CN114480210A - 一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治理盐碱化促进棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，其包括有以下步骤（1）制备微胶囊骨架主料；（2）构建复合菌群体系；（3）制备中空微胶囊；（4）制备复合菌微胶囊。步骤（1）通过棉秆中提取出纤维素并出制备微胶囊骨架材料，充分回收利用了农业废弃物棉秆，绿色环保节约成本，且制备的微胶囊缓释效果佳，使用本发明制备方法制得的复合菌群微生物不仅可以调节盐碱地的碱度而且可以促进棉花生长，增强棉花再盐胁迫下的存活率。本发明将Rs‑198菌、绿针假单胞菌R5菌和枯草芽孢杆菌GB03制成复合菌群，制得的复合菌群相比于单一的菌种在调理盐碱地土壤，通过协同作用产生1+1＞2的作用。
Description
技术领域
本发明涉及棉花种植技术领域，特别是涉及一种治理盐碱化促进棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法。
背景技术
棉花是国家的重要战略物资。新疆种植的棉花大约有4500万亩，是我国最适宜棉区和最大的优质商品棉生产基地．每年种植棉花面积140万hm2以上。近年来，由于蒸发量大且滴灌技术大面积采用在一定程度上加重了新疆土壤次生盐渍化，使盐胁迫成为了影响新疆棉花高产和稳产的一个重要因素。研究者把盐碱土对植物生长的限制因素统称为盐胁迫。盐胁迫主要有以下几个方面：离子胁迫、水分胁迫、氧胁迫、营养胁迫，其中离子胁迫是原初因素，另外三种胁迫都是伴生因素，都是由土壤中的盐离子所导致。离子胁迫是在盐化土壤中盐离子浓度较高的情况下，首先，会破坏细胞的离子平衡，干扰离子代谢，影响其它离子的吸收，如K＋和Ca2＋的吸收，因而造成植物缺乏K和Ca元素。其次，细胞中Na＋和Cl－的浓度增高以后，植物细胞会产生毒害作用，抑制酶的活性，干扰植物正常代谢，使植物中毒。同时，盐胁迫下植物生长在含盐较高的土壤中，面临的问题是原有的水分平衡被打破。土壤盐分过多，使植物根际土壤溶液渗透势降低，根细胞渗透势相对升高，从而给植物造成一种水逆境，使植物吸收水分困难，严重时还造成细胞组织的水分外渗，抑制作物的萌发与生长。
因此，针对现有技术中的存在问题，亟需提供一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊制备技术。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术中的不足之处而提供一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
提供一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊制备方法，包括有以下主要步骤：
（1）制备微胶囊骨架主料
1.1将棉秆进行粉碎、脱灰、脱蜡并干燥制得棉秆粉末；
1.2 将60~80%硫酸、棉秆粉末和γ-戊内酯按1:10:100投料，混合均匀、加热搅拌一段时间，水洗至中性并过滤收集滤渣；
1.3 将步骤1.2的滤渣用去离子水煮沸，加入质量分数为15%氢氧化钠溶液再煮沸得到浆料；
1.4按照质量比为1:2:2取浆料、次氯酸钠、过氧化氢混合，搅拌反应一段时间后，用稀盐酸酸化后滤出，分别收集滤渣和滤液；
1.5 往步骤1.4的滤渣加入氢氧化钠溶液反应制得碱性纤维素；将碱性纤维素和氯乙烷投入加压釜，在220℃温度下与4Mpa压力下进行反应获得骨架主料；
（2）构建复合菌群体系
2.1将1.4步骤制得的滤液pH值调节为中性，加入过量的70%乙醇，过滤收集不溶物并洗涤干燥获得半纤维素；
2.2 制备培养基料：半纤维素、葡萄糖和海藻酸钠混合均匀；
