CN102499084B - 杜香属植物菌根试管内直接诱导、菌根化苗的快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物组织培养技术，即一种杜香属植物菌根试管内直接诱导、菌根化苗的快繁方法。其步骤如下：(1)培养基DR+KT0.05mg·L-1+IAA 0.18mg·L-1+GA32.90mg·L-1，对杜香试管苗直接诱导菌根效果最好，速度快且诱导率高，植株生长势旺且根和苗的形态、发育均接近于野生植株。(2)菌根真菌的分离。(3)菌根真菌的回接。(4)菌根化植株的快繁。诱导率为94.7％以上。本方法简捷，经济实用，可操作性强，达到了快繁的目标，可用于含菌根的杜香苗的工厂化育苗，且均在试管内进行。杜香菌根诱导技术的研究成功，可为长白山区野生资源的开发利用和中药质量标准化提供技术保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养技术，即一种杜香属植物菌根试管内直接诱导、菌根化苗的快繁方法。
背景技术
在现有技术中，杜香(Ledum)是杜鹃花科杜香属多年生木本植物。《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》中定为省级一类重点保护植物，为急需保护植物。杜香油中有十多种药用化合物，工业中，可用于制革、作香料等；医学上可治疗皮肤病、咽喉炎、百日咳等疾病；其头状花序，花色洁白，也可驯化为观赏植物。对研究植物区系也具有十分重要的意义。还可开发为耐寒、抗寒及抗病能力强的园艺新品种，作为高山植物育种的种质资源，另外，其含有特殊的香气，是很好的香料，可用于日用化工、制药皂、脚气水、洗发香波等。因其在长白山区数量稀少，分布区域十分狭窄，仅在长白山国家级自然保护区内有较大种群分布，因其种子、扦插等常规繁殖成活率极低，开发及利用受到极大的限制。
杜香根系没有根毛，吸收能力比具有根毛的根系小得多，但自然条件下几乎所有的杜香细根都有EM(Eriocdimyochrriaz，EM)内生菌根真菌的寄生，从而克服了杜香由于没有根毛而造成的对水分及营养的吸收困难，改善植株营养状况，调节宿主的代谢活性，增强植株的抗逆性，提高杜香中有效成分的含量，加快移栽苗成活速度，节约农业生产成本，增加经济产量和效益。因而将杜香组培技术和菌根化技术相结合，生产生长势旺、抗逆能力强的杜香苗木是一项很有经济价值的研究项目。
在国外，新西兰已经将接种菌根真菌作为促进杜香生长、提高肥料利用率、提高产量的一项有效措施。而在国内EM真菌的分离和研究几乎还是一片空白。要生产菌根化苗木的关键是选用适宜当地生态条件的优良菌种用于接种，培育出优质的菌根化杜香种苗，在生产和应用中将产生巨大的经济效益。
为了更好的开发利用这一极具经济价值的野生珍贵资源，利用植物组织培养技术在成功完成丛生芽诱导和生根的基础上，又以野生杜香根芽的嫩茎在试管内开展了直接诱导菌根的研究，旨在建立杜香菌根苗快繁体系，为杜香增产和提高品质提供基础保障。同时，应用均匀设计对杜香菌根诱导培养基进行筛选，以期缩短培养基的摸索周期。目前，植物菌根的研究大多集中在菌根菌的分离和鉴定方面，很少达到与植物的共建并利用于栽培生产。本发明开展的杜香试管内菌根直接诱导和菌根化苗高效快繁的报道国内外迄今未见。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足而提供一种技术可行的杜香属植物菌根试管内直接诱导、菌根化苗的快繁方法。
本发明的技术解决方案是：杜香属植物菌根试管内直接诱导、菌根化苗的快繁方法，其步骤如下：
(1)以杜香靠近根部新萌发的嫩芽为外植体，对外植体进行处理，菌根直接诱导培养基为：DR+KT0.05mg·L-1+IAA 0.18mg·L-1+GA32.90mg·L-1；式中DR为基本培养基(董春枝等1988年发明)，KT为激动素，IAA为吲哚乙酸，GA3为赤霉素。
(2)菌根真菌的分离：在超净工作台上将已诱导成功的菌根化苗连同菌根提出，用枪形镊子和手术刀将植株的根和苗分离后，将根转接到马丁-孟加拉红培养基中进行菌株分离培养；然后置于24±2℃培养箱中黑暗培养，观察菌丝萌发情况，待菌落从根中长出后，利用光学显微镜在100-400倍下观察菌丝体形态和孢子形状；若菌落形态有差异，进行二次分离直至菌落形态一致性和均匀性；
