CN110257254B - 一种生防菌株tmn-1及生防菌剂的制备方法和应用 - Google Patents

一种生防菌株tmn-1及生防菌剂的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物保护技术领域,尤其涉及一种生防菌株TMN‑1及生防菌剂的制备方法和应用。本发明的生防菌株TMN‑1为肉座菌属真菌,含有生防菌株TMN‑1的生防菌剂的制备为取烟草种植地区青枯病发病地块健康烟株根际土,采用稀释涂布平板法在孟加拉红选择性培养基上筛选出生防菌株TMN‑1,将筛选出的生防菌株TMN‑1在PDA培养基上进行活化,得到的纯生防菌株TMN‑1在PD培养基中于180rpm、28℃振荡培养5天,于7000rpm离心8‑10min,用无菌水调节孢子浓度为1×108cfu/mL。本发明的生防菌剂应用于烟草种植中,能够促进烟草健康生长,且还能够改善土壤微生物群落结构,对烟草青枯病具有良好防治效果,能够减轻烟草青枯病的危害。

Description

一种生防菌株TMN-1及生防菌剂的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物保护技术领域,尤其涉及一种生防菌株TMN-1及生防菌剂的制备方法和应用。
背景技术
烟草青枯病又称为烟瘟,是由青枯雷尔氏菌引起的一种土传性细菌病害,也是一种典型的维管束病害,最显著的发病症状是枯萎,一旦发病可造成烟草全株死亡,是烟草的毁灭性病害之一,严重影响烟叶的产量。1864年在印度尼西亚首次报道了青枯菌对烟草的毁灭性危害。青枯病目前在我国烟草种植地区发生广泛,河南、四川、重庆、贵州、云南等烤烟种植区域每年均有发生,且随着连作年限的增加,连作障碍无法打破,导致土壤酸化加重,土壤肥力下降,土壤健康失去原有的平衡,作物不能将康生长,自身抵抗病害能力下降,加之土壤病原不断累积,导致了烟草青枯病的爆发
目前为止,烟草青枯病的防治目前无有效手段或药剂,化学防治为主要防治方法,但会带来严重的环境问题;培育抗性品种是比较好的解决办法,但我国地域广,青枯病小种分化较多,变异迅速,抗性品种会快速的失去抗病性,并非长久之计。所以,如何寻求改良土壤,重塑土壤根际微生物生态群落结构,重新建立失去的土壤平衡,同时保证植株自身健康,提升植株自身抵抗病害能力的产品,是目前亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提供一种生防菌株TMN-1和生防菌剂的制备方法,制备得到的生防菌株TMN-1应用于烟草种植中,能够促进烟草健康生长,且还能够改善土壤微生物群落结构,对烟草青枯病具有良好防治效果,能够减轻烟草青枯病的危害。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题:
本发明的目的是提供了一种生防菌株TMN-1,所述生防菌株TMN-1为肉座菌属真菌,为哈茨木霉的有性型,已于2019年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为CGMCC No.17188。
分析生防菌株TMN-1生物学特性,生防菌株TMN-1兼具促进植物健康生长且对烟草青枯病具有良好的防治效果,其能够改善土壤微生物群落结构,减轻烟草青枯病的危害。
所述生防菌株TMN-1中含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明的另外一个目的在于提供一种生防菌剂,所述生防菌剂中含有上述的生防菌株TMN-1。
本发明的另外一个目的在于提供一种生防菌剂的制备方法,所述制备方法如下:
取烟草种植地区青枯病发病地块健康烟株根际土,采用稀释涂布平板法在孟加拉红选择性培养基上筛选出生防菌株TMN-1,将筛选出的生防菌株TMN-1在PDA培养基上进行活化,得到的纯生防菌株TMN-1在PD培养基中于180rpm、28℃振荡培养5天,于7000rpm离心8-10min,用无菌水调节孢子浓度为1×108cfu/mL,得到生防菌剂。
进一步,所述孟加红选择性培养基包括以下重量份的原料:马铃薯200.0份、无水葡萄糖20.0份、琼脂20.0份、蛋白胨5.0份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾1.0份、孟加拉红0.033份、氯霉素0.4份、蒸馏水1000份。