2.3 将Rs-198菌株、绿针假单胞菌R5菌株、枯草芽孢杆菌GB03菌株培养至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，发酵培养至对数生长期，后制成微生物混合液；
（3）制备中空微胶囊
3.1 将步骤（1）制备获得的骨架主料、聚乙烯加入到有机溶剂环已烷中，骨架主料、聚乙烯和环已烷的质量比为1:1:1.5，开动电动搅拌器加热搅拌，获得骨架浆料；
3.2制备CaCO3微粒芯材：将CaCl2溶液和Na2CO3溶液充分混合并恒温超声分散；
3.3按照质量比1:2取步骤3.2的CaCO3微粒芯材和3.1步骤制备的骨架浆料混合搅拌；
3.4冷却至室温使微胶囊固化后过滤回收微胶囊，再环已烷洗涤收集微胶囊；
3.5 将3.4步骤制备的浓度为5~10%微胶囊使用柠檬酸处理后水洗至中性，获得中空微胶囊溶液；
（4）制备复合菌微胶囊
4.1 步骤2.2的培养基料和步骤2.3微生物混合液液滴加到步骤（3）制备的中空微胶囊溶液中，静置固化后粉碎制得复合菌微胶囊。
优选的，步骤1.2中，加热温度控制在80~100℃，搅拌反应时间为1~2h，反应后趁热过滤。
优选的，步骤1.3中，将步骤1.2的滤渣用去离子水煮沸1.5~2.5h，加入质量分数为15%的氢氧化溶液再煮沸1.5~2.5h。
优选的，将浆料、次氯酸钠和过氧化氢混合后于35~45℃下搅拌反应40~60min，再加入反应料液体积20%的稀盐酸酸化10~15min滤出；
步骤1.4中，调节收集的滤渣的pH值至中性，洗涤并干燥。
优选的，步骤1.5中，氢氧化钠溶液的质量分数为30%，滤渣和氢氧化钠溶液的质量比为1：2，滤渣和质量分数为30%的氢氧化钠溶液混合后于30~40℃下搅拌反应40~60min，得到碱性纤维素；碱性纤维素与氯乙烷的质量比为1：5。
优选的，步骤2.2中，半纤维素、葡萄糖和海藻酸钠的质量比为1：1：5；
步骤2.3中，Rs-198菌株、绿针假单胞菌R5菌株、枯草芽孢杆菌GB03菌株按1：1：1比例混合，发酵培养的条件为：
温度为35~37℃；
pH为7.0～7.5。
优选的，步骤3.1中，加热方式为水浴加热，温度为70～80℃，搅拌至骨架主料和聚乙烯在环已烷中完全溶解。
优选的，步骤3.2中，CaCl2溶液和Na2CO3溶液的添加比例为等摩尔比1：1，在45℃温度下恒温超声分散30分钟，通过离心收集颗粒，水洗，并在80℃下干燥2小时。
优选的，步骤3.2中，CaCl2溶液和Na2CO3溶液的添加比例为等摩尔比1：1，在45~55℃温度下恒温超声分散30~45min，通过离心收集颗粒，水洗，并在80~90℃下干燥2~3h；
步骤3.5中，按照质量比1:2取3.4步骤制备的微胶囊、浓度为5~10%柠檬酸混合处理。
优选的，步骤4.1中，滴加完成后，于25~30℃固化10~12h，再在真空冷冻干燥24~28h，其中，真空度为60Pa，真空冷冻后粉碎处理获得复合菌微胶囊。
本发明的有益效果：
（1）本发明是通过棉秆中提取出纤维素并出制备微胶囊骨架材料，充分回收利用了农业废弃物棉秆，使得微胶囊制备具有原料简单、绿色环保、成本低，对于大规模生产使用具有重大的经济优势。同时微胶囊材料由有机生物质制成，绿色无毒，对土地没有任何化学污染，同时自身也能成为微生物生长繁殖肥料。而且，使用本发明制备方法制备的复合菌群微胶囊缓释效果，本发明方法制备的微胶囊骨架材料可以有效保护复合菌的生存能力，当复合菌群微微胶囊接种到盐碱化土地后，微生物的存活率较高，可以有效调理土壤碱度并且促进棉花生产。经过试验，使用本发明方法制备的复合菌群微胶囊经过120小时以后复合菌群微胶囊内有效成分仍含有30%以上，而溶出的复合菌逐渐繁殖增多。本发明的制备方法能够有效保持复合菌群的存活、促进复合菌群的生长繁殖并且延长有效成分的释放时间，缓释效果佳。
（2）本发明使用生物质制备微胶囊骨架材料，骨架材料以纤维素为主，表面具有的大量羟基、羧基等极性官能团，官能团之间可形成氢键相互作用，表现出较高的界面粘接性，为制备基于动态氢键自修复材料奠定了基础。
