CN107384825A - 农用微生物制剂及其在克服烟田连作障碍方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种农用微生物制剂，是由霉菌制剂、放线菌制剂和细菌制剂按一定比例配制而成，其中霉菌制剂是在特殊制备的液体培养基中接种霉菌孢子，得到霉菌发酵液；再采用豆粕、玉米面、麸皮等制得霉菌菌剂制备培养基；将二者按比例混合并培养发酵，风干后粉碎即可；放线菌制剂和细菌制剂同样先制备液体培养基，并接本别种放线菌和细菌后得到放线菌和细菌发酵液；再分别将其与放线菌和细菌菌剂制备培养基按比例混合培养发酵，风干后粉碎即可。本发明制备的微生物制剂可有效防治烟草连作障碍，具有高效、增产稳定、对环境和食品安全以及成本低等优点，同时还可改善土壤理化性质，实现土地的可持续利用及符合现代农业可持续发展的要求。

Description

农用微生物制剂及其在克服烟田连作障碍方面的应用
技术领域
本发明涉及微生物制剂，尤其是涉及一种农用微生物制剂的制备，本发明还涉及该微生物制剂在克服烟田连作障碍方面的应用。
背景技术
中国现代种植业集约化、复种指数较高，土壤如果长时间的种植单一种类的作物，会导致连作障碍普遍发生且日益严重，这种现象已成为农业可持续发展中亟待解决的问题。
烟草属于茄科烟草属，是忌连作的作物。生产上，在同一块地上一般连续种植2年，第3年时连作障碍表现严重，第4年时连作障碍更加现严重，会使经济效益严重下降。烟草连作所产生的连作障碍主要表现在植株生长缓慢、植株矮小、产量和质量下降、烟叶成熟度变差，烤烟长期连作还导致土壤的理化性状恶化和生态环境改变，土壤微生物数量、群落结构改变，碳代谢功能多样性降低，土壤微生态失衡，致使烟草病害严重。在中国的主要烟草种植区，都存在严重的连作状况。随之所带来的连作障碍问题也日益严重，制约了烟草行业的健康与可持续发展。
目前，生产上解决连作障碍主要依赖农药和化肥的施用，有时也能在短期之内提高产量、控制病害；但从生态和环境保护的角度来看存在很大的弊端，譬如，污染农田土壤及水体环境，造成土壤微生态环境失衡，土壤理化性质恶化，最终导致烟叶品质下降等；而且也不能从根本上解决连作障碍问题。施用本发明的微生物菌剂可以对土壤原有的有益微生物产生一定的活化作用，并且本发明含有有机物，可以增加土壤中微生物可利用的营养物质，增加有益微生物数量与种类，能改善微生物区系和降低病原菌数量，协调植物、土壤和微生物三者之间的关系，从而有效防控烟草土传病害和减缓连作障碍。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷而提供一种绿色安全的农用微生物制剂，本发明还提供该微生物制剂在克服烟田连作障碍方面的应用。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的农用微生物制剂，是由霉菌制剂、放线菌制剂和细菌制剂按一定比例配制而成，其中：
霉菌制剂的制备方法为：
第一步，称量去皮马铃薯20份，加适量去离子水100℃煮沸10min，过滤得到溶剂100份；添加葡萄糖2份搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；
第二步，取第一步制备的液体培养基在无菌操作台上按8.33×102-1.25×103个/mL孢子的接种量接种一接种环的霉菌孢子，封口包装后放入28℃摇床内培养4天，得到霉菌发酵液，静止5天，使液面形成一层孢子后待用；
第三步，准确称量豆粕10份，玉米面40份，麸皮20份，锯末30份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到霉菌菌剂制备培养基；
第四步，将第三步制备的霉菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的霉菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入28℃培养箱中培养一周，接种后每2天搅拌一次，发酵完成后使固体菌剂中的孢子数达到（1.01×1012-6.03×1012个/mL），于阴凉处风干，之后粉碎成粉末状，得到成品霉菌制剂；
放线菌制剂的制备方法为：
第一步，准确称量可溶性淀粉2份，氯化钠0.05份，磷酸氢二钾0.05份，硫酸镁0.05份，硫酸铁0.001份，硝酸钾0.1份，加去离子水100份，搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；
第二步，取第一步制备的液体培养基在无菌操作台上按3.56×103-4.48×103个/mL的接种量接种一接种环的放线菌，封口包装后放入30℃摇床内培养一周，得到活菌数为 2.0×109cfu/g的放线菌发酵液；
