CN103937684B - 一种从桉树土壤中筛选的抑草真菌 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物除草剂领域，特别涉及一种从桉树土壤中筛选的抑草真菌。分别以不同科的敏感植株莴苣（菊科）、小白菜（十字花科）、萝卜（十字花科）和稗草（禾本科）为受体，对该真菌菌株发酵液的抑草能力进行生物测试，发现其对四种受体的根长和株高均有抑制作用，尤其对菊科植株莴苣的抑制作用最强，并把该菌株命名为HQM1。通过对该菌株的形态学和18S rDNA序列分析鉴定结果都表明该菌株为<i>Aspergillius</i><i> niger</i>（黑曲霉属）中的一员，为首次从桉树土壤中筛选强抑草真菌黑曲霉属（<i>Aspergillus</i><i> niger</i>）。

Description

一种从桉树土壤中筛选的抑草真菌

技术领域

本发明涉及一种从具有强化感作用的桉树的根部土壤筛到的黑曲霉属真菌，该真菌具有强抑草作用，属于微生物除草剂领域。

背景技术

桉树(Eucalyptus)是对桃金娘科(Myrtaceae)桉树属(Eucalyptus)各树种的统称，原产地绝大多数在澳洲大陆，少部分生长于邻近的新几内亚岛、印度尼西亚，以及菲律宾群岛。19世纪引种至世界各地，截至2012年，有96个国家或地区有栽培。桉树的生长速度在世界上的树种中名列前茅的树种，特点有适应性强、分布广、生长速度快、轮伐期极短等等，是当前工业主要的短周期原料林树种，因为桉树喜温暖气候，所以在热带和亚热带地区多被为引种和栽培旧。主要种类有，巨桉(E.grandis)在桉树属这些品种中其双蒴盖亚属横脉组柳桉系的一个优良的树种，具有萌蘖能力强、生长速度快、干形好、自然整枝好、短期可以采伐、经济效益高、用途广泛等优点；尾叶桉(E.urophylla)属常绿乔木，喜光、喜温湿，要求土壤疏松肥沃、酸性或微酸性，具有速生丰产、短期成材、抗逆性强、适应性广、经济效益高的特点；巨尾桉(E.grandis×E.urophylla)属桃金娘科落叶乔木，是巨桉和尾叶桉的人工杂交种，该树喜光，能在酸性的黄红壤里生长，具有耐干旱瘠薄、抗逆性强、生长快、适应性广、经济价值高、纸浆得率高、是造纸、人造板的优良材料树种等特点，等树种、亚种或变种很多差不多共有800余个。

对于“桉树树下不长草”这句话，越来越多的研究表明，桉树除了对土壤中的水分和肥有非常强的竞争力外，还有一件非常重要的原因是因为桉树它具有较强的化感作用。桉树释放的化学物质通过各种途径对其周围的其它的植物的生长产生影响，从而导致了桉树林中群落的结构变的简单。对于桉树的化感作用，近些年来已有许多的相关报道。它的化感物质的释放有四个途径分别是通过叶片或树枝的挥发释放（主要是萜类物质）、通过降水的淋溶释放（主要是酚类物质）、通过根部分泌的根系释放、还有就是随着职务的残体的腐蚀而释放出化感物质的腐烂释放。

有研究表明桉树的化感物质对于植物根系、幼苗的生长和叶片的光合作用有抑制作用，如尾叶桉叶片的提取液，对绿豆(PhaseolusaureusRoxb．)和豌豆（PisumsativumLinn.)的插条的生根有非常强的抑制作用；巨尾桉枝叶的水浸提物，对水稻(OryzasativaLinn.)、蕹菜(1pomoeaaquatica)和菜苔(Brassicaparachinensis)的种子萌芽有不同程度地影响；巨尾桉叶片的水抽提物，对小麦(TriticumaestivumLinn.)的种子萌发和幼苗生长有明显的影响。窿缘桉(E.exserta)和尾叶桉叶片的水抽提物，能强烈的抑制作用萝卜(Raphaaassativa)、莴苣(Lactucasativa)幼苗的生长；窿缘桉叶片的水提物，能显著的抑制作用马占相思(Acaciamangium)的苗高；尾叶桉叶片的水提物，能对新银合欢(Leucaenaleucocephala)幼苗的生长产生强烈的影响。M．L．Bolte等发现到，从艮叶山桉(E.pulverulentaSims)中分离出来的巨桉酚，不但对独行菜(Lepidiumlatifolium)种子的萌发有强烈抑制作用，还能影响其气孔的开放，从而调节其水分散失强度来抑制其叶片的光合作用。