（3）本发明使用棉秆制备微胶囊骨架主料时步骤1.4产生了的废料滤液2.1步骤通过加工回收了半纤维素，半纤维素又作为微胶囊复合菌群的培养基料成分之一，符合绿色环保的理念。而且，尽管半纤维素的回收利用看起来无关重要，但对于大规模生产而言，半纤维素回收利用作为培养基料原料可以大大节省原料成本，增加经济效益，具有显著的进步。
（4）使用本发明制备方法制得的复合菌群微生物不仅可以调节盐碱地的碱度而且可以促进棉花生长，增强棉花再盐胁迫下的存活率。国内学者研究发现枯草芽孢杆菌、绿针假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、耳炎假单胞菌等可以抑制致病菌的感染，促进番茄的生长，但是前述菌种尽管单一使用时，也具有抗菌促番茄生长的作用，但是在盐碱地时，前述菌种单一使用时并不能很好地促棉盐胁迫下的花植物生长，在调理盐碱土壤时虽略有效果，但土壤改良的时间长且改善程度较少。本发明的制备方法将Rs-198菌、绿针假单胞菌R5菌和枯草芽孢杆菌GB03制成复合菌群，制得的复合菌群相比于单一的菌种在调理盐碱地土壤，通过协同作用产生1+1＞2的作用。
Rs-198菌可以分泌葡萄糖酸等有机酸，从而溶解盐碱土壤中难溶性的钠盐、钾盐以及植物所必须的磷元素（难溶性钙的磷酸盐形式），增强盐胁迫下植物根和叶对N、P、K、Ca和Fe营养元素的积累，同时也使得土壤中离子流动性增强，从而间接减低了土壤盐分。其次，Rs-198菌分泌的有机酸不仅起到溶盐的效果，还能中和土壤中碱浓度，使得土壤的PH值得到降低。最后Rs-198均还会产生的吲哚乙酸（IAA）、赤霉素和其他生长调节剂，可以支持增加棉花根长，根表面积和根尖数量，增强植物对营养物质的吸收能力，从而在盐胁迫下提高棉花的存活率。
枯草芽孢杆菌GB03菌株是芽孢杆菌属的一类分布广泛的细菌,具有耐热抗逆性强,对人畜无毒无害,不污染环境,环境兼容性好等优点，在复合菌群中可以起到促进棉花生长成熟，增强棉花发育的作用。棉花在盐胁迫土壤中生长过程中，1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）会浓度增加，导致棉花具有高乙烯浓度（抑制植物生长发育），而枯草芽孢杆菌可以分泌激素类物质和多种酶将ACC水解为氨和α-酮丁酸，从而降低胁迫棉花中乙烯的浓度，促进了盐胁迫下棉花的生长发育。
绿针假单胞菌R5菌株可以产生抗真菌代谢物如HCN、吩嗪、硝吡咯菌素、2,4-二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素和张力蛋白可以有效抑制病原菌的生长与繁殖，增强植物抗病性，可以作为生长在含盐土壤中棉花的生物防治剂，同时也可以抑制其他病原菌对复合菌群生存竞争，增强复合菌群存活率。
Rs-198菌通过分泌有机酸调节土壤及促进棉花根部生长，枯草芽孢杆菌GB03的分泌物降低棉花中的乙烯的浓度，绿针假单胞菌R5抑制病菌，同时增强Rs-198菌和枯草芽孢杆菌GB03的存活率，三者共生协作，相互配合共同发挥作用。
同时，复合菌群可以通过直接和间接促进棉花作用的多种重要激素（细胞分裂素、合成生长素等）的分泌，还能促进维生素合成、矿物质溶解、氮素固定，对于帮助棉花作物抵抗土壤盐胁迫具有重要作用。此外，这三种菌株各自协同作用，不仅能够治理土地盐碱化问题，还能起到促进棉花生长与抑制病虫害的作用，使得整体的复合菌群具有生命力强、活性长的优势，能够对土壤进行持久有效的生物调理。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，包括有以下主要步骤：
（1）制备微胶囊骨架主料
1.1将棉秆进行粉碎、脱灰、脱蜡并干燥制得棉秆粉末；本实施例的棉秆采取农业废弃棉秆；
其中，
1.11 棉秆经粉碎机进行粉碎后，将得到的废弃棉杆粉碎成粉末状，送入脱灰装置进行脱灰；
1.12用无水乙醇蒸煮2h进行脱蜡，用去离子水冲洗干净；