(3)菌根真菌的回接：培养一批不含有菌根的杜香试管苗，在超净工作台上用长剪将浮在培养基表面的根剪掉一部分后，再用接种针挑取已分离的菌丝粘在杜香根的切面，置22±2℃的培养室中培养；60d后统计菌根真菌侵染情况。
(4)菌根化植株的快繁：将含有菌根的试管苗于根上部留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的菌根诱导培养DR+KT0.05mg·L-1+IAA 0.18mg·L-1+GA32.90mg·L-1中进行同时腋芽萌发、生长及菌根再生培养；55d为1个继代增殖周期，每瓶增殖倍数平均达60以上。
对外植体进行处理是指在超净工作台上用含3.0％次氯酸钠溶液浸泡7min，无菌水冲洗8次；用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切割成1～2叶1段作为外植体备用。
本发明的优点是：1、采用杜香靠近根部新萌发的嫩芽为试材进行菌根诱导，并在试管内成功诱导出菌根，试验结果证明，培养基DR+KT0.05mg·L-1+IAA0.18mg·L-1+GA32.90mg·L-1对杜香试管苗直接诱导菌根效果最好，速度快且诱导率高，植株生长势旺且根和苗的形态、发育均接近于野生植株。2、本方法简捷，经济实用，可操作性强，达到了快繁的目标，可用于含菌根的杜香苗的工厂化育苗，且均在试管内进行。3、杜香菌根诱导技术的研究成功，可为长白山区野生资源的开发利用和中药质量标准化提供技术保障。
下面将结合实施例和附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
附图说明
图1是杜香菌根诱导初期培养照片。
图2是杜香菌根诱导后期照片。
图3是杜香含有菌根的植株照片。
图4是杜香含有菌根的另一植株照片。
图5是杜香不含菌根的植株照片。
图6是杜香菌根化苗的快繁照片。
具体实施方式
一种杜香属植物菌根试管内直接诱导、菌根化苗的快繁方法，其步骤如下：
1材料与方法
1.1外植体材料的处理8月中旬于长白山北坡海拔1200m的针叶林下采杜香(宽叶杜香或细叶杜香均可采用本方法，本例中以宽叶杜香为材料)靠近根部新萌发的嫩芽在超净工作台上用含3.0％次氯酸钠溶液浸泡7min，无菌水冲洗8次。用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切割成1～2叶1段作为外植体备用。
1.2菌根直接诱导培养基的筛选 将外植体在培养基MS(改良)+ZT3.00mg·L-1上培养出丛生芽，待丛生芽长至2.50cm时，将丛生芽切下转接到DR培养基中，附加不同质量浓度的KT、IAA和GA3(由预试验可知，KT、IAA和GA3质量浓度分别控制在0.10～0.15mg·L-1、0.07～0.12mg·L-1和1.60～2.60mg·L-1之间)，添加蔗糖15.0g·L-1，琼脂粉7.8g·L-1，调节pH值为5.6。在温度(23±2)℃，光照强度1100lx条件下培养，光照周期12h·d-1。培养50d统计并计算出菌根诱导率，筛选最适宜的杜香菌根诱导培养基。
1.3菌根真菌的分离与回接
1.3.1真菌的分离 在超净工作台上打开含有菌根的培养瓶，将已诱导成功的菌根化苗连同菌根提出(先剥离开固体琼脂)，用枪形镊子和手术刀将植株的根和苗分离后，将根转接到马丁-孟加拉红培养基中进行菌株分离培养(根平放于固体琼脂表面)。然后置于(24±2)℃培养箱中黑暗培养2～4w，观察菌丝萌发情况，待菌落从根中长出后，利用光学显微镜在100～400倍下观察菌丝体形态和孢子形状。若菌落形态有差异，进行二次分离直至菌落形态一致性和均匀性。
1.3.2菌根真菌的试管内回接 培养一批不含有菌根的杜香试管苗(已生出不定根)，在超净工作台上将杜香试管苗培养瓶打开，用长剪将浮在培养基表面的根剪掉一部分后，再用接种针挑取已分离的菌丝粘在杜香根的切面，置(22±2)℃的培养室中培养。60d后统计菌根真菌侵染情况。