进一步,所述PDA培养基包括以下重量份的原料:马铃薯200.0份、无水葡萄糖20.0份、琼脂20.0份、蒸馏水1000份。
进一步,所述PD培养基包括以下重量份的原料:马铃薯200.0份、葡萄糖20.0份、蒸馏水1000份。
本发明的另一目的在于提供利用上述生防菌剂用于防治烟草青枯病的应用。
上述生防菌剂用于防治烟草青枯病的方法如下,在烟草移栽4~6天后,在烟草根部周围均匀灌根100mL生防菌剂,并于团棵期前后继续采用灌根方式,于每株烟草灌根200mL生防菌剂。
本发明的有益效果:
1、本发明是针对烟草青枯病而研发的一种生防菌剂,因其本身为生物制剂,相较于化学药剂,制剂本身对环境绝对友好无污染,有利于烟草行业的绿色可持续发展;
2、生防菌株本身易于培养,生防菌剂成本低廉,防治效果明显,有利于烟草种植行业减低成本,增加收入;
3、本发明能有效地促进烟草植株前期的生长发育,在病害发生前更有利于保障烤烟的正常健康生长,增强烟株自身抵抗病害的能力;
4、本发明生防菌剂菌种来自于植烟土壤健康烟株根际,对烟田土壤环境有更好的适应性,更有利于生防菌快速的在土壤中进行定植,改善破坏的土壤微生态环境,营造利于烟草健康生长的土壤环境。
另外本发明的生防菌剂可以在温室育苗时使用,也可以在烟苗进入大田移栽时使用,育苗播种时采用生防菌株拌入育苗基质的方式,大田期采用灌根的方式。移栽时灌根一次,团棵期灌根第二次,对田间烟草青枯病都可起到较好的防效。
附图说明
图1是本发明的生防菌株TMN-1无性时期扫描图,其中A为菌落初期,B为菌落后期,C为分生孢子梗,D为瓶颈,E为分生孢子;
图2是本发明的生防菌株TMN-1的系统发育树;
图3是采用生防菌孢子悬浮液对烟草灌根处理的农艺性状生长柱状图;
图4是采用生防菌孢子悬浮液对烟草灌根处理的农艺性状图;
图5是采用清水对烟草灌根处理的农艺性状图;
图6是采用生防菌剂对烟草灌根处理的根部生长对照图;
图7是采用生防菌剂对烟草灌根处理的根部以上生长对照图;
其中,a为处理组地下部鲜重,b为处理组地上部鲜重,c为对照组地下部干重,d为对照组地上部鲜重,“*”表示在5%的置信水平差异显著。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或者按照制造厂商所建议的条件。
本发明的生防菌株TMN-1为肉座菌属真菌,为哈茨木霉的有性型。于2019年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为CGMCCNo.17188。分析该生防菌株TMN-1生物学特性,生防菌株TMN-1兼具促进植物健康生长且对烟草青枯病具有良好的防治效果,其能够改善土壤微生物群落结构,减轻烟草青枯病的危害。
在烟草种植地区青枯病发病区域,采集健康烟株根际土壤样品,采用稀释涂布平板法在孟加拉红选择性培养基上筛选生防菌株TMN-1。
1.1配制所需培养基:
孟加红选择性培养基:在1000mL蒸馏水中,加入马铃薯200.0g、无水葡萄糖20.0g、琼脂20.0g、蛋白胨5.0g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、孟加拉红0.033g、氯霉素0.4g。
PDA培养基:在1000mL蒸馏水中,加入去皮马铃薯200.0g、无水葡萄糖20.0g、琼脂20.0g。
PD培养基:在1000mL蒸馏水中,加入马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g。
1.2生防菌孢子悬浮液的制备
本实施例的生防菌孢子悬浮液的制备方法如下:
取烟草种植地区青枯病发病地块中,健康烟株周围地块5-20cm的根际土作为土壤样品,称取土壤样品10g与90mL无菌水混合,震荡30min后静置5min,依次稀释10倍,稀释得到10-5的土壤稀释溶液,吸取0.1mL土壤稀释溶液加到孟加拉红选择性培养基上,均匀涂布后置于26-28℃培养观察,6-8天后挑取不同的单菌落划线纯化,将纯化后的菌株转接到孟加拉红选择性培养基上培养,得到生防菌株TMN-1,于3-4℃保存。
