CN117305130A - 一种具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-21及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I‑21及其应用。烟草是我国的重要的经济作物之一，对于我国的经济发展有着至关重要的作用，但近年来烟草种植生产往往会受到病虫害、重金属胁迫、干旱胁迫等多重因素的限制，导致烟草植株在苗期或大田期生长缓慢，严重威胁烟叶的产质量。通过将云烟87中分离出的这1种内生真菌菌液浇施于不同品种烟苗的上部及根部土壤，能显著提高烟苗的生物量及农艺性状。
Description
技术领域
本发明涉及具有抗旱作用的烟草内生真菌领域，特别涉及具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21及其应用。
背景技术
植物内生真菌是一种可以促进植物生长，协助其宿主植物对抗恶劣环境胁迫，产生与宿主植物相类似的次级代谢产物及诱导植物次级代谢产物积累的微生物类群，一般包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。
目前，在大量农作物、药用植物和果树等经济作物中已发现超过130种内生细菌，涵盖60个属。常见的内生细菌包括土壤杆菌属(Agrobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、基杆菌属(Methylobacterium)和泛菌属(Pantoea)以及农杆菌属(Agrobacterium),植物内生放线菌的研究上，较多的为弗兰克氏菌属(Frankia)，而对于植物内生真菌的研究，大多数是禾本科植物、药用植物、海洋植物等，但烟草方面的还较少。
内生菌长期生活在烟草体内，且二者共同进化，已有研究表明，惠非琼等人研究发现，在干旱胁迫下，接种印度梨形孢可使烟草细胞膜损伤程度降低，积累更多的细胞渗透调节物质，同时提高烟草中相关抗旱基因的表达，从而使烟草抗旱能力增强。Hamilton等认为内生真菌可以通过改变宿主的抗氧化性来缓解非生物胁迫，在干旱胁迫下，内生真菌定植于宿主中,与宿主植株共生,真菌与植株相互作用，产生生物碱，提高植株的抗氧化性,缓解来自环境中的生物和非生物胁迫。Sun等认为在干旱胁迫下，由内生真菌P.indica定殖的植株类囊体膜相关Ca2+感受器、CASmRNA水平和CAS蛋白数量增加，增加了植株干旱胁迫的耐受。Shukla等研究也发现，内生真菌T.harzianum定殖植株不仅可使植株脯氨酸、MDA和H2O2含量下降，还使植株内的酚类和MSI含量增加。因此，烟草内生真菌是提高烟叶抗胁迫能力，改善烟叶产质量的新途径。
在我们对云南烟草优势品种云烟87的内生真菌菌群的研究中，共从田间采摘的云烟87烟株中分离出103株内生真菌，共52种，隶属于29个属。其中，上部叶有10个属共11种内生真菌，中部叶有7个属共8种内生真菌，下部叶有6个属共8种内生真菌，茎部有9个属共11种内生真菌，粗根有12个属共21种内生真菌，须根有5个属共7种内生真菌。经筛选，共有1种抗旱内生真菌明显促进了不同烟草品种的烟苗生物量和性状指标。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21及其应用；为提高烟叶的产质量提供新方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21；
其特征在于：所述的烟草内生真菌为：链格孢属真菌(Alternaria sp)001I-21；
该菌种通过如下步骤获得：
A、材料：将从田间采收的云烟87植株分成上部叶、中部叶、下部叶、烟茎、粗根、须根六个部分；
B、消毒：上部叶、中部叶、下部叶：75％酒精浸泡30s—0.1％升汞浸泡15s—无菌水冲洗3次；烟茎：75％酒精擦拭表皮-保留皮层及中柱；粗根、须根：75％酒精浸泡60s—0.1％升汞浸泡20s—无菌水冲洗3次，将最后一次冲洗后的无菌水划线于平板之上，作为对照，以检验样品的消毒是否彻底；
C、接种分离：将烟叶部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面；将烟茎部分用接种刀切成5～8mm小块，铺放在培养基表面；将粗根部分用接种刀切成3～5mm小段，切面朝下铺放在培养基表面；将须根部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面，全部材料放于28℃恒温培养箱中培养5～7天，观察菌落生长状况；由于不同真菌的繁殖速度不同，优先分离纯化生长较快的菌株，生长较慢的待其稳定后再进行分离纯化。
进一步地，所述培养基中，固体培养：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(46g/L)，加入链霉素(10mg/L)，防止细菌滋生，培养温度28℃，培养时间5～7天；
将分离出的不同种类的内生真菌接入PDA培养基进行纯化，2～3次点接纯化直到菌落单一，筛选后得到1株具有抗旱作用的功能性内生真菌。
进一步的，所述内生真菌鉴定具体为：用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株进行rDNAITS的PCR扩增，并对ITS PCR扩增产物进行测序，将所得序列在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索，链格孢属真菌(Alternaria sp)001I-21发现测试菌株的ITS区域分别与已报道的同源性最高，结合形态学鉴定，确定1株内生真菌的菌种。