第三步，准确称量豆粕20份，玉米面40份，麸皮20份，锯末20份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到放线菌菌剂制备培养基；
第四步，将第三步制备的放线菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的放线菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入30℃培养箱中培养一周，接种后每2天搅拌一次，共搅拌2次，发酵成功后使菌剂制备培养基中活菌数达到（1.0×109-1.6×1010cfu/g），放在阴凉处风干，粉粹形成粉末状，得到成品放线菌制剂；
细菌制剂的制备方法为：
第一步，准确称量牛肉膏0.5份，蛋白胨1份，氯化钠0.5 份，加去离子水100份，搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；
第二步，取第一步制备的液体培养基在无菌操作台上按1.35×103-2.03×103个/mL的接种量接种一接种环的细菌，封口包装后放入36℃摇床内培养24小时，得到活菌数为 5.5×108cfu/g的细菌发酵液；
第三步，准确称量豆粕18份，玉米面30份，麸皮32份，锯末20份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到细菌菌剂制备培养基；
第四步，将第三步制备的细菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的细菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入36℃培养箱中培养24h，发酵成功后使固体菌剂培养基中活菌数达到（1.01×1010~2.95×1010 cfu/g），放在阴凉处风干，粉粹成粉末状，得到成品细菌制剂。
本发明所用的霉菌为哈茨木霉、绿色木霉、嗜热侧孢霉；细菌为多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌y1、荧光假单胞菌、胶冻样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌c3和固氮菌—克雷伯氏菌x3；放线菌为细黄链霉菌。
本发明霉菌制剂可以为一种单独的霉菌制剂，也可以将两种以上霉菌制剂复合后使用；同样的，本发明的细菌制剂可以为一种单独的细菌制剂，也可以将两种以上细菌制剂复合后使用。
本发明的农用微生物制剂在克服烟田连作障碍方面的应用。
本发明制备的微生物制剂与化肥、有机肥及绿肥不同，它是一种活体制品，具有高效、增产稳定、对环境和食品安全以及修复土壤连作障碍效果好、成本低等优点，同时还可改善土壤理化性质，实现土地的可持续利用及符合现代农业可持续发展的要求。
本发明研制的农用微生物制剂根据微生物菌群能有利于活跃土壤中有益菌群的特性，并结合植物、土壤和微生物之间的相互作用构成植物-土壤-微生物的根际微生态系统，从而能够有效防控烟田连作障碍方面的问题；本发明使用的细菌、霉菌和放线菌能直接和间接的促进植物生长及调节土壤环境，增加根际可利用的营养；能够减轻或抑制植物病原微生物的发生、与病原微生物争夺营养和生态位、使植物获得系统性抗病性等优势。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明微生物制剂的制备方法及其使用方法进行详细介绍。
一、本发明所述的农用微生物制剂，是由霉菌制剂、放线菌制剂和细菌制剂按一定比例配制而成，其中：
霉菌制剂的制备方法为：
第一步，称量去皮马铃薯20份，加适量去离子水100℃煮沸10min，过滤得到溶剂100份；添加葡萄糖2份搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；
第二步，取第一步制备的液体培养基在无菌操作台上按8.33×102-1.25×103个/mL孢子的接种量接种一接种环的霉菌孢子，封口包装后放入28℃摇床内培养4天，得到霉菌发酵液，静止5天，使液面形成一层孢子后待用；
第三步，准确称量豆粕10份，玉米面40份，麸皮20份，锯末30份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到霉菌菌剂制备培养基；
