CN114657068A - 一种康土抑草菌的制备方法 - Google Patents

一种康土抑草菌的制备方法 Download PDF

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Abstract

本方案属于抑草菌领域,具体涉及一种康土抑草菌的制备方法,通过独特的培养基原料配比以及专门的工艺流程,利用生产的微生物及其代谢产物来防治农业草害,改良土壤,与人工及机械除草相比,其具有投资少、经济效益高、有效期长等优点。与化学除草剂草甘膦相比,其具有对环境安全,相容性好,对作物不产生药害,不但对土壤无污染,同时还可以改良土壤促进作物成长。对人和动物安全无影响,符合可持续绿色发展的要求。

Description

一种康土抑草菌的制备方法
技术领域
本方案属于抑草菌领域,具体涉及一种康土抑草菌的制备方法。
背景技术
目前,国内外农业防治草害通常采用化学除草剂---草甘膦。它是一种常用的灭生性有机磷化学除草剂,随着草甘膦化学除草剂的大量施用,其对生态环境造成的负面影响逐渐显现,使得环境受到严重污染,还使得作物或非靶标生物及后茬作物产生药害,长期施用还可使得杂草产生抗性,除草效果降低。草甘膦的危害主要表现在对土壤微生物的影响,对水生生物鱼类的毒性,以及它在土壤中易吸附、难降解。草甘膦能够在土壤中吸附、迁移,并通过扩散转移到水体,对环境和生物产生影响,并且能够通过生物富集对人体产生影响。当施用高浓度草甘膦后,土壤微生物数量普遍会降低,微生物活性被抑制,草甘膦进入水体中,对水生生物也会产生一定的毒害影响。动物畜禽误饮被草甘膦污染的水或者误食被草甘膦污染的食物都会造成畜禽中毒。在喷洒草甘膦时,当人们防护不当药液直接与人体接触又或者污染饮食而进入人体后会危害人体健康,人体吸入雾液也会导致呼吸系统不适,眼睛接触雾液还会引起结膜炎,皮肤接触雾液会引发皮肤炎症。因此,我们迫切需要发明一种更为生态友好的方法、产品来进行农业草害的防治。
众所周知,化学农药污染程度高,环境危害大,破坏生态平衡,农副产品中的药残对人类造成直接威胁。一些长期使用化学除草剂的地块出现了残留累积的现象,严重影响后茬作物的生长,危害土壤生境,破坏生态环境,而生物农药是一种利用生物活体或其代谢产物对靶标生物进行防治的一类农药制剂,其具有对非靶标生物安全,选择性强,对人畜及有益动物无伤害,对生态环境无影响等优点,成为目前本领域技术人员研究的热点。
因此,急需一种具有除草活性、适应性强、稳定性好、不易老化的抑草菌,并合理利用特种植物提取物与微生物与微生物代谢产物及微生物酶之间的协同作用,通过发酵技术生产,可实现工业化生产,用于有机绿色可持续农业种植业,可有效保护生态环境,避免人畜及有益动物伤害,具有发展成为防治农业草害及土壤修复的新型绿色除草剂的潜力,市场前景广阔。
发明内容
本方案的目的在于提供一种康土抑草菌的制备方法,以解决使用化学除草剂对生态环境有不良影响的问题。
为了达到上述目的,本方案提供一种康土抑草菌的制备方法,包括以下步骤:
步骤S10:从广西国有高峰林场桉树人工林中,选择杂草密度大且有零散杂草枯萎的地块进行土壤取样;