1.4菌根化植株快繁体系的建立 利用已菌根化的再生植株的茎节为材料在试管内利用节增殖的方法进行快繁，即将菌根化的植株于根上部向下留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的菌根诱导培养基中进行同时腋芽萌发、生长及菌根再生培养。统计并计算出增殖周期和增殖倍数。1.5数据分析与处理为了提高杜香菌根的诱导率，采用均匀设计法，选用U12(123)均匀表，每个处理数接种腋芽数为30，重复3次，同时考察了KT、IAA和GA3质量浓度交叉配比对菌根诱导率的影响。数据分析与处理采用均匀设计(Uniform Design)软件。
2结果与分析
2.1DR培养基中不同质量浓度KT、IAA和GA3的交叉配比对杜香菌根诱导的影响
表1杜香菌根诱导影响因子的U12(123)均匀设计实验安排及结果
Tablel U12(123)uniform design test plan and result for effect factors of induction in vitro on mycorrhiza of Ledumpalustre
试验数据(表1)经均匀设计软件处理后得回归方程Y＝30.9-188X1-+419X2+11.4X3，样本容量N＝12，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9925，检验值Ft＝176.9，临界值F(0.05，3，8)＝4.066 Ft＞F(0.05，3，8)，回归方程显著。根据回归方程求出Y的最优组合为：X1＝0.10，X2＝0.12，X3＝2.60，在此组合基础上求得最优解：y＝91.9，此解为回归方程的解析解，需按公式Y＝y±uα·s(其中y为最优组合基础上求得的最优解，uα为正态分布的双侧分位数，s为剩余标准差)计算出优化值区间估计为Y＝91.9±3.24，即88.66％～95.14％。通过计算各方程项对回归的贡献率(U1/U＝11.8％，U2/U＝55.1％，U3/U＝15.4％)可知，IAA对杜香试管苗菌根诱导率Y的贡献远远大于KT和GA3，又因KT的质量浓度与菌根诱导率呈负相关，IAA和GA3的质量浓度与菌根诱导率呈负相关，猜测KT质量浓度在0.10mg·L-1以下，IAA和GA3分别在0.12mg·L-1和2.60mg·L-1以上有较高的菌根诱导率峰值，因此，又以KT质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和0.10mg·L-1，IAA质量浓度为0.12、0.14、0.16、0.18和0.20mg·L-1以及GA3质量浓度为2.60、2.65、2.70、2.75、2.80、2.85、2.90、2.95和3.00mg·L-1做了10个处理的补充试验，重复3次，发现KT质量浓度为0.05mg·L-1、IAA质量浓度为0.18mg·L-1和GA3质量浓度为2.90mg·L-1时杜香菌根诱导率最高且诱导速度最快。即待杜香嫩茎基部分化的芽苗生长至2.5cm以上时，将芽苗切下转接到附加KT0.05mg·L-1、IAA0.18mg·L-1和GA32.90mg·L-1的DR培养基中再次进行验证试验，每个处理数接种芽苗数为30，重复3次，芽苗培养至14d时发现芽苗切口处和靠近切口处的茎部形成大量锥形颗粒，30d后靠近切口处的茎部颗粒由锥形状逐渐伸长形成白色的不定根，继续培养至50d在切口处的颗粒由锥形状逐渐形成黄褐色树状形菌根(图1)，培养至65d后切口处的树状形菌根逐渐增大成团状，此时不定根的根段上也逐渐形成黄褐色树状形菌根(图2)，这样的苗由发根处又发出4～6根苗形成丛生状，这些含有菌根的苗(图3、4)在试管内和移栽后均表现出较未产生菌根的植株(图5)生长势旺且根和苗的形态、发育均接近于野生植株，菌根诱导率达94.7％以上。在估计区间内，比表1所列12个处理的诱导率均高。可见，杜香菌根诱导的最佳培养基为：DR+KT0.05mg·L-1+IAA 0.18mg·L-1+GA32.90mg·L-1。
2.2菌株的分离与回接
应用1.3中方法进行菌根真菌的分离与试管苗回接，待菌落从根中长出后，通过逐步提纯培养并确定均匀后，进行回染不含菌根的试管苗的结果表明，50d既可完成回接，且回染率达90.0％以上。通过初步鉴定该种菌根真菌菌丝体形态和孢子形状与内囊霉科(Endogonaceae)无梗囊霉属(Acaulospora)的浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa Morton)真菌相似。