1.13 将步骤1.12获得的物料置于烘箱，在105°C温度下干燥12小时；
1.2将60%硫酸、棉秆粉末和γ-戊内酯按1:10:100投料，混合均匀，于80℃下搅拌1h，之后再保持温度下过滤，用去离子水冲洗干净，水洗至中性，滤液为木质素溶液，滤渣为纤维素与半纤维素存留物。
1.3 将步骤1.2的滤渣用去离子水煮沸2h，加入质量分数为15%的氢氧化钠溶液煮沸2h得到浆料；
1.4按照质量比为1:2:2取浆料、次氯酸钠、过氧化氢混合，于40℃下搅拌50min，用稀盐酸酸化10min后滤出，分别收集滤渣和滤液，得到半纤维素滤液与纤维素滤渣；
其中，半纤维素滤液收集备用，纤维素滤渣洗涤至中性并干燥；
1.5 往步骤1.4的滤渣加入质量分数为30%氢氧化钠溶液于35℃下搅拌反应50min，得到碱性纤维素，其中滤渣和氢氧化钠溶液的质量比为1：2，；
将碱性纤维素和氯乙烷投入加压釜，在220℃温度下与4Mpa压力下进行反应获得骨架主料，其中，碱性纤维素与氯乙烷的质量比为1：5；
骨架主料用热水洗涤，干燥，收集备用；
此步骤可使纤维素内的三个羟基全部或者一部分置换为乙氧基；
（2）构建复合菌群体系
2.1将1.4步骤制得的滤液pH值调节为中性，加入过量的70%乙醇，过滤收集不溶物并洗涤干燥获得半纤维素；
2.2 制备培养基料：20g半纤维素、20g葡萄糖和100g海藻酸钠混合均匀；
2.3 将5gRs-198菌株、5g绿针假单胞菌R5菌株、5g枯草芽孢杆菌GB03菌株培养至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，发酵培养至对数生长期，后制成微生物混合液；具体操作如下：
2.31 将5gRs-198菌株培养至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于37℃、pH为7.0～7.5条件下发酵培养至对数生长期。
2.32 将5g绿针假单胞菌R5菌株培养至普通LB培养基中于37℃、pH为7.0～7.5条件下发酵培养至对数生长期。
2.33 将5g枯草芽孢杆菌GB03菌株培养至普通LB培养基中于37℃、pH为7.0～7.5条件下发酵培养至对数生长期。
2.34将上述获得各微生物发酵液按1：1：1比例混合于微生物发酵液中，取20mL微生物混合液备用。
（3）制备中空微胶囊
3.1 将步骤（1）制备获得的骨架主料20g、聚乙烯加入到有机溶剂环已烷中，开动电动搅拌器加热搅拌，获得骨架浆料；加热方式为水浴恒温70℃；
3.2制备CaCO3微粒芯材：将1M的CaCl2溶液和1M的Na2CO3溶液充分混合，并在45℃温度下恒温超声分散30分钟。通过离心（5000转/分，30秒）收集颗粒，用水洗几次，并在80℃下干燥2小时；其中，CaCl2溶液和Na2CO3溶液摩尔浓度相同，用量比例为1：1，本实施例中溶液溶质的量均为1mol。
3.3 往步骤3.2的CaCO3微粒芯材中加入3.1步骤制备的骨架浆料，搅拌；
3.4冷却至室温使微胶囊固化后过滤回收微胶囊，再环已烷洗涤收集微胶囊；
3.5 将3.4步骤制备的微胶囊重新加入去离子水，并在水中加入50mM柠檬酸搅拌3h，在浓度为8%柠檬酸处理后，微胶囊用去离子水清洗，水洗至中性获得中空微胶囊溶液；
（4）制备复合菌微胶囊
4.1 步骤2.2的培养基料和步骤2.3微生物混合液通过注射器滴加到步骤（3）制备的中空微胶囊溶液中，于25℃固化10h，再空冷冻干燥24h(真空度为60Pa)后进行粉碎（颗粒度300μm），制得复合菌微胶囊。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，
步骤1.13，在100°C温度下干燥10小时；
步骤1.2，棉秆粉末150g，于90℃下搅拌1.5h；
步骤1.3，步骤1.2的滤渣用去离子水煮沸2.5h，加入氢氧化钠溶液煮沸2.5h；
步骤1.4，浆料与次氯酸钠、过氧化氢混合后于45℃下搅拌40min，酸化12min；
