲分生孢子侧生呈长椭圆形；由于菌丝少且表面较厚，在纯化过程中可适当连固体培养基的部分挖出进行连续纯化，直至菌落单一无污染；在筛选时，液体培养基中加入菌丝需要在无菌条件下进行，使用接种环轻刮，伸入液体培养基侵泡，确保有一定菌丝进入液体培养基，完成一次加入后应将接种环置于酒精喷灯下充分灼烧灭菌后进行冷却以备下一次接种使用，该菌是从鲜活植物的组织中分离得到，植物组织中内生真菌细菌较多，且不同组织中内生真菌的种类和丰度也不相同，该株是从108株混杂的内生真菌中。

2.根据权利要求1所述的内生真菌，其特征在于：所述内生真菌的应用菌液的制备方法，是将权利要求1所述的内生真菌接入液体培养基，摇床震荡培养，转速220rpm，培养温度30℃，培养时间48～72h，备用；液体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤，其中马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L、链霉素10mg/L。

3.权利要求2所述的内生真菌，其特征在于，内生真菌的菌液用于浇施于不同品种烟苗的地上部及根部基质土壤中，促进烟苗的生长；菌液在培养一定时间后，通过血细胞计数板计算，加入无菌培养基统一稀释为20000000个/ml，每个部位分别施入5ml。

4.根据权利要求2所述的内生真菌，其特征在于，内生真菌的菌液均在烟苗生长出5～6片真叶时施加，两周后检测烟苗的生物量和农艺性状；烟苗生长到5～6片真叶时处于生根期，处于此时期的烟苗已具有独立生活的能力，主根开始发育变粗，侧根大量发生，根系的养分吸收能力可提升空间足；叶片脉网已形成，输导组织已完善，具有一定的合成能力和养分运输功能；烟苗生长到5～6片真叶时处于生根期，处于此时期的烟苗已具有独立生活的能力，主根开始发育变粗，侧根大量发生，根系的养分吸收能力可提升空间足；叶片脉网已形成，输导组织已完善，具有一定的合成能力和养分运输功能。

5.根据权利要求4内生真菌，其特征在于，所述的需检测的生物量和农艺性状包括：鲜重、根重、地上部鲜重、株高、最大叶长、最大叶宽、根长。

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