步骤S20:用灭菌药匙取10克土样加入装有玻璃珠的盛有100ML无菌水三角瓶中,塞上硅胶塞,在室温条件下置于摇床200转每分钟震荡洗涤30分钟,此样品浓度记为10-1稀释液,吸取1ML稀释液加入到装有9ML无菌水试管中,充分混均,此时的溶液浓度记为10-2稀释液,以同样的方法依次进行稀释,将土样稀释为10-5稀释液;然后在超净工作台内将浓度为10-3、10-4和10-5三个不同稀释度的稀释液用移液枪移取200微升涂布于高氏一号培养基中,所述高氏一号培养基中加入有浓度为50毫克每升的重铬酸钾,各个浓度培养重复三次;将上述接种过土壤悬液的平板倒置与30摄氏度恒温培养箱中,培养7天;
步骤S30:依据菌落形态产孢的特征,挑选具有链霉菌典型菌落的单菌落进行重复平板划线,直到平板上长出的菌落外部形态一致,从而获得链霉菌单菌落;
步骤S40:将典型链霉菌菌落分别接种到发酵培养基,进行发酵,并得到其发酵上清液;
步骤S50:将上述发酵上清液滴加于无菌滤纸片上,以枯草芽孢杆菌为检定菌,滤纸片置于培养基平板上,在滤纸片另侧相距1厘米处放置一片含谷氨酰胺的滤纸片,于34摄氏度培养24小时,选择对检定菌有抑制作用,且在谷氨酰胺滤纸片一侧抑菌圈消失的菌株,从而获得对谷氨酰胺生物合成有竞争抑制作用的链霉菌;
步骤S60:通过US-EMS复合诱变,重复上述试验,直至筛选到具有高除草活性的生产菌株,命名为A菌株;
步骤S70:将A菌株的斜面菌株接入灭菌的种子培养基,在30摄氏度200转每分钟摇床震荡培养36小时,得到A种子液;
步骤S80:将A种子液以1%的接种量接入一级种子灌灭菌培养基中,在30摄氏度转速100-360转每分钟,无菌空气通气量0.1-0.5v/vmin,灌压0.03MP的条件下培养30小时,得到B种子液;
步骤S90:将B种子液以6%的接种量接入二级发酵灌灭菌培养基,在温度26-30摄氏度转速150-300转每分钟,无菌空气通气量0.2-0.8v/vmin,灌压0.03-0.06MP的条件下培养72小时;
步骤S100:每隔24小时向发酵液流加发酵总重量5%灭菌营养液,再在步骤S90的条件下培养144小时,即得抑草菌发酵母液。
本方案利用微生物及其代谢产物来防治农业草害,改良土壤,与人工及机械除草相比,其具有投资少、经济效益高、有效期长等优点。与化学除草剂草甘膦相比,其具有对环境安全,相容性好,对作物不产生药害,不但对土壤无污染,同时还可以改良土壤促进作物成长。对人和动物安全无影响,符合可持续绿色发展的要求。
进一步,还包括步骤S110:取步骤S90中的剩余的种子液,并加入淀粉制成固态的球状空心培养基;然后利用注射器往球状空心培养基中注入抑草菌发酵母液,之后将可降解的膜包覆在球状空心培养基的表面。①相对于传统的将抑草菌发酵母液稀释后喷洒的方式,将抑草菌发酵母液注入到球状空心培养基内,可以直接丢到土壤里,对草的根部进行抑制,这样抑草效果更好;②由于不用喷洒,不会被叶子或者农作物的叶子挡住,可大幅度的减少浪费。③利用步骤S90中剩余的种子液并加入淀粉制成固态的球状空心培养基,可以为抑草菌提供持续的养分,这样可大幅度增加本抑草菌的效果时间,同时也算是废物利用,大幅度的节约了成本;④可降解的膜的设置,可使得施药时机非常可控,如果需要让其晚一点生效,正常投放即可,如果需要其立马生效,则可撕坏表面的膜即可,非常的方便;⑤由于是采用注射器进行注入的,注入的时候会留下一个注射口,注射口的设置,一方面可保证可降解膜降解后球状空心培养基不会处于密封的状态,抑菌能出一个正常的工作状态;另一方面注射口的尺寸也不会过大,可避免球状空心培养基内的抑草菌快速的流失,最后,这些功能都是本身注射这个流程带来的好处,也就是说无需额外的工序即可达成,非常方便。