桉树以土壤为载体来实现化感作用的，其化感物质必然会影响土壤微生态系统，从而对桉树的化感抑草作用产生重要的影响。有研究表明，化感物质对桉树根部土壤微生物有抑制作用。根部土壤微生物种群的变化将会对植物的生长和发育产生重大的影响。本研究是根据化感作用的原理，利用化感桉树根部周围特殊的微生态系统，来筛选、和研究抑草功能微生物，为后续的微生物除草剂的开发做好铺垫。

发明内容

本发明涉及一种从具有强化感作用的桉树的根部土壤筛到的黑曲霉属真菌，该真菌具有强抑草作用，可用于开发微生物除草剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

该真菌为黑曲霉属（Aspergillusniger）HQM1，于2014年3月16日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2014092，保藏地址为武汉大学。

该真菌可作为真菌除草剂，是先通过用菌株的发酵液来处理莴苣，来初步筛选具有抑草作用的真菌，再把有抑制作用的菌株的发酵液稀释10倍后处理不同科的敏感植株莴苣、小白菜、萝卜、稗草，筛到有强抑制作用的菌株。

一种从桉树土壤中筛选抑草真菌在真菌除草剂上的应用。

所述菌株是从从桉树土壤中筛选的，该菌株的形态特征、培养特性、ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列和菌种分类结果如下：该发明的真菌菌株HQM1在28℃PDA培养基培养生长速度快，培养2天后表面菌落呈白色，无同心圆，质地丝绒状，有放射状延伸的边缘，底部为黄色，无渗出物，无味。在显微镜下，分生孢子呈黑色、黑褐色，分生孢子梗透明，有隔，分生孢子头呈球形，放射状，顶囊近球形。菌株18SrDNA测序结果显示，其序列大小为1342bp，通过与NCBI（BLAST）中的数据进行同源性比较，该菌株与Aspergilliusnige的序列相似率达99%以上，推断该菌株是Aspergilliusnige（黑曲霉属）。

本发明的优点在于：提供一种从桉树土壤中筛选的抑草真菌及其作为微生物除草剂的应用，该菌株可作为真菌除草剂，具有很强的抑草作用，有良好的市场应用前景，为后续的微生物除草剂的开发做好铺垫。

附图说明

图1本发明的真菌菌株HQM1菌株分生孢子图。

图2为真菌菌株HQM1生长曲线。

图3为真菌菌株HQM1的18SDNA序列扩增，1为真菌菌株HQM1的18SDNA目的条带，2为DL10000DNAMarkerLane，3为DL10000DNAMarkerLane标准电泳条带示意图。

图4为真菌菌株HQM1的18SDNA序列系统发育树，HQM1株与黑曲霉HKS11株（JX112703）亲源关系最近，核苷酸同源性在99%以上，泡盛曲霉(Aspergillusawamori)是黑曲霉(Aspergillusniger)变种。

具体实施方式

下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。

实施例1：

1、实验方法

1.1、菌株发酵液的抑草能力生物测试

在组培瓶中放一张滤纸，别取5mL发酵液和稀释3倍的发酵液加入到组培瓶中，每个组培瓶中播入5粒刚冒白的莴苣，蒸馏水做对照，并将其置28℃恒温培养箱中培养，每个实验设置3次重复。培养3d后测定稗草的根长和株高。抑制率计算按公式：IR=（1-TR/CK）×100%。其中，IR：抑制率(Inhibitionrate)；TR：处理(Treatment)；CK：对照(Control)。以莴苣、小白菜、萝卜和稗草为受体的抑草能力生物测试实验步骤同上。

