CN102010825B - 一种防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂及其制备方法。所述的防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂，其特征在于，由沼泽红假单胞菌10-15重量份，枯草芽孢杆菌30-40重量份，链霉菌15-18重量份，植物乳杆菌20-23重量份和酿酒酵母10-15重量份组成。所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：筛选沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌，分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中培养；将得到的菌种与植物乳杆菌和酿酒酵母混合；将混合菌苔接种于液体培养基中，在发酵罐中发酵得到微生物复合菌剂。本发明在抑制枯萎病原菌生殖繁衍，控制发病规模和程度的同时，实现对土壤生态环境的修复和改良，同时促进黄瓜的生长和产量的提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂及其制备方法，特别涉及一种抑制黄瓜枯萎病原菌（尖胞镰刀菌等）增殖和繁衍，消除病原菌传播和感染性能的微生物防治枯萎病的微生物复合菌剂及其制备方法，属于生防技术领域。
背景技术
瓜类(黄瓜、西瓜和甜瓜)枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，是一类主要经土壤传播的维管束病害，在我国瓜类种植区普遍发生。病发时，病原菌主要侵害植株根部和茎基部维管束，在维管束内繁殖蔓延，通过堵塞维管束导管和分泌有毒物质毒害寄主细胞，破坏寄主正常吸收输导机能，使养分水分转运受阻，造成植株叶片枯萎；病害严重时，直接导致植株死亡，造成严重的经济损失。
近年来，我国黄瓜枯萎病爆发严重，在多雨、多湿年份其危害更为严重，常常造成枯萎病的大流行，造成惊人的损失。据相关报道，普通年份植株发病率为20%左右，严重的田块甚至高达80%～90%，枯萎病俨然成为黄瓜种植中的灾难性病害之一。在一定程度上可以说，黄瓜枯萎病的发病规模和程度直接关乎黄瓜种植的经济收益。
目前，枯萎病的防治方法主要包括：农业防治和药剂防治，农业防治包括选用抗病品种、种子消毒、换土、嫁接、土壤盖膜高温处理等方法；药剂防治包括土壤灭菌、灌根、喷洒药剂等方法。然而现有的抗病品种仅具有相对的抗病能力，抗病效果不显著；轮作只能降低枯萎病的发病程度，加之换茬轮作的作物往往经济价值低，影响了种植户的直接经济收益；嫁接技术尽管能有效地防治枯萎病害，但是采用南瓜砧木嫁接的黄瓜品质下降，且砧木的连年使用后也逐渐出现砧木连作烂根死亡病症，嫁接防病技术遭遇到发展瓶颈。化学农药的综合应用在一段时期内对病害防治具有重要作用，但长期连续不合理的使用造成病菌和害虫的抗药性不断增强，形成用药量与病害相互递增的恶性循环，增加了农产品中农药的残留量，对人畜安全和生态环境的平衡构成极大的威胁。另一方面，化学农药的大量投放在杀灭有害病原菌的同时，也杀死了土壤环境中的有益微生物，而有益微生物的活动往往与植株的生长发育有着密切的关联，农要防治常常伴随有严重的并发症等隐患。因而，寻求新的防病手段，有效地控制瓜类枯萎病的危害已成为生产实践中迫切需要解决的课题。
近年来微生物农药由于其高效、低毒、且不污染环境等诸多显著的优越性越来越受到人们的关注，生防微生物制品因其安全及有效性成为植物病虫害防治的热点。目前，枯草芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，许多性状优良的菌株表现出对多种植物病原菌的拮抗作用。枯草枯草芽孢杆菌能产生多种抑制植物病原菌的抗菌物质，主要为低分子量的多肽类抗生素和一些高分子亮的蛋白类抗菌物质。据试验研究，沼泽红假单胞菌、木霉菌以及链霉菌等均对抑制植物枯萎病、蔓枯病等土传病害均有效果，并且已经开发出了部分生防产品，用于农业生产。