进一步,还包括步骤S120:制作尺寸更大的固态的球状空心培养基,同时将步骤S110中制作的产品包覆其中,转动外层的球状空心培养基,然后利用注射器往球状空心培养基中注入抑草菌发酵母液,注射完成后,往复移动注射器至少3次,确保注射口不会闭合,之后将可降解的膜包覆在球状空心培养基的表面。多层的结构可进一步的增加本抑草菌的时效,可长时间的抑制杂草,效果更好。在步骤中,通过转动外层的球状空心培养基后再进行注射,这样就保证了内外的注射口不处于同一位置,一定程度上也是避免了抑草菌快速跑出,从而增加了产品的时效性。球状空心培养基虽然是固态的,但是有一定的延展性,形态不会完全固定。而往复移动注射器至少3次,这样可以确保注射口不会闭合,则可以保证抑草菌持续的慢慢的出去。
进一步,所述步骤S40中的发酵条件为:在30摄氏度,200转每分钟摇床震荡培养5天,发酵的培养基按重量份比(每千份溶液)包括,糖蜜5份、胰蛋白胨5份、酵母膏5份、大豆油2份、甘油2份、磷酸氢二钾1份、硫酸镁0.5份、氯化钠0.1份和微量元素液1份。该发酵条件下的发酵效果最好。
进一步,所述微量元素液按重量份比(每千份溶液)包括:硼酸1.5份、氯化铁1份、氯化锰0.8份、氯化锌0.06份、氯化铜0.1份、钼酸钠0.2份、氯化钴0.01份和氯化镍0.01份。
进一步,在步骤S50和S60之间,还设有步骤S55:试验其发酵上清液喷洒于杂草叶面,进行除草活性验证,选择喷药后2-3天内杂草叶片边缘开始卷曲,随后发黄,7-10天后逐渐枯萎的链霉菌株作为出发菌株。增加了验证的程序,最大程度的保证了抑菌剂的效果。
进一步,所述步骤S80中的一级种子灌灭菌培养基,按照重量份比(每千份溶液)包括:淀粉5份、葡萄糖5份、糖蜜20份、胰蛋白胨10份、酵母膏5份、磷酸氢二钾2份、硫酸镁0.5份、氯化钠1份、大豆油2份。
进一步,步骤S90中,所述二级发酵灌灭菌培养基按重量份比(每千份溶液)包括:糖蜜5份、甘油4份、胰蛋白胨5份、大豆蛋白胨2份、酵母膏5份、磷酸氢二钾1份、硫酸镁0.5份、氯化钠1份、大豆油2份、吐温80 0.5份、萘啶酮酸0.01份、生物素0.0001份、微量元素液5份。
附图说明
图1为本发明实施例中康图抑草菌的结构示意图。
图2为本发明实施例中康图抑草菌的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细的说明:
说明书附图中的附图标记包括:可降解膜10、球状空心培养基20、注射口21、抑草菌发酵母液30。
实施例基本如附图1所示:
本实施例提供一种康土抑草菌,最外层为可降解的薄膜,中间为球状空心培养基20,球状空心培养基20的侧壁上通过注射器设有一个注射口21,并且其内部设有抑草菌发酵母液30。当然,这个是最基础的版本,为了增加产品的时效性,可将该产品做成多层的结构。如图2所示,用同样的材料做一个更大的球状空心培养基20,将最基础的版本放入其中,然后再注入抑草菌发酵母液30,最后再封上一层薄薄的可降解膜10。需要注意的是,要将内外的球状空心培养基20的注射口21错开,这样可增加产品的时效性。另外,为了塑性,可以考虑在最内部的球状空心培养基20设置几根支柱。这样的结构还可以继续扩展,具体的本领域的技术人员根据实际需求进行调整即可。
该康土抑草菌的制备方法包括以下步骤:
步骤S10:从广西国有高峰林场桉树人工林中,选择杂草密度大且有零散杂草枯萎的地块进行土壤取样;