步骤1.5，滤渣和氢氧化钠溶液混合后于30℃下、搅拌反应40min加压釜温度为230℃；
步骤2.2，培养基材包括有30g葡萄糖、30g半纤维素和150g海藻酸钠；
步骤2.3， Rs-198菌株10g，绿针假单胞菌R5菌株10g、枯草芽孢杆菌GB03菌株10g；
步骤2.31至2.33，pH控制为7.0；
步骤3.1，水浴恒温75℃；
步骤3.2，50℃温度下恒温超声分散40分钟。离心洗涤后，在85℃下干燥2.5小时；
步骤3.3，加入5%柠檬酸搅拌3.5h；
步骤4.1，于30℃固化11h，再空冷冻干燥26h；
本实施例的主要技术方案与实施例1基本相同，在本实施例中未作解释的特征，采用实施例1中的解释，在此不再进行赘述。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于，
步骤1.13，在110°C温度下干燥12小时；
步骤1.2，棉秆粉末200g，于100℃下搅拌1h；
步骤1.3，步骤1.2的滤渣用去离子水煮沸1.5h，加入氢氧化钠溶液煮沸1.5h；
步骤1.4，浆料与次氯酸钠、过氧化氢混合后于35℃下搅拌60min；
步骤1.5，加压釜温度为225℃；
步骤2.2，培养基材包括有40g葡萄糖、40g半纤维素和200g海藻酸钠；
步骤2.3， Rs-198菌株15g，绿针假单胞菌R5菌株15g、枯草芽孢杆菌GB03菌株15g；
步骤2.31至2.33，pH控制为7.5；
步骤3.1，水浴恒温80℃；
步骤3.2，55℃温度下恒温超声分散45分钟。离心洗涤后，在90℃下干燥3小时；
步骤3.3，加入质量分数为10%柠檬酸搅拌3.8h；
步骤4.1，于28℃固化12h，再空冷冻干燥28h；
本实施例的主要技术方案与实施例1基本相同，在本实施例中未作解释的特征，采用实施例1中的解释，在此不再进行赘述。
实验测试
对比试验测试1：植物促生根圈细菌（PGPR）含量测试
精准称取5g通过实施例1、2和3方法制备的微胶囊，溶于50mLpH值为6.9的PBS缓冲液，于37℃、150r/min条件下进行溶出实验。于设定的时间点0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、72h、120h分别取样10mL，使用离心机5000r/min下离心5min，测定上清液吸光度值计算复合菌浓度。其中，在分光光度计上测定OD值时以含有与实施例1~3分别相同pH值为6.9的PBS缓冲液加入5g复合菌（无胶囊）作为空白对照组1，将5g复合菌（无胶囊）用纤维素薄膜包裹作为对照组2。测试实施例1~3均需预先做空白对照调零再测定被测溶度中植物促生根圈细菌的吸光度。测试数据(复合菌浓度单位为cfu/mL)如下：
表1
上述四个实验结束后，每个试验取5mL混悬液离心分离出微胶囊，加10mL新鲜PBS，超声破坏微胶囊结构，将处理后的悬液于5000r/min下离心5min，测定上清液吸光度值计算未溶出复合菌含量占比（未释放含量，重量百分比含量），测试数据如下：
表2
观察表1可知，加入的培养基料的数可以促进复合菌的生产繁殖，使得使用过程复合菌的菌数量大于投入时的数量。观察表2可知，通过本发明制备方法制备的微胶囊缓释效果佳，包裹在微胶囊内的复合菌以生物质为材料的微胶囊能够长时间存活和繁殖。
对比试验测试2：复合菌群与单一菌落降低土壤pH效果对比测试
（1）准备5份从同一地方采集的土壤样本备用，每份土壤重量150g；
（2）取1份土壤样品作为对照样品，将1份土壤样本分别混入10g实施例1方法制备的复合菌微胶囊，其他3份土壤样品分别混入包裹单一菌落的微胶囊，单一菌落分别是Rs-198菌株，绿针假单胞菌R5菌株、枯草芽孢杆菌GB03菌株，包裹单一菌落的微胶囊的制备方法与实施例1制备混合菌微胶囊的方法相同，并且微胶囊中含有的菌落质量相同，均为5g。
（3）将5份土壤样品放入相同的培养箱中，保持温度为23~29℃，每隔24小时喷洒蒸馏水以及翻动一次，水量能够使土壤润湿即可，如此培养调理总共40天；