目前公布的一项专利申请文件，名为“一株海洋枯草枯草芽孢杆菌及其分离和防治黄瓜枯萎病制剂”，申请号：CN200810011342 ，是采用一种海洋枯草枯草芽孢杆菌发酵制成的微生物制剂，通过在土壤中深层施用，杀灭和抑制病原菌生殖，由于采用的菌种单一，难以满足复杂的土壤环境要求，使得制剂的环境适宜性和效果稳定性受到限制，因此对于黄瓜枯萎病的防治作用有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂及其制备方法，在抑制枯萎病原菌生殖繁衍，控制发病规模和程度的同时，实现对土壤生态环境的修复和改良，同时促进黄瓜的生长和产量的提高。
为了实现以上目的，本发明提供了一种防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂，其特征在于，由沼泽红假单胞菌10-15重量份，枯草芽孢杆菌30-40重量份，链霉菌15-18重量份，植物乳杆菌20-23重量份和酿酒酵母10-15重量份组成。
本发明还提供了上述防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步：将沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、链霉菌与酿酒酵母菌液按以下比例混合：沼泽红假单胞菌10-15重量份，枯草芽孢杆菌30-40重量份，链霉菌15-18重量份，植物乳杆菌20-23重量份和酿酒酵母10-15重量份；
其中沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、链霉菌与酿酒酵母用其相应的常规培养基进行液体扩大培养机即可。
第二步：将第一步得到的混合菌液按照1：25-30的重量比例接种于在120-130℃灭菌30-45min后的液体培养基中，在发酵罐中发酵，发酵条件：温度为25-32℃、pH值为6.8-7.0、转速为220-240r/min、发酵通气量维持在1：1、时间28-32小时，发酵 24小时后每隔2小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达到100亿/ml停止发酵得到微生物复合菌剂。
所述第二步中的液体培养基由玉米粉2-20重量份、豆粕粉1-10重量份、磷酸二氢钾0.2-2重量份、磷酸一氢钠0.4-0.8重量份、硫酸锰0.001-0.01重量份、硫酸镁0.001-0.02重量份、酵母膏0.05-0.2重量份和无菌水32.2-39.2重量份组成。
本发明采用多种菌种共同生长发酵，同时产生较大含量的代谢物质，活菌含量10亿∕ml。
沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌以及链霉菌等可通过抗生、竞争及重寄生等作用，如直接分泌抗生物质或细胞外酵素以及生长位点和营养竞争等，直接杀灭或抑制黄瓜枯萎病原菌的生殖。酿酒酵母群不仅细胞蛋白质含量高，而且在生长代谢过程中能形成多种B族维生素和生理活性物质，有助于其他微生物和动植物的营养吸收，增强了有益菌的活性，也促进了黄瓜根系的生长和发育，有助于提高黄瓜自身的抗病能力，进而削弱了枯萎病的发病程度。
本发明的优点是：
1、 直接从健康土壤环境中筛选有益细菌和真菌，保证了菌种在土壤环境中的兼容性，可以在土壤中迅速根植并持续作用于植物根系；
2、 采用的菌种摇瓶技术选取高产菌种，可以显著增加其菌种的生长速度，有利于在土壤中迅速形成有益的根系微生物环境，限制枯萎病的发病；
3、 采用液体高速培养的发酵工艺，既可以保证产品活菌数量在一个作用的高位，又可以让菌种在发酵过程中相互驯化，增加其兼容性；
4、 由于复合菌种的共生共栖，既保证菌剂长期储存的生理活性和稳定性，也保障了对土壤环境适应的广泛性，较单一菌种更有推广的可行性和价值。
附图说明
图1为枯萎病的发病率平均数的差异显著性示意图；
图2为霜霉病的发病率平均数的差异显著性示意图；
图3为黄瓜产量统计曲线示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。本发明中使用的各菌种中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种相关信息如下：