步骤S20:用灭菌药匙取10克土样加入装有玻璃珠的盛有100ML无菌水三角瓶中,塞上硅胶塞,在室温条件下置于摇床200转每分钟震荡洗涤30分钟,此样品浓度记为10-1稀释液,吸取1ML稀释液加入到装有9ML无菌水试管中,充分混均,此时的溶液浓度记为10-2稀释液,以同样的方法依次进行稀释,将土样稀释为10-5稀释液;然后在超净工作台内将浓度为10-3、10-4和10-5三个不同稀释度的稀释液用移液枪移取200微升涂布于高氏一号培养基中,所述高氏一号培养基中加入有浓度为50毫克每升的重铬酸钾,各个浓度培养重复三次;将上述接种过土壤悬液的平板倒置与30摄氏度恒温培养箱中,培养7天;
步骤S30:依据菌落形态产孢的特征,挑选具有链霉菌典型菌落的单菌落进行重复平板划线,直到平板上长出的菌落外部形态一致,从而获得链霉菌单菌落;
步骤S40:将典型链霉菌菌落分别接种到发酵培养基,进行发酵,并得到其发酵上清液。发酵条件为:在30摄氏度,200转每分钟摇床震荡培养5天,发酵的培养基按重量份比(每千份溶液)包括,糖蜜5份、胰蛋白胨5份、酵母膏5份、大豆油2份、甘油2份、磷酸氢二钾1份、硫酸镁0.5份、氯化钠0.1份和微量元素液1份,所微量元素液按重量份比(每千份溶液)包括:硼酸1.5份、氯化铁1份、氯化锰0.8份、氯化锌0.06份、氯化铜0.1份、钼酸钠0.2份、氯化钴0.01份和氯化镍0.01份。
步骤S50:将上述发酵上清液滴加于无菌滤纸片上,以枯草芽孢杆菌为检定菌,滤纸片置于培养基平板上,在滤纸片另侧相距1厘米处放置一片含谷氨酰胺的滤纸片,于34摄氏度培养24小时,选择对检定菌有抑制作用,且在谷氨酰胺滤纸片一侧抑菌圈消失的菌株,从而获得对谷氨酰胺生物合成有竞争抑制作用的链霉菌;
步骤S55:将上述发酵上清液滴加于直径6毫米无菌滤纸片上,以枯草芽孢杆菌CGMCC1.88为检定菌,滤纸片置于培养基平板上,在滤纸片另侧相距1厘米处放置一片含谷氨酰胺的滤纸片,于34摄氏度培养24小时。选择对检定菌有抑制作用,且在谷氨酰胺滤纸片一侧抑菌圈消失的菌株,从而获得对谷氨酰胺生物合成有竞争抑制作用的链霉菌,试验其发酵上清液喷洒于杂草叶面,进行除草活性验证。选择喷药后2-3天内杂草叶片边缘开始卷曲,随后发黄,7-10天后逐渐枯萎的链霉菌株作为出发菌株;测定培养基成分为(每千份溶液):葡萄糖5份、柠檬酸铵2.5份、硫酸镁2份、氯化钠1份、磷酸二氢钾1.5份、磷酸氢二钾3.5份、琼脂20份。
步骤S60:通过US-EMS复合诱变,重复上述试验,直至筛选到具有高除草活性的生产菌株,命名为A菌株;
步骤S70:将A菌株的斜面菌株接入灭菌的种子培养基,在30摄氏度200转每分钟摇床震荡培养36小时,得到A种子液;
步骤S80:将A种子液以1%的接种量接入一级种子灌灭菌培养基中,在30摄氏度转速100-360转每分钟,无菌空气通气量0.1-0.5v/vmin,灌压0.03MP的条件下培养30小时,得到B种子液;一级种子灌灭菌培养基,按照重量份比(每千份溶液)包括:淀粉5份、葡萄糖5份、糖蜜20份、胰蛋白胨10份、酵母膏5份、磷酸氢二钾2份、硫酸镁0.5份、氯化钠1份、大豆油2份
步骤S90:将B种子液以6%的接种量接入二级发酵灌灭菌培养基,在温度26-30摄氏度转速150-300转每分钟,无菌空气通气量0.2-0.8v/vmin,灌压0.03-0.06MP的条件下培养72小时;