（4）从5份土壤样品中分别取出10g土壤于5个小烧杯中，往烧杯加入20mL蒸馏水充分搅拌；
（5）校准pH计；
（6）将pH分别插入5个小烧杯溶液中测试不同土壤溶液的pH值，每隔10天测量一次，每次测量后不同溶液前要用蒸馏水将pH计的电极清洗干净。
测试数据如下：
表3
从表3可知，经过40天的调理土壤，5份土壤样品的pH都有一定的下降，其中，对照组pH仅有轻微下降。从实验数据可知，各个菌株与对照组相比都起到一定降低PH值的效用，复合菌的40天内pH值降低效果最好，其次为单一菌落Rs-198菌株，复合菌株数据结果与单一菌落Rs-198菌株、枯草芽孢杆菌GB03菌株和绿针假单胞菌R5菌株的数据对比分析，明显可以看出复合菌群的效果远胜于单独菌种，由此推断落Rs-198菌株、枯草芽孢杆菌GB03菌株和绿针假单胞菌R5菌株混合后相互之间能够产生协同作用，能够进一步加强菌株降低盐碱地碱性的功能，获得比单一菌株更优的盐碱地土壤调理效果。
对比试验测试3：本发明与其他技术降低土壤pH值效果对比测试
本次选取腐殖酸含量大于35%的风化煤作为比技术方案，风化煤粉碎成粉末或者颗粒形成治理土地盐碱化的生态制剂。
（1）准备3份从同一地方采集的土壤样本备用，每份土壤重量150g；
（2）取1份土壤样品作为对照样品，将1份土壤样本分别混入10g实施例1的复合菌以生物质乙基纤维素为材料的微胶囊。
（3）将1份土壤样本混入10g生态制剂（腐殖酸含量大于35%的风化煤颗粒度为0.1~5mm），使生态制剂与土壤混合均匀。
（3）将3份土壤样品放入相同的培养箱中，保持温度为23~29℃，每隔24小时喷洒蒸馏水以及翻动一次，水量能够使土壤润湿即可，如此培养调理总共20天；
（4）从5份土壤样品中分别取出10g土壤于5个小烧杯中，往烧杯加入20mL蒸馏水充分搅拌；
（5）校准pH计；
（6）将pH分别插入3个小烧杯溶液中测试不同土壤溶液的pH值，每隔10天测量一次，每次测量后不同溶液前要用蒸馏水将pH计的电极清洗干净。
测试数据如下：
表4
从表4可知，经过40天两种治理方法调理的土壤的pH值都有所下降，但复合菌的pH值降低效果要较好于生态之制剂。尽管前10天内生态制剂效果要好于本发明的复合菌群，但随着时间的延长，本发明的复合菌群繁殖数量逐渐增加，分泌的有机酸含量要先低于生态制剂中的腐殖酸含量，之后随着，菌群的繁殖增长，土壤中有机酸等物质含量逐渐增加并高于腐殖酸含量，同时生态制剂的腐殖酸含量在不断消耗，使得后20天内的效用逐渐减弱，使得最后的降低土壤pH值的效果不如复合菌群效用。由此，也可以看出使用本发明制备的复合菌微胶囊可以长期调理盐碱化土壤，获得更持久有效的作用。
对比试验测试4：复合菌微胶囊对盐碱地下种植棉花生长效果的对比测试
1.实验步骤
本次试验设在新疆维吾尔自治区阿拉尔市。根据不同的土壤环境，在滴灌棉花种植地选择A（盐碱板结地块）、B（盐碱地块）两块块试验棉田。A试验田面积为40亩，其中使用本发明制备的微胶囊处理组为20亩，对照组为20亩。B块试验田为80亩，其中三种不同浓度微胶囊处理组B1、B2、B3各为20亩，对照组为20亩。每块试验田施肥和管理模式相同。每块田均设置对照组和处理组，其中对照组均为不施用微胶囊的无处理组。
处理组处理方法
试验田A：棉花秧苗定植移栽前，先每亩用100g微胶囊（实例1制得）种溶入到100L水中(浓度为1g/L)，均匀滴灌到土壤里，隔一个月后按100g/亩的用量再次滴灌到棉花根部，共计2次；移栽后分别在苗期按150g/亩的用量喷洒微胶囊2次、蕾期按150g/亩的用量喷洒微胶囊2次、花铃期按200g/亩的用量喷洒微胶囊剂2次，全生育期共喷洒8次。