2.3菌根化植株的快繁
采取1.4中方法进行快繁，待含有菌根的苗生长至3.00cm以上时，在超净工作台上打开培养瓶将含有菌根的试管苗于根上部留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的菌根诱导培养DR+KT0.05mg·L-1+IAA0.18mg·L-1+GA32.90mg·L-1中进行同时腋芽萌发、生长及菌根再生培养。55d为1个继代增殖周期，每瓶增殖倍数平均达60以上(图6)。
图1-图6是杜香菌根诱导及植株生长各阶段的根苗形态。
3结论与讨论
试验结果证明，培养基DR+KT0.05mg·L-1+IAA 0.18mg·L-1+GA32.90mg·L-1对杜香试管苗直接诱导菌根效果最好，速度快且诱导率高。带有菌根的苗由发根处又发出3～5根苗形成丛生状，植株生长势旺且根和苗的形态、发育均接近于野生植株，可能是菌根菌产生一定量的细胞分裂素、生长素等有利于植物生长的调节物质等原因，本实验采用杜香靠近根部新萌发的嫩芽为试材进行菌根诱导，并在试管内成功诱导出菌根，可能是杜香靠近根部的嫩芽中含有的内生菌密度较大容易诱导等原因，本研究通过对杜香菌根真菌菌株的分离和观察菌丝体形态及孢子形状初步判断，该种菌根真菌与内囊霉科(Endogonaceae)无梗囊霉属(Acaulospora)的浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa Morton)真菌相似，证明了杜香根中含有内生真菌；含菌根苗的快繁利用再生植株的茎节为材料，采取节增殖的方法，从而缩短了继代增殖周期，提高了增殖倍数，方法简捷，经济实用，可操作性强，达到了快繁的目标，可用于含菌根的杜香苗的工厂化育苗，且均在试管内进行，这一点也证实了杜香植株中含有内生菌类。同时，应用均匀设计处理、分析数据和再试验大大缩短了培养基配方的摸索周期。杜香菌根诱导技术的研究成功，可为长白山区野生资源的开发利用和中药质量标准化提供技术保障。
Claims (2)
1. 一种杜香属植物菌根试管内直接诱导、菌根化苗的快繁方法，其特征在于步骤如下：
（1）以杜香靠近根部新萌发的嫩芽为外植体，对外植体进行处理，菌根直接诱导培养基为：DR+KT0.05 mg·L-1+IAA 0.18 mg·L-1+GA32.90 mg·L-1；添加蔗糖15.0 g·L-1，琼脂粉7.8 g·L-1，调节pH 值为5.6，在温度23℃±2 ℃，光照强度1100 lx条件下培养，光照周期12 h·d-1；
（2）菌根真菌的分离：在超净工作台上将已诱导成功的菌根化苗连同菌根提出，用枪形镊子和手术刀将植株的根和苗分离后，将根转接到马丁-孟加拉红培养基中进行菌株分离培养；然后置于24±2 ℃培养箱中黑暗培养2～4 w，观察菌丝萌发情况，待菌落从根中长出后，利用光学显微镜在100－400倍下观察菌丝体形态和孢子形状；若菌落形态有差异，进行二次分离直至菌落形态一致性和均匀性；
（3）菌根真菌的回接：培养一批不含有菌根的杜香试管苗，在超净工作台上用长剪将浮在培养基表面的根剪掉一部分后，再用接种针挑取已分离的菌丝粘在杜香根的切面，置22±2℃的培养室中培养；60 d后统计菌根真菌侵染情况；
（4）菌根化植株的快繁：将含有菌根的试管苗于根上部留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的菌根诱导培养DR+KT0.05 mg·L-1+IAA 0.18 mg·L-1+GA32.90 mg·L-1中进行同时腋芽萌发、生长及菌根再生培养；55 d为1个继代增殖周期，每瓶增殖倍数平均达60以上。
2.按照权利要求1所述的杜香属植物菌根试管内直接诱导、菌根化苗的快繁方法，其特征在于对外植体进行处理是指在超净工作台上用含3.0%次氯酸钠溶液浸泡7 min，无菌水冲洗8次；用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切割成1～2叶1段作为外植体备用。
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