步骤S100:每隔24小时向发酵液流加发酵总重量5%灭菌营养液,再在步骤S90的条件下培养144小时,即得抑草菌发酵母液30;二级发酵灌灭菌培养基按重量份比(每千份溶液)包括:糖蜜5份、甘油4份、胰蛋白胨5份、大豆蛋白胨2份、酵母膏5份、磷酸氢二钾1份、硫酸镁0.5份、氯化钠1份、大豆油2份、吐温80 0.5份、萘啶酮酸0.01份、生物素0.0001份、微量元素液5份,灭菌营养液按重量份比(每千份溶液)包括:糖蜜300份、酵母膏100份、甘油40份。
步骤S110:取步骤S90中的剩余的种子液,并加入淀粉制成固态的球状空心培养基20;然后利用注射器往球状空心培养基20中注入抑草菌发酵母液30,注射完成后,往复移动注射器4次,确保注射口不会闭合,之后将可降解的膜包覆在球状空心培养基20的表面;
步骤S120:制作尺寸更大的固态的球状空心培养基20,同时将步骤S110中制作的产品包覆其中,转动外层的球状空心培养基20,然后利用注射器往球状空心培养基20中注入抑草菌发酵母液30,注射完成后,往复移动注射器4次,确保注射口不会闭合,之后将可降解的膜包覆在球状空心培养基20的表面。
本方案通过独特的培养基原料配比以及专门的工艺流程,利用生产的微生物及其代谢产物来防治农业草害,改良土壤,与人工及机械除草相比,其具有投资少、经济效益高、有效期长等优点。与化学除草剂草甘膦相比,其具有对环境安全,相容性好,对作物不产生药害,不但对土壤无污染,同时还可以改良土壤促进作物成长。对人和动物安全无影响,符合可持续绿色发展的要求。
以上所述的仅是本发明的实施例,方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明结构的前提下,还可以作出若干变形和改进,这些也应该视为本发明的保护范围,这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准,说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (8)

1.一种康土抑草菌的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S10:从广西国有高峰林场桉树人工林中,选择杂草密度大且有零散杂草枯萎的地块进行土壤取样;
步骤S20:用灭菌药匙取10克土样加入装有玻璃珠的盛有100ML无菌水三角瓶中,塞上硅胶塞,在室温条件下置于摇床200转每分钟震荡洗涤30分钟,此样品浓度记为10-1稀释液,吸取1ML稀释液加入到装有9ML无菌水试管中,充分混均,此时的溶液浓度记为10-2稀释液,以同样的方法依次进行稀释,将土样稀释为10-5稀释液;然后在超净工作台内将浓度为10-3、10-4和10-5三个不同稀释度的稀释液用移液枪移取200微升涂布于高氏一号培养基中,所述高氏一号培养基中加入有浓度为50毫克每升的重铬酸钾,各个浓度培养重复三次;将上述接种过土壤悬液的平板倒置与30摄氏度恒温培养箱中,培养7天;
步骤S30:依据菌落形态产孢的特征,挑选具有链霉菌典型菌落的单菌落进行重复平板划线,直到平板上长出的菌落外部形态一致,从而获得链霉菌单菌落;
步骤S40:将典型链霉菌菌落分别接种到发酵培养基,进行发酵,并得到其发酵上清液;