所述1种烟草内生真菌(图1)：
链格孢属真菌(Alternaria sp)001I-21，在基物上生长的菌落，呈黑色或墨绿色的绒状或带粉状。菌丝灰色至黑色，生长迅速，扩散快。
进一步的，所述烟草内生真菌001I-21菌液的制备方法为：将所述的链格孢属真菌001I-21接入液体培养基，摇床震荡培养，转速220rpm，培养温度30℃，培养时间48～72h，备用；液体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤，其中马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L、链霉素10mg/L。
具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21的应用；将其菌液浇施于不同品种烟苗的地上部及根部基质土壤中，从而提高其抗旱性。
进一步地，所述的菌液均在烟苗生长出5～6片真叶时施加，两周后检测烟苗的生物量和农艺性状。
进一步地，所述的需检测的生物量和农艺性状包括：相对含水量和农艺性状。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21及其应用，所述真菌接种于红花大金元、云烟87、K326、云烟97四个不同品种的烟苗中，根据对烟苗生物量和农艺性状等7项指标的评判，进一步证实其对烟苗的抗旱作用，为进一步应用于生产提供基础支撑。
附图说明
图1烟草育苗盘及播种方式；
图2云烟87内生真菌的形态；
图3云烟87内生真菌发酵图；
图4本发明烟草内生真菌对不同品种烟苗生长的抗旱作用；
图5接种内生真菌的烟苗与未接种内生真菌烟苗长势对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细描述：
如图1-5所示：
实施例1：植物材料的培养
发明选用红花大金元、云烟87、K326、云烟97四个不同品种的烟草包衣种子，播种于3*4的小型育苗盘上(如图2)，每穴播种3粒种子，育苗所用营养土经高压灭菌处理，于培养箱内进行光照黑暗交替培养，光照培养16h，光强18000LX，28℃；黑暗培养8h，16℃；育苗盘底部加入营养液，每两天需补足营养液。
实施例2：内生真菌菌液浇施应用
将分离纯化得到的内生真菌取1.5cm2左右大小的菌块接种于100ml液体培养基中,培养基装于250ml锥形瓶，于摇床中震荡培养，培养温度30℃，转速220rpm，培养时间48～72h；待烟苗生长到5～6片真叶时，取菌液对烟苗的地上部分和根部土壤进行浇施处理，浇施处理前育苗盘中每穴保留一株烟苗，确保每盘烟苗长势一致，每穴取3ml菌液浇于烟苗，取前将菌液摇晃均匀；浇菌后，育苗盘上部盖上透明隔离罩，三天后取下透明隔离罩在培养箱中继续培养，即在整个过程中均不添加培养液和水；另设置对照烟苗，对照烟苗只浇施同等体积的液体培养基，不浇施菌液。待烟苗生长到7片真叶时，对烟苗的相对含水量、农艺性状等指标进行测量。
实施例3：
3.1链格孢属真菌(Alternaria sp)001I-21菌株对不同烟苗品种相对含水量的影响。
结果显示，云烟87对照烟苗和浇施了Alternaria sp.真菌的云烟87烟苗的相对含水量分别为33.49％、46.13％浇施了内生真菌后的云烟87烟苗相对含水量都显著高于对照烟苗，分别比对照烟苗高12.64％。
云烟97对照烟苗和浇施了Alternaria sp.真菌的云烟97烟苗的相对含水量分别为32.73％、49.97％。浇施了内生真菌后的云烟87烟苗相对含水量都显著高于对照烟苗，比对照烟苗高17.24％。
烟草K326对照烟苗和浇施了Alternaria sp.真菌的烟草K326烟苗的相对含水量为40.12％、58.14％。浇施了内生真菌后的烟草K326烟苗相对含水量都显著高于对照烟苗，比对照烟苗高18.02％。
红花大金元对照烟苗和浇施了Alternaria sp.真菌的红花大金元烟苗的相对含水量分别为34.37％、、52.78％。浇施了内生真菌后的红花大金元烟苗相对含水量都显著高于对照烟苗，分别比对照烟苗高16.73％。
3.2链格孢属真菌(Alternariasp)001I-21菌株对不同烟苗品种农艺性状的影响。
结果显示，云烟87对照烟苗和浇施了Alternaria sp.真菌的云烟87烟苗的株高分别为1.25cm、5.02cm，比对照烟苗高3.77cm；最大叶长分别为6.92cm、7.95cm、6.20cm和6.96cm；最大叶宽分别为3.48cm、4.33cm、3.67cm和4.33cm；根长分别为8.28cm、9.06cm、8.85cm和7.95cm，两种不同处理的烟苗均无显著差异。
云烟97对照烟苗和浇施了Alternaria sp.真菌的云烟97烟苗的株高分别为1.25cm、、3.29cm；最大叶长分别为7.34cm、7.56cm；最大叶宽分别为3.20cm、3.90cm，根长分别为8.06cm、8.33cm，两种不同处理的烟苗均无显著差异。
烟草K326对照烟苗和浇施、Alternaria sp.真菌的烟草K326烟苗的株高分别为1.60cm、5.40cm，最大叶长分别为7.58cm、8.45cm，两种不同处理的烟苗均无显著差异；最大叶宽分别为3.61cm、4.53cm，两种不同处理的烟苗均无显著差异；根长分别为8.93cm、9.19cm，两种不同处理的烟苗均无显著差异。
红花大金元对照烟苗和浇施了Alternaria sp.真菌的红花大金元烟苗的株高分别为1.60cm、4.74cm，浇施了Alternaria sp.后的红花大金元烟苗的株高显著高于对照烟苗分别比对照烟苗高3.15cm，最大叶长分别为7.34cm、8.67cm，四种不同处理的烟苗均无显著差异；最大叶宽分别为3.52cm、4.37cm，四种不同处理的烟苗均无显著差异；红根长分别为7.61cm、7.94cm，四种不同处理的烟苗均无显著差异。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (7)