试验田B：秧苗定植移栽前，B1每亩用150g微胶囊溶入到100L水中(浓度为1.5g/L)，均匀滴灌到土壤里，隔一个月后按100g/亩的用量再次滴灌到棉花根部，共计2次；移栽后分别在苗期按150g/亩的量喷洒微胶囊2次、蕾期按150g/亩的量喷洒微胶囊2次、花铃期按200g/亩的量喷洒微胶囊2次，全生育期共喷洒8次。B2与B3除每次喷洒浓度不同外，处理步骤和每次成长期使用量如B1，B2每亩用200g微胶囊溶入到100L水中（浓度为2g/L），B3每亩用250g微胶囊溶入到100L水中（浓度为2.5g/L）。
调查方法与次数
在棉苗移栽后开始，于棉花植株的苗期、蕾期和收获期分别对A、B两块试验田进行调查（每次调查前注意天气情况，在调查时间内选择天气晴朗时间段进行调查），共调查3次：
第一次于移栽后苗期对处理组和无处理组的棉花出芽状况进行调查并计算出芽率；
第二次于蕾期第一次喷洒后10d对棉花株高进行调查；
第三次于棉花收获时，对其产量和最终棉铃质量进行调查。
实验结果
（1）试验田A中微胶囊和无微胶囊处理棉花生长效果比对
测试数据如下：
表5
结果表明A试验田处理组和对照组的出芽率分别为56.55±2.15和72.38±1.63，二者存在显著差异，使用本发明复合菌微胶囊的棉花出芽率相较于对照组提高了28.7%，这表明包裹本发明复合菌的微胶囊显著提高了棉花出芽率。同样的，处理组和对照组籽棉产量分别为59.68±5.46g/株和47.23±6.23g/株，处理组相对于对照组增产幅度均可达15%以上，这表明所本发明的复合菌微胶囊能有效促进棉花出芽生长，而且，处理组相较于对照组，每株棉花的株高和棉铃重都有所提高，这表明棉花作物在盐胁迫下存活和成长能力都得到了显著增强。
（2）试验田B中不同浓度微胶囊和无微胶囊处理棉花生长效果比对的测试数据如下：
表6
结果表明B试验田的所有处理组与对照组相比都显著增强了棉花的各项评价参数，但是各个不同浓度的微胶囊对棉花的促生效果却不同。其中促生作用最好的处理组为B2组，与对照组相比其出芽率为85.33%，提高幅度为46.9%，而棉花每株产量为68.37g/株，增产幅度为38%，株高与棉重量也显著提高，这说明目前条件下微胶囊对棉花促生效果的最佳浓度区间为2.0g/L。从表中可以看出棉花的促生效果随着浓度增加呈现先增加后减小的趋势，这表明微胶囊的促生效果存在一定界限，原因是包裹的复合菌在当前环境下生长与繁殖达到了平衡，不能无限增殖发育，是各个微生物在当前环境下相互竞争共存的宏观结果。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案说明而非对权利要求保护范围的限制。本领域的普通技术人员参照较佳实施例应当理解，并可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但属于本发明技术方案的实质相同和保护范围。
Claims (10)
1.一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括有以下主要步骤：
（1）制备微胶囊骨架主料
1.1将棉秆进行粉碎、脱灰、脱蜡并干燥制得棉秆粉末；
1.2 将60~80%硫酸、棉秆粉末和γ-戊内酯按1:10:100投料，混合均匀、加热搅拌一段时间，水洗至中性并过滤收集滤渣；
1.3 将步骤1.2的滤渣用去离子水煮沸，加入质量分数为15%氢氧化钠溶液再煮沸得到浆料；
1.4按照质量比为1:2:2取浆料、次氯酸钠、过氧化氢混合，搅拌反应一段时间后，用稀盐酸酸化后滤出，分别收集滤渣和滤液；
1.5 往步骤1.4的滤渣加入氢氧化钠溶液反应制得碱性纤维素；将碱性纤维素和氯乙烷投入加压釜，在220℃温度下与4Mpa压力下进行反应获得骨架主料；
（2）构建复合菌群体系
2.1将1.4步骤制得的滤液pH值调节为中性，加入过量的70%乙醇，过滤收集不溶物并洗涤干燥获得半纤维素；
2.2 制备培养基料：半纤维素、葡萄糖和海藻酸钠混合均匀；
2.3 将Rs-198菌株、绿针假单胞菌R5菌株、枯草芽孢杆菌GB03菌株培养至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，发酵培养至对数生长期，后制成微生物混合液；