第四步，将第三步制备的霉菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的霉菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入28℃培养箱中培养一周，接种后每2天搅拌一次，发酵完成后使固体菌剂中的孢子数达到（1.01×1012-6.03×1012个/mL），于阴凉处风干，之后粉碎成粉末状，得到成品霉菌制剂；
放线菌制剂的制备方法为：
第一步，准确称量可溶性淀粉2份，氯化钠0.05份，磷酸氢二钾0.05份，硫酸镁0.05份，硫酸铁0.001份，硝酸钾0.1份，加去离子水100份，搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；
第二步，取第一步制备的液体培养基在无菌操作台上按3.56×103-4.48×103个/mL的接种量接种一接种环的放线菌，封口包装后放入30℃摇床内培养一周，得到活菌数为 2.0×109cfu/g的放线菌发酵液；
第三步，准确称量豆粕20份，玉米面40份，麸皮20份，锯末20份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到放线菌菌剂制备培养基；
第四步，将第三步制备的放线菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的放线菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入30℃培养箱中培养一周，接种后每2天搅拌一次，共搅拌2次，发酵成功后使菌剂制备培养基中活菌数达到（1.0×109-1.6×1010cfu/g），放在阴凉处风干，粉粹形成粉末状，得到成品放线菌制剂；
细菌制剂的制备方法为：
第一步，准确称量牛肉膏0.5份，蛋白胨1份，氯化钠0.5 份，加去离子水100份，搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；
第二步，取第一步制备的液体培养基在无菌操作台上按1.35×103-2.03×103个/mL的接种量接种一接种环的细菌，封口包装后放入36℃摇床内培养24小时，得到活菌数为 5.5×108cfu/g的细菌发酵液；
第三步，准确称量豆粕18份，玉米面30份，麸皮32份，锯末20份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到细菌菌剂制备培养基；
第四步，将第三步制备的细菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的细菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入36℃培养箱中培养24h，发酵成功后使固体菌剂培养基中活菌数达到（1.01×1010~2.95×1010 cfu/g），放在阴凉处风干，粉粹成粉末状，得到成品细菌制剂。
二、本发明农用微生物制剂的性能实验
1、农用微生物制剂的制备（按本发明方法制备）
1）绿色木霉生物制剂单独使用，称为T1。
2）多粘类芽孢杆菌生物制剂单独使用，称为T2。
3）霉菌制剂为哈茨木霉制剂，细菌制剂为枯草芽孢杆菌c3制剂，克雷伯氏菌x3（固氮菌）制剂和枯草芽孢杆菌y1制剂，由哈茨木霉制剂，枯草芽孢杆菌c3制剂，克雷伯氏菌x3制剂和枯草芽孢杆菌y1制剂按3︰1︰3︰1之重量份配比配制的农用微生物制剂成为T3。
4）霉菌制剂为嗜热侧孢霉制剂，细菌制剂为枯草芽孢杆菌c3制剂、克雷伯氏菌x3（固氮菌）制剂、枯草芽孢杆菌y1制剂和荧光假单胞菌制剂，放线菌制剂为细黄链霉菌制剂；由嗜热侧孢霉制剂，枯草芽孢杆菌c3制剂，克雷伯氏菌x3制剂，枯草芽孢杆菌y1制剂，荧光假单胞菌制剂，细黄链霉菌制剂按3︰1︰3︰1︰2︰2之重量份配比配制的农用微生物制剂称为T4。
5）霉菌制剂为哈茨木霉制剂和嗜热侧孢霉制剂，细菌制剂为枯草芽孢杆菌c3制剂、克雷伯氏菌x3（固氮菌）制剂和枯草芽孢杆菌y1制剂，放线菌制剂为细黄链霉菌制剂，由哈茨木霉制剂，嗜热侧孢霉制剂，枯草芽孢杆菌c3制剂，克雷伯氏菌x3制剂，枯草芽孢杆菌y1制剂，细黄链霉菌制剂按2︰1︰1︰3︰1︰2之重量份配比配制的农用微生物制剂称为T5。
6）霉菌制剂为绿色木霉制剂和嗜热侧孢霉制剂，细菌制剂为枯草芽孢杆菌c3制剂、克雷伯氏菌x3（固氮菌）制剂、枯草芽孢杆菌y1制剂和荧光假单胞菌制剂；放线菌制剂为细黄链霉菌制剂，由绿色木霉制剂，嗜热侧孢霉制剂，枯草芽孢杆菌c3制剂，克雷伯氏菌x3制剂，枯草芽孢杆菌y1制剂，荧光假单胞菌制剂，细黄链霉菌制剂按2︰1︰1︰3︰1︰2︰2之重量份配比配制的农用微生物制剂称为T6。