步骤S50:将上述发酵上清液滴加于无菌滤纸片上,以枯草芽孢杆菌为检定菌,滤纸片置于培养基平板上,在滤纸片另侧相距1厘米处放置一片含谷氨酰胺的滤纸片,于34摄氏度培养24小时,选择对检定菌有抑制作用,且在谷氨酰胺滤纸片一侧抑菌圈消失的菌株,从而获得对谷氨酰胺生物合成有竞争抑制作用的链霉菌;
步骤S60:通过US-EMS复合诱变,重复上述试验,直至筛选到具有高除草活性的生产菌株,命名为A菌株;
步骤S70:将A菌株的斜面菌株接入灭菌的种子培养基,在30摄氏度200转每分钟摇床震荡培养36小时,得到A种子液;
步骤S80:将A种子液以1%的接种量接入一级种子灌灭菌培养基中,在30摄氏度转速100-360转每分钟,无菌空气通气量0.1-0.5v/vmin,灌压0.03MP的条件下培养30小时,得到B种子液;
步骤S90:将B种子液以6%的接种量接入二级发酵灌灭菌培养基,在温度26-30摄氏度转速150-300转每分钟,无菌空气通气量0.2-0.8v/vmin,灌压0.03-0.06MP的条件下培养72小时;
步骤S100:每隔24小时向发酵液流加发酵总重量5%灭菌营养液,再在步骤S90的条件下培养144小时,即得抑草菌发酵母液。
2.根据权利要求1所述的一种康土抑草菌的制备方法,其特征在于,还包括步骤S110:取步骤S90中的剩余的种子液,并加入淀粉制成固态的球状空心培养基;然后利用注射器往球状空心培养基中注入抑草菌发酵母液,注射完成后,往复移动注射器至少3次,确保注射口不会闭合,之后将可降解的膜包覆在球状空心培养基的表面。
3.根据权利要求2所述的一种康土抑草菌的制备方法,其特征在于:还包括步骤S120:制作尺寸更大的固态的球状空心培养基,同时将步骤S110中制作的产品包覆其中,转动外层的球状空心培养基,然后利用注射器往球状空心培养基中注入抑草菌发酵母液,之后将可降解的膜包覆在球状空心培养基的表面。
4.根据权利要求1所述的一种康土抑草菌的制备方法,其特征在于:所述步骤S40中的发酵条件为:在30摄氏度,200转每分钟摇床震荡培养5天,发酵的培养基按重量份比包括,糖蜜5份、胰蛋白胨5份、酵母膏5份、大豆油2份、甘油2份、磷酸氢二钾1份、硫酸镁0.5份、氯化钠0.1份和微量元素液1份。
5.根据权利要求4所述的一种康土抑草菌的制备方法,其特征在于:所述微量元素液按重量份比包括:硼酸1.5份、氯化铁1份、氯化锰0.8份、氯化锌0.06份、氯化铜0.1份、钼酸钠0.2份、氯化钴0.01份和氯化镍0.01份。
6.根据权利要求1所述的一种康土抑草菌的制备方法,其特征在于:在步骤S50和S60之间,还设有步骤S55:试验其发酵上清液喷洒于杂草叶面,进行除草活性验证,选择喷药后2-3天内杂草叶片边缘开始卷曲,随后发黄,7-10天后逐渐枯萎的链霉菌株作为出发菌株。
7.根据权利要求1所述的一种康土抑草菌的制备方法,其特征在于:所述步骤S80中的一级种子灌灭菌培养基,按照重量份比包括:淀粉5份、葡萄糖5份、糖蜜20份、胰蛋白胨10份、酵母膏5份、磷酸氢二钾2份、硫酸镁0.5份、氯化钠1份、大豆油2份。
8.根据权利要求1所述的一种康土抑草菌的制备方法,其特征在于:步骤S90中,所述二级发酵灌灭菌培养基按重量份比包括:糖蜜5份、甘油4份、胰蛋白胨5份、大豆蛋白胨2份、酵母膏5份、磷酸氢二钾1份、硫酸镁0.5份、氯化钠1份、大豆油2份、吐温80 0.5份、萘啶酮酸0.01份、生物素0.0001份、微量元素液5份。
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