（3）制备中空微胶囊
3.1 将步骤（1）制备获得的骨架主料、聚乙烯加入到有机溶剂环已烷中，骨架主料、聚乙烯和环已烷的质量比为1:1:1.5，开动电动搅拌器加热搅拌，获得骨架浆料；
3.2制备CaCO3微粒芯材：将CaCl2溶液和Na2CO3溶液充分混合并恒温超声分散；
3.3按照质量比1:2取步骤3.2的CaCO3微粒芯材和3.1步骤制备的骨架浆料混合搅拌；
3.4冷却至室温使微胶囊固化后过滤回收微胶囊，再环已烷洗涤收集微胶囊；
3.5 将3.4步骤制备的微胶囊使用柠檬酸处理后水洗至中性，获得中空微胶囊溶液；
（4）制备复合菌微胶囊
4.1 步骤2.2的培养基料和步骤2.3微生物混合液液滴加到步骤（3）制备的中空微胶囊溶液中，静置固化后粉碎制得复合菌微胶囊。
2.根据权利要求1所述的一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊制备方法，其特征在于，步骤1.2中，加热温度控制在80~100℃，搅拌反应时间为1~2h，反应后趁热过滤。
3.根据权利要求1所述的一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤1.3中，将步骤1.2的滤渣用去离子水煮沸1.5~2.5h，加入质量分数为15%的氢氧化溶液再煮沸1.5~2.5h。
4.根据权利要求3所述的一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，其特征在于，将浆料、次氯酸钠和过氧化氢混合后于35~45℃下搅拌反应40~60min，再加入反应料液体积20%的稀盐酸酸化10~15min滤出。
5.根据权利要求4所述的一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤1.4中，调节收集的滤渣的pH值至中性，洗涤并干燥。
6.根据权利要求1所述的一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤1.5中，氢氧化钠溶液的质量分数为30%，滤渣和氢氧化钠溶液的质量比为1：2，滤渣和质量分数为30%的氢氧化钠溶液混合后于30~40℃下搅拌反应40~60min，得到碱性纤维素；碱性纤维素与氯乙烷的质量比为1：5。
7.根据权利要求1所述的一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤2.2中，半纤维素、葡萄糖和海藻酸钠的质量比为1：1：5；
步骤2.3中，Rs-198菌株、绿针假单胞菌R5菌株、枯草芽孢杆菌GB03菌株按1：1：1比例混合，发酵培养的条件为：
温度为35~37℃；
pH为7.0～7.5。
8.根据权利要求1所述的一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤3.1中，加热方式为水浴加热，温度为70～80℃，搅拌至骨架主料和聚乙烯在环已烷中完全溶解。
9.根据权利要求1所述的一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤3.2中，CaCl2溶液和Na2CO3溶液的添加比例为等摩尔比1：1，在45~55℃温度下恒温超声分散30~45min，通过离心收集颗粒，水洗，并在80~90℃下干燥2~3h；
步骤3.5中，按照质量比1:2取3.4步骤制备的微胶囊、浓度为5~10%柠檬酸混合处理。
10.根据权利要求1所述的一种治理盐碱化促棉花生长的复合菌微胶囊制备方法，其特征在于，步骤4.1中，滴加完成后，于25~30℃固化10~12h，再在真空冷冻干燥24~28h，其中，真空度为60Pa，真空冷冻后粉碎处理获得复合菌微胶囊。
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