7）霉菌制剂为嗜热侧孢霉制剂，细菌制剂为枯草芽孢杆菌c3制剂、克雷伯氏菌x3制剂、枯草芽孢杆菌y1制剂和荧光假单胞菌制剂，放线菌制剂为细黄链霉菌制剂，由嗜热侧孢霉制剂，枯草芽孢杆菌c3制剂，克雷伯氏菌x3制剂，枯草芽孢杆菌y1制剂，荧光假单胞菌制剂，细黄链霉菌制剂按1︰1︰1︰1︰1︰1之重量份配比配制的农用微生物制剂称为T7。
8）霉菌制剂为绿色木霉制剂，细菌制剂为枯草芽孢杆菌c3制剂，克雷伯氏菌x3制剂和枯草芽孢杆菌y1制剂，由绿色木霉制剂，枯草芽孢杆菌c3制剂，克雷伯氏菌x3制剂和枯草芽孢杆菌y1制剂按3︰1︰3︰1之重量份配比配制的农用微生物制剂称为T8。
9）细菌制剂为克雷伯氏菌x3制剂和胶冻样芽孢杆菌制剂，放线菌制剂为细黄链霉菌制剂，由克雷伯氏菌x3制剂，胶冻样芽孢杆菌制剂和细黄链霉菌制剂按1︰1︰1之重量份配比配制的农用微生物制剂称为T9。
10）霉菌制剂为绿色木霉制剂和哈茨木霉制剂，细菌制剂为克雷伯氏菌x3制剂和枯草芽孢杆菌y1制剂，由绿色木霉制剂，哈茨木霉制剂，克雷伯氏菌x3制剂和枯草芽孢杆菌y1制剂按1.5︰1.5︰3︰1之重量份配比配制的农用微生物制剂称为T10。
11）将制备的多粘类芽孢杆菌生物制剂（T2）和发酵豆浆配合使用，称为T11。
2、烟田试验
选用平顶山市叶县邓李乡烟站连作4年的烟田作为实验用地，选用中烟100烟苗作为实验对象。
将试验地分成14个小区，每小区面积为18 m2：设3个对照，不施加任何药剂的为阴性对照CK1，采用生产上常用的防病、防重茬措施施加质量分数为68%丙森甲霜灵可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、中烟重茬宝等为阳性对照CK2，单独使用枯草芽孢杆菌生物制剂为阳性对照CK3；其余11小区施加上述制备的生物制剂T1~ T11。实验重复3次。
育苗定植时各处理区域分别施加500 g 各种制剂，与烟苗周围的土壤充分混匀。在生长旺盛期（在河南，一般在6月中旬）在根系周围再追加一次制剂，T11除了追加生物菌剂之外，每株烟苗灌入豆浆500 mL于根系周围。对照CK1不施加任何农药和微生物制剂，对照CK2按照叶县烟草公司列出的针对当地对烟草管理制定的防重茬、防病虫害的农药进行实施，对照CK3施加枯草芽孢杆菌生物制剂。
试验过程中，对照和处理采取相同田间管理，缓苗后，每隔一段时间测量不同处理烟草的茎粗、株高、叶长、叶宽、及生长结束时测定各处理的主根长、烟叶产量、发病率及死亡率，生长周期结束时测定土壤中主要酶活性和土壤中各大类微生物数量。并以此为指标评价微生物制剂对克服烟田连作障碍的田间应用效果。
本发明的生物制剂对烟草生长及连作烟田中烟草发病情况见表1、表2、表3和表4。
表1 施用本发明制剂对烟草植株生和发病情况的影响（栽后50天）
从表1可以得出：在烟草生长旺盛期（栽苗后50天）时，从茎粗、株高、叶长、叶宽来看，T1-T11的效果均优于CK2和CK3，这说明本发明制剂在烟草生长方面具有促进作用；从发病率来看，施加本发明的微生物制剂的发病率均有所降低，其效果优于生产上常用的防治方法（CK2）和单独使用枯草芽孢杆菌（CK3）。
表2 施用本发明制剂对烟草生长、产量、发病情况的影响（栽后80天）
从表2可以得出：烟草生长周期接近结束时茎粗、株高、叶长、叶宽以及主根长来看，T1-T11的效果均优于CK2和CK3，这说明本发明制剂在烟草生长方面具有促进作用；从生长周期结束时烟叶产量来看，T1-T11的烟叶产量均高于CK2和CK3，说明本发明的微生物制剂也具有增加产量的作用；从发病率和死亡率来看，施加本发明的微生物制剂的发病率和死亡率均有所降低，其效果优于生产上常用的防治方法（CK2）和单独使用枯草芽孢杆菌（CK3）。说明本发明的微生物制剂对烟草连作障碍能起到一定的抑制作用。
表3 施加本发明制剂对烟苗根际土壤中微生物数量的影响 ×106 CFU/g
由表3可以得出：施加本发明的微生物制剂对增加烟草根际微生物（细菌、放线菌、酵母）的数量和减少大多数为致病菌的霉菌的数量有比较好的作用，其效果优于生产上常用的防治方法（CK2）和单独使用枯草芽孢杆菌（CK3）。土壤微生物在土壤系统中参与土壤有机质分解、腐殖质的形成、土壤养分转化和循环等过程，能够反映土壤生态环境的变化；土壤中细菌、放线菌和酵母菌有利于丰富土壤有益菌群的数量，而霉菌多为致病菌，其数量的减少，有利于降低烟草病害的发生率。通过施加本发明的微生物制剂，能有效减少霉菌数量和增加细菌、放线菌及酵母菌数量。所以，本发明的制剂能够有效地促进连作烟田有益微生物菌群的积累，有利于调节土壤微环境抑制有害菌群的数量从而达到防治烟草病害发生的目的。
表4 施加本发明微生物制剂对土壤理化指标的影响