1.2菌株生长曲线的绘制

取25ml的PDA发酵液于50ml的离心管，放在121℃，灭菌20min。每个菌株用0.8cm的打孔器在菌落的边缘打孔，后把打下来的菌饼每个离心管里放一个，一个菌株接8管，后放在28℃、160rmp/min温控摇床上，重复三次。第一次取样是把打下来的菌饼称重，后过滤，把菌丝放在40℃的烘箱中烘干，冷却后称重。以天数为横轴，以菌丝干重为纵轴，绘制生长曲线。

1.3、形态学鉴定

1.3.1菌落的形态学观察

在PDA固体培养基平板中间接入用直径0.8cm的打孔器打下的菌饼，28℃连续培养7d，每天观察菌落边缘和表面的质地、颜色纹饰等形态特征。

1.3.2显微镜形态观察

将在PDA固体培养基平板上培养3d的菌落用解剖针挑出一点菌落，放在中间滴有无菌水的载玻片上，然后用两只解剖针尽量的把菌落分散开，盖上盖玻片，用吸水纸把载玻片周围的水吸干，在光学显微镜下观察分生孢子梗和孢子等形态。

1.3.3形态学鉴定

形态学鉴定依据菌落的特征，根据魏景超的《真菌鉴定手册》和C.J.Alexpoulos的IntroductoryMycology对菌株进行初步的鉴定。

1.4真菌菌株的分子生物学鉴定

按常规方法提取该真菌的基因组DNA，利用设计的针对18SrDNA引物进行PCR扩增，所用引物序列为：NS1：5’–GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’；NS6：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC3’；PCR扩增条件：预变性94℃3min，循环94℃25s，55℃25s，72℃1min，30个循环，然后在72℃，修复延伸10min。将18SrDNAPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，将PCR扩增产物经胶回收纯化后克隆到T载体上，随机挑取10个单菌落摇菌后进行鉴定，随机选择3份经鉴定为阳性的重组质粒送由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，利用DNAStar进行序列拼接，并在NCBI中进行BLAST分析。

2、实验结果：

2.1、菌株发酵液的生物生物测试

HQM1菌株发酵液稀释3倍后对四种敏感受体植株均有强抑制作用（表1）。稀释3倍后的菌株发酵液都会抑制四种不同科的受体植株-莴苣（菊科）、小白菜（十字花科）、萝卜（十字花科）和稗草（禾本科）的生长，尤其对菊科植株莴苣的根长和株高的抑制作用最强。发酵液对莴苣根长的抑制率为87.22%，株高的抑制率为69.40%。

表1HQM1菌株发酵液稀释3倍后对四种受体植株的影响

2.2、菌株鉴定

形态学鉴定结果：表面老菌落呈白色，无同心圆，质地丝绒状，有放射状延伸的边缘，底部为黄色，无渗出物，无味。镜检结果显示分生孢子呈黑色、黑褐色，分生孢子梗透明，有隔，分生孢子头呈球形，放射状，顶囊近球形。

菌株18SrDNA测序结果显示，其序列大小为1342bp，通过与NCBI（Blast）中的数据进行同源性比较，该菌株与Aspergilliusnige的序列相似率达99%以上，推断该菌株是Aspergilliusnige（黑曲霉属）。

通过形态学和18SrDNA鉴定结果表明该菌株是Aspergilliusnige（黑曲霉属）中的一种。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建农林大学

<120>一种从桉树土壤中筛选的抑草真菌

<130>2

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gtagtcatatgcttgtctc

19

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gcatcacagacctgttattgcctc

24

Claims (2)

1.一种从桉树土壤中筛选的抑草真菌，其特征在于：所述真菌为黑曲霉属（Aspergillusniger）HQM1，已于2014年3月16日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2014092。

2.一种如权利要求1所述的一种从桉树土壤中筛选的抑草真菌在真菌除草剂上的应用。