| 菌种 | 菌种号 | 拉丁名称 |
| 沼泽红假单胞菌 | ACCC10649 | Rhodopseudomonas palustris |
| 枯草芽孢杆菌 | ACCC10619 | Bacillus subtilis |
| 链霉菌 | ACCC40035 | Streptomycessp |
| 植物乳杆菌 | ACCC11118 | Lactobacillus plantarum |
| 酿酒酵母 | ACCC20065 | Sacharomyces cerevisiae |
实施例1
一种防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂，由沼泽红假单胞菌10重量份，枯草芽孢杆菌30重量份，链霉菌15重量份，植物乳杆菌20重量份和酿酒酵母10重量份组成。
其制备方法为：
将通过普通方法扩培得到的单一菌种按以下比例混合：：沼泽红假单胞菌10重量份，枯草芽孢杆菌30重量份，链霉菌15重量份，植物乳杆菌20重量份和酿酒酵母10重量份；
将混合菌液按照1：25的重量比例接种于在120℃灭菌30min后的液体培养基中，所述液体培养基由玉米粉2重量份、豆粕粉1重量份、磷酸二氢钾0.2重量份、磷酸一氢钠0.4重量份、硫酸锰0.001重量份、硫酸镁0.001重量份、酵母膏0.05重量份和无菌水32.2重量份组成。在发酵罐中发酵，发酵条件：温度为30℃、pH值为6.8、转速为220r/min、发酵通气量维持在1：1、时间28小时，发酵 24小时后每隔2小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达到100亿/ml停止发酵。
复合菌剂的应用方法如下：
1、种苗处理：
浸种：清水稀释100-500倍浸泡种子24-48小时，然后催芽播种。
蘸根：清水稀释200-500倍，加适量泥土搅成泥浆液，蘸根后移植。
2、育苗：稀释500-800倍，浇苗床或营养钵。
3、大田应用：
土壤处理：移植前1-2周，按亩用量1-5kg使用复合菌剂，随基肥（有机肥或化肥）均匀施入耕作层土壤。
定植：瓜苗移植后，随定植水施用0.5-2kg/亩；
浇根：瓜苗返青后，亩用0.5-2kg，加入滴灌系统或随水冲施，或者稀释后直接浇根；生长中期，每隔15-20天使用一次，也可结合叶面喷施时，根据植株的大小密度，亩用量控制在0.2-1.0kg。
实施例2
一种防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂，由沼泽红假单胞菌15重量份，枯草芽孢杆菌40重量份，链霉菌18重量份，植物乳杆菌23重量份和酿酒酵母15重量份组成。
其制备方法为：
将通过普通方法扩培得到的单一菌种按以下比例混合：沼泽红假单胞菌15重量份，枯草芽孢杆菌40重量份，链霉菌18重量份，植物乳杆菌23重量份和酿酒酵母15重量份；
将混合菌液按照1：30的重量比例接种于在130℃灭菌45min后的液体培养基中，所述液体培养基由玉米粉20重量份、豆粕粉10重量份、磷酸二氢钾2重量份、磷酸一氢钠0.8重量份、硫酸锰0.01重量份、硫酸镁0.02重量份、酵母膏0.2重量份和无菌水39.2重量份组成。在发酵罐中发酵，发酵条件：温度为32℃、pH值为7.0、转速为240r/min、发酵通气量维持在1：1、时间32小时，发酵 24小时后每隔2小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达到100亿/ml停止发酵。
实施例3
一种防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂，由沼泽红假单胞菌12重量份，枯草芽孢杆菌35重量份，链霉菌16重量份，植物乳杆菌22重量份和酿酒酵母12重量份组成。
将通过普通方法扩培得到的单一菌种按以下比例混合：沼泽红假单胞菌12重量份，枯草芽孢杆菌35重量份，链霉菌16重量份，植物乳杆菌22重量份和酿酒酵母12重量份；