将筛选出的生防菌株TMN-1保存菌种接入PDA培养基上活化,3-4d后取菌丝生长旺盛的培养基,用5mm打孔器打出菌饼重新接入PDA培养基中进行扩增培养,于28℃恒温培养7d,等培养基表面均匀产出大量绿色分生孢子。采用无菌水进行洗脱,洗脱液收集于三角瓶中,加入无菌水,调整分生孢子浓度为1×108cfu/mL,得到纯生防菌孢子悬浮液,备用。
如图1所示,菌株为丝状真菌,生长迅速,PDA平板上3-5天可以长满平板,初期为白色,后期变为绿色。分生孢子梗侧生,分支2-3次,瓶颈锥状或瓶状,分生孢子球形或椭球型,浅绿色或透明。
通过对生防菌株TMN-1的ITS序列分析,获得了全长为592bp的序列,该生防菌株TMN-1含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。在Genbank的核苷酸序列库中,进行BLastn搜索,其同源性最高的是肉座菌属,选择肉座菌属中与TMN-1同源性较高的序列进行系统发育树的构建。再根据菌株本身的形态特征,将生防菌株TMN-1归入到肉座菌属。生防菌株TMN-1的系统发育树如图2所示。
1.3生防菌TMN-1对烟草幼苗的促生作用
选择大小均匀一致,四叶一心的烟苗作为试验样品进行试验。试验共设计两个处理:处理1,烟苗移栽时每株灌根10mL孢子浓度为1×108cfu/mL的生防菌孢子悬浮液;处理2,清水对照。每个处理重复2次,每个重复20株烟苗,温室温度为30℃,每天关照12h,设置相对湿度85%,30天后统计对平均株高、有效叶数、最大叶长、最大叶宽、最大根长、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重进行统计,并进行数据显著性差异分析。
结果如图3和图4显示,灌根生防菌株TMN-1,30天后,处理组的各项农艺性状在5%的置信水平上均显著性优于对照组,其中处理组的平均株高、有效叶数、最大叶长、最大叶宽分别是对照组的1.57、1.22、1.16、2.48倍;地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重分别为对照组的1.79、2.17、3.73、2.94倍,促进作用明显。因此,温室盆栽实验验证生防菌株TMN-1对烟草幼苗的生长促进作用。
1.4生防菌TMN-1对烟草青枯病的防效
PDA培养基上活化得到的纯生防菌株TMN-1在PD培养基中,于28℃、180rpm震荡培养5天,然后在离心机于7000rpm离心8-10min,无菌水调整孢子浓度为1×108cfu/mL,得到生防菌剂。该生防菌剂的应用方法为:在烟草移栽4~6天后,在烟草根部周围均匀灌根100mL生防菌剂,并于团棵期前后继续采用灌根方式,于每株烟草灌根200mL生防菌剂。相关试验如下:
1)温室盆栽实验检测生防菌株TMN-1对烟草青枯病的防效
选择大小均匀一致,四叶一心的烟苗进行试验。试验共设计两个处理:处理1,烟苗移栽后4天,每株烟苗灌根10mL1×108cfu/mL的生防菌剂,5天后接种1×105青枯菌10mL;处理2,灌根10mL无菌水,5天后接种1×105青枯菌10mL。每个处理10株,重复3次,28℃温室培育烟苗,每天关照12h,温室湿度为85%。7天后开始统计发病率和病情指数并计算防效。调查结果如表1显示:生防菌对青枯病的相对防效为54.80%。
表1生防菌TMN-1对青枯病的防治效果
Figure GDA0002949331170000061
2)生防菌的田间防治效果测定
实验地设在凉山州冕宁县石古村烟田,该地为连作15年的烟地,往年青枯病发生严重,该试验地烟苗于2018年4月25日移栽,实验共涉及三个处理:处理1,每株烟苗灌根1×108cfu/mL生防菌TMN-1孢子悬浮液200mL;处理2,1×108cfu/mL商品木霉生防菌孢子悬浮液200mL;处理3,每株烟苗灌根清水200mL。每个处理0.1亩,约90株烟,每个处理重复3次,试验时间为移栽后4天。7月4日调查青枯病发病率和病情指数,并计算最终防效。调查结果如表2显示,生防菌株TMN-1对青枯病的相对防效达到69.96%,显著的优于商品木霉菌株50.00%。采用生防菌株TMN-1对烟草植株灌根处理后,对烟草生长的影响如图5-图7所示。
表2生防菌株TMN-1对青枯病的田间防效