由表4可以得出：施加本发明微生物制剂对于增加土壤中各种酶活性以及提高有机质的含量有所帮助，各项指标均高于生产上常用的田间管理方法（CK2）和单独枯草芽孢杆菌的CK3。土壤酶活性反映了土壤养分的转化效率，其活性的提高有利于土壤养分转化效率的提高。所以，在烟田使用本发明的微生物制剂更能有助于土壤养分的转化。土壤中有机质含量的高低决定着土壤肥力的高低，所以，本发明制剂对提高土壤肥力方面也有帮助。
综上所述，施加本发明的微生物制剂能促进烟草生长，提高烤烟产量，减少病害发生，降低烟草死亡率，对烟草连作所带来的连作障碍的缓解有一定的效果，优于生产上常用的预防烟草连作障碍的方法。

Claims (4)

1.一种农用微生物制剂，其特征在于：是由霉菌制剂、放线菌制剂和细菌制剂按一定比例配制而成，其中：
霉菌制剂的制备方法为：
第一步，称量去皮马铃薯20份，加适量去离子水100℃煮沸10min，过滤得到溶剂100份；添加葡萄糖2份搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；
第二步，取第一步制备的液体培养基在无菌操作台上按8.33×102-1.25×103个/mL孢子的接种量接种一接种环的霉菌孢子，封口包装后放入28℃摇床内培养4天，得到霉菌发酵液，静止5天，使液面形成一层孢子后待用；
第三步，准确称量豆粕10份，玉米面40份，麸皮20份，锯末30份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到霉菌菌剂制备培养基；
第四步，将第三步制备的霉菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的霉菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入28℃培养箱中培养一周，接种后每2天搅拌一次，发酵完成后，于阴凉处风干，之后粉碎成粉末状，得到成品霉菌制剂；
放线菌制剂的制备方法为：
第一步，准确称量可溶性淀粉2份，氯化钠0.05份，磷酸氢二钾0.05份，硫酸镁0.05份，硫酸铁0.001份，硝酸钾0.1份，加去离子水100份，搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；
第二步，取第一步制备的液体培养基在无菌操作台上按3.56×103-4.48×103个/mL的接种量接种一接种环的放线菌，封口包装后放入30℃摇床内培养一周，得到活菌数为 2.0×109cfu/g的放线菌发酵液；
第三步，准确称量豆粕20份，玉米面40份，麸皮20份，锯末20份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到放线菌菌剂制备培养基；
第四步，将第三步制备的放线菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的放线菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入30℃培养箱中培养一周，接种后每2天搅拌一次，共搅拌2次，发酵成功后，放在阴凉处风干，粉粹形成粉末状，得到成品放线菌制剂；
细菌制剂的制备方法为：
第一步，准确称量牛肉膏0.5份，蛋白胨1份，氯化钠0.5 份，加去离子水100份，搅拌均匀后封口121℃灭菌，冷却后得到液体培养基；
第二步，取第一步制备的液体培养基在无菌操作台上按1.35×103-2.03×103个/mL的接种量接种一接种环的细菌，封口包装后放入36℃摇床内培养24小时，得到活菌数为 5.5×108cfu/g的细菌发酵液；
第三步，准确称量豆粕18份，玉米面30份，麸皮32份，锯末20份，添加去离子水50~70份，搅拌均匀后，封口121℃灭菌，冷却后得到细菌菌剂制备培养基；
第四步，将第三步制备的细菌菌剂制备培养基中加入第二步制备的细菌发酵液20份，搅拌均匀后封口放入36℃培养箱中培养24h，发酵成功后，放在阴凉处风干，粉粹成粉末状，得到成品细菌制剂。
2.根据权利要求1所述的农用微生物制剂，其特征在于：所述霉菌为哈茨木霉、绿色木霉、嗜热侧孢霉；所述细菌为多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌y1、荧光假单胞菌、胶冻样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌c3和固氮菌—克雷伯氏菌x3；所述放线菌为细黄链霉菌。
3.根据权利要求1所述的农用微生物制剂，其特征在于：所述霉菌制剂为一种霉菌制剂或两种以上霉菌制剂复合而成；所述细菌制剂为一种细菌制剂或两种以上细菌制剂复合而成。
4.权利要求1-3中任一项所述的农用微生物制剂在克服烟田连作障碍方面的应用。
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