1.具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21，其特征在于：
其特征在于：所述的烟草内生真菌为：链格孢属真菌(Alternaria sp)001I-21；
该菌种通过如下步骤获得：
A、材料：将从田间采收的云烟87植株分成上部叶、中部叶、下部叶、烟茎、粗根、须根六个部分；
B、消毒：上部叶、中部叶、下部叶：75％酒精浸泡30s—0.1％升汞浸泡15s—无菌水冲洗3次；烟茎：75％酒精擦拭表皮-保留皮层及中柱；粗根、须根：75％酒精浸泡60s—0.1％升汞浸泡20s—无菌水冲洗3次，将最后一次冲洗后的无菌水划线于平板之上，作为对照，以检验样品的消毒是否彻底；
C、接种分离：将烟叶部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面；将烟茎部分用接种刀切成5～8mm小块，铺放在培养基表面；将粗根部分用接种刀切成3～5mm小段，切面朝下铺放在培养基表面；将须根部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面，全部材料放于28℃恒温培养箱中培养5～7天，观察菌落生长状况；由于不同真菌的繁殖速度不同，优先分离纯化生长较快的菌株，生长较慢的待其稳定后再进行分离纯化。
2.根据权利要求1所述的具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21，其特征在于：
所述培养基中，固体培养：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(46g/L)，加入链霉素(10mg/L)，防止细菌滋生，培养温度28℃，培养时间5～7天；
将分离出的不同种类的内生真菌接入PDA培养基进行纯化，2～3次点接纯化直到菌落单一，筛选后得到1株具有抗旱作用的功能性内生真菌。
3.根据权利要求1所述的具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21，其特征在于：所述内生真菌鉴定具体为：用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株进行rDNAITS的PCR扩增，并对ITS PCR扩增产物进行测序，将所得序列在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索，链格孢属真菌(Alternaria sp)001I-21发现测试菌株的ITS区域分别与已报道的同源性最高，结合形态学鉴定，确定1株内生真菌的菌种；
所述烟草内生真菌为：
链格孢属真菌(Alternaria sp)001I-21，在基物上生长的菌落，呈黑色或墨绿色的绒状或带粉状，菌丝灰色至黑色，生长迅速，扩散快。
4.根据权利要求1所述的具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21，其特征在于：
所述烟草内生真菌001I-21菌液的制备方法为：将所述的链格孢属真菌001I-21接入液体培养基，摇床震荡培养，转速220rpm，培养温度30℃，培养时间48～72h，备用；液体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤，其中马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L、链霉素10mg/L。
5.具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-21的应用；其特征在于，将其菌液浇施于不同品种烟苗的地上部及根部基质土壤中，从而提高其抗旱性。
6.根据权利要求5所述应用；其特征在于，所述的菌液均在烟苗生长出5～6片真叶时施加，两周后检测烟苗的生物量和农艺性状。
7.根据权利要求6所述应用；其特征在于，权利要求5所述的需检测的生物量和农艺性状包括：相对含水量和农艺性状。
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|---|---|---|---|
| CN202311281267.8A CN117305130A (zh) | 2023-10-07 | 2023-10-07 | 一种具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-21及其应用 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116179370A (zh) * | 2023-02-28 | 2023-05-30 | 云南农业大学 | 促进烟苗生长的烟草内生真菌及其应用 |
| CN118516243A (zh) * | 2024-07-19 | 2024-08-20 | 云南省林业和草原科学院 | 拟金茅内生真菌及其抗旱应用 |
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- 2023-10-07 CN CN202311281267.8A patent/CN117305130A/zh not_active Withdrawn
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