将混合菌液按照1：26的重量比例接种于在125℃灭菌40min后的液体培养基中，所述液体培养基由玉米粉10重量份、豆粕粉5重量份、磷酸二氢钾1重量份、磷酸一氢钠0.6重量份、硫酸锰0.005重量份、硫酸镁0.01重量份、酵母膏0.1重量份和无菌水35重量份组成。在发酵罐中发酵，发酵条件：温度为31℃、pH值为6.9、转速为230r/min、发酵通气量维持在1：1、时间30小时，发酵 24小时后每隔2小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达到100亿/ml停止发酵。
应用方法同实施例1
微生物复合菌剂对黄瓜枯萎病防治效果的示范试验：
试验于2009年3月20日至6月6日在上海市奉贤区清秋蔬果专业合作社杨王村蔬菜基地进行，先前实验地已经连续种植四茬黄瓜；微生物复合菌剂从土壤处理开始，瓜苗定植后第一次使用菌剂稀释液灌根，以后每隔30天使用微生物复合菌剂稀释液灌根一次，药量控制在1kg∕亩·次，直到采收完毕前15天。
效果试验结果如下：
从图1和图2可以看出，各微生物复合菌剂处理的试验地枯萎病与霜霉病在发病百分数上均低于常规处理，各处理间也存在显著差异（各处理只在土壤处理阶段用量不同：处理一为3kg/亩；处理二为2 kg/亩；处理三为1 kg/亩。）试验处理一的霜霉病和枯萎病发病率最低（13.2%，39.7%），比常规处理（对照组34.1%，96.2%）分别下降了20.9和56.5个百分点。其原因可能是由于土壤处理阶段，微生物复合菌剂中含有的有益微生物在土壤中迅速大量繁殖，在数量上占优势，形成优势种群，抑制有害微生物的生存和繁衍，进而显著降低了植株土传病害的发病率。此外，微生物的代谢产物促进了黄瓜根系生长发育，增强了植株自身抗逆能力，使霜霉病的发病率也大幅降低。
如图2所示：在0.05水平下试验处理组与对照组有显著差异，尤其是黄瓜的初期产量试验处理组远高于常规对照组，有助于种植户占领先期市场，保障了种植户的经济收益。经试验测定，试验组较常规对照组增产18.6%，增产效果显著。
Claims (2)
1.一种防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂，其特征在于，由沼泽红假单胞菌ACCC10649 10-15重量份，枯草芽孢杆菌ACCC10619 30-40重量份，链霉菌ACCC40035 15-18重量份，植物乳杆菌ACCC11118 20-23重量份和酿酒酵母ACCC20065 10-15重量份组成。
2.权利要求1所述的防治黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步：将沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、链霉菌与酿酒酵母菌液按以下比例混合：沼泽红假单胞菌10-15重量份，枯草芽孢杆菌30-40重量份，链霉菌15-18重量份，植物乳杆菌20-23重量份和酿酒酵母10-15重量份；其中沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、链霉菌与酿酒酵母用其相应的常规培养基进行液体扩大培养即可；
第二步：将第一步得到的混合菌液按照1：25-30的重量比例接种于在120-130℃灭菌30-45min后的液体培养基中，在发酵罐中发酵，发酵条件：温度为30-32℃、pH值为6.8-7.0、转速为220-240r/min、发酵通气量维持在1：1、时间28-32小时，发酵 24小时后每隔2小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达到100亿/ml停止发酵得到微生物复合菌剂；所述第二步中的液体培养基由玉米粉2-20重量份、豆粕粉1-10重量份、磷酸二氢钾0.2-2重量份、磷酸一氢钠0.4-0.8重量份、硫酸锰0.001-0.01重量份、硫酸镁0.001-0.02重量份、酵母膏0.05-0.2重量份和无菌水32.2-39.2重量份组成。
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