Figure GDA0002949331170000071
实验表明,在温室条件下,该生防菌剂对烟草幼苗的平均株高、根长,地上部分地下部分干重和鲜重,平均叶长和平均叶宽均具有显著地促进作用,其中促进作用最好的为地下鲜重部分,最高可达对照组的3.73倍,对青枯病的防治效果可达54.83%。田间防效表明,TMN-1菌株对青枯病的相对防治效果可达69.96%。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种生防菌株TMN-1及生防菌剂的制备方法和应用
<130> 2019
<141> 2019-03-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 591
<212> DNA
<213> Hypocrea lixii
<400> 1
tcgggctcga ctaactccca acccatgtga cgttaccaaa ctgttgcctc ggcgggatct 60
ctgccccggg tgcgtcgcag ccccggacca aggcgcccgc cggaggacca acctaaaact 120
cttattgtat accccctcgc gggttttttt ataatctgag cctttctcgg cgcctctcgt 180
aggcgtttcg aaaatgaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg 240
aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 300
tttgaacgca cattgcgccc gccagtattc tggcgggcat gcctgtccga gcgtcatttc 360
aaccctcgaa cccctccggg gggtcggcgt tggggatcgg ccctccctta gcgggtggcc 420
gtctccgaaa tacagtggcg gtctcgccgc agcctctcct gcgcagtagt ttgcacactc 480
gcatcgggag cgcggcgcgt ccacagccgt taaacaccca acttctgaaa tgttgacctc 540
ggatcaggta ggaatacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga a 591

Claims (7)

1.一种生防菌株TMN-1,其特征在于,所述生防菌株TMN-1为肉座菌属(Hypocrea)真菌,于2019年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为CGMCC No.17188,所述生防菌株TMN-1中含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.生防菌剂,其特征在于,所述生防菌剂中含有如权利要求1所述的生防菌株TMN-1。
3.一种如权利要求2所述的生防菌剂的制备方法,其特征在于,所述制备方法如下:
取权利要求1所述的生防菌株TMN-1在PDA培养基上进行活化,得到的纯生防菌株TMN-1在PD培养基中于180rpm、28℃振荡培养5天,于7000rpm离心8-10min,用无菌水调节孢子浓度为1×108cfu/mL,得到生防菌剂。
4.根据权利要求3所述的生防菌剂的制备方法,其特征在于,所述PDA培养基包括以下重量份的原料:马铃薯200.0份、无水葡萄糖20.0份、琼脂20.0份、蒸馏水1000份。
5.根据权利要求4所述的生防菌剂的制备方法,其特征在于,所述PD培养基包括以下重量份的原料:马铃薯200.0份、葡萄糖20.0份、蒸馏水1000份。
6.根据权利要求3-5任一所述的制备方法制备的生防菌剂在防治烟草青枯病的应用。
7.根据权利要求6所述的生防菌剂在防治烟草青枯病的应用,其特征在于,应用方法如下:在烟草移栽4~6天后,在烟草根部周围均匀灌根100mL生防菌剂,并于团棵期前后继续采用灌根方式,于每株烟草灌根200mL生防菌剂。
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