CN109722390B

CN109722390B - 一种猴头杜鹃菌根真菌菌株dps-a的分离纯化及其接种应用方法

Info

Publication number: CN109722390B
Application number: CN201811026039.5A
Authority: CN
Inventors: 刘亚; 王盼; 陈子林; 倪喜中; 宗侃侃; 张岑容; 周钰鸿; 陈江芳; 李月灵; 包金亮
Original assignee: Administration Of Zhejiang Dapanshan National Natural Reserve
Current assignee: Administration Of Zhejiang Dapanshan National Natural Reserve
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2038-09-04
Also published as: CN109722390A

Abstract

本发明公开了一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS‑A的分离纯化及其接种应用方法，包括以下步骤：（1）选菌根与称量；（2）根系表面灭菌；（3）检验灭菌效果；（4）根系组织匀浆；（5）菌株纯化；（6）菌株初步筛选；（7）菌剂制备；（8）菌株接种；（9）接种效应检测。优点有：菌株分离与纯化周期较短，技术操作简便，实现了猴头杜鹃菌根真菌分离与纯化的高效率与大规模操作。

Description

一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A的分离纯化及其接种应用方法

技术领域

本发明涉及一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A的分离纯化及其接种应用方法。

背景技术

菌根是高等植物营养根系与菌根真菌形成的共生体，是一种非常普遍的自然现象。菌根可扩大宿主植物根系的营养吸收表面积，促进植物产生细胞生长素等多种生长刺激物质，增强植物根系对病虫害的抗性，提高植物对重金属等有害物质的抗胁迫能力等，从而促进植物个体的生长并提高其抗逆性。大多数杜鹃花科（Ericaceae）植物的根系没有根毛结构，而是由大量纤细的须根状毛根组成，营养吸收表面积有限，因而对菌根具有很高的依赖性。然而杜鹃花科植物在人工栽培中，为了防止病虫侵害常常采用经过灭菌消毒处理的栽培基质，而使植物缺少合适的共生菌根真菌。对栽培的杜鹃花科植物接种合适的菌根真菌，可以促进它的生长并提高其抗性。

杜鹃花科植物菌根真菌的分离和纯化，是杜鹃花科植物菌根的基础性研究。目前一般采用根段直接培养法进行杜鹃花科植物菌根真菌的分离，需要把表面灭菌后的毛根切成0.5 ~ 1.0 cm的单条根段放在平板培养基上培养。但由于杜鹃花科植物的毛根非常细弱，因而该方法对操作精细度要求较高，难以开展大批量操作，限制了杜鹃花科植物菌根的基础性研究。

猴头杜鹃叶背密被锈毛、花开秀丽，萌发力强、耐修剪，根桩奇特，可作优良的景观花卉和盆景材料，自然分布于我国华东及华南地区海拔500~1800 m的山坡林中。蓝莓（Vaccinium corymbosu）是一种杜鹃花科的浆果植物，风味口感独特，营养价值丰富，而且生产栽培非常广泛，具有充足的苗源供应，常被选作杜鹃花科植物菌根真菌的接种应用对象。

本发明针对猴头杜鹃菌根真菌分离、纯化与接种应用方法的关键环节，开展了根系组织匀浆、匀浆液稀释浓度、菌剂制备与接种等关键技术筛选研究，得到了一株可促进杜鹃花科植物蓝莓生长的菌根真菌菌株DPS-A，探索了一套适合猴头杜鹃菌根真菌分离、纯化与接种应用的技术方法。

发明内容

为解决现有杜鹃花科植物菌根真菌分离与人工栽培技术的不足问题，本发明的目的是提供一种菌株分离与纯化周期较短、技术操作简便、实现了猴头杜鹃菌根真菌分离与纯化的高效率与大规模操作的猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A的分离纯化及其接种应用方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案：

一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A的分离纯化及其接种应用方法，包括以下步骤：

（1）选菌根与称量：将猴头杜鹃健壮的根系在清水中洗净泥土杂质，用滤纸吸干水分，剪去直径大于1 mm的粗根，保留直径在1 mm以下的纤细根系，称取0.05 g根系，切碎成0.3cm ~ 0.4 cm的碎根段，作为根系样品备用；

（2）根系表面灭菌：在超净工作台内将备好的根系样品用75%乙醇水浸泡15 s，无菌水漂洗3次~ 5次，再在10%的家用84消毒液中浸泡15 min，无菌水漂洗3次~ 5次；

（3）检验灭菌效果：用玻璃涂布器蘸取少量最后一遍漂洗根系样品的无菌水，均匀涂抹于马丁-孟加拉红培养基平板，作为对照组检验灭菌效果、排除杂菌；

（4）根系组织匀浆：将根系样品放入玻璃匀浆器，加入5 ml无菌水，上下转动研磨30次~ 40次，使根系组织匀浆化，分别用移液枪取根系组织匀浆液1 ml置入5 ml、10 ml、20ml、50 ml、100 ml烧杯中，添加无菌水稀释到1/5、1/10、1/20、1/50、1/100浓度，分别用移液枪取0.5 ml不同浓度的稀释液置于马丁-孟加拉红培养基平板的表面，用玻璃涂布器涂抹均匀，然后与对照组平板一起放置在25 ℃培养箱中暗培养；

（5）菌株纯化：培养3天~ 5天，待菌落从平板中长出，在超净工作台内用牙签挑取少量菌丝至麦芽浸膏琼脂培养基平板上，培养7天后观察菌落形态的一致性和均匀性，若菌落形态有差异，则进行二次分离，如此反复直至纯化；

（6）菌株初步筛选：把纯化后的菌株根据菌落形态特征进行描述记录和分类整理，指标包括菌落颜色、质地、边缘形状、直径、是否有液体分泌物等，初步剔除生长过快、明显不是杜鹃花科植物菌根真菌的菌株，其中，25℃暗培养两周后，菌落正面颜色为浅黄色、背面颜色为黄色，质地绒毡状，边缘形状不规则，菌株直径3.8 cm ~ 4.2 cm，无液体分泌物的菌株为菌株DPS-A；

（7）菌剂制备：在超净工作台内，用牙签挑取少量猴头杜鹃菌根真菌DPS-A的菌丝至麦芽浸膏琼脂培养基平板上，放置在25 ℃培养箱中黑暗培养2 ~ 3周后，选取菌落生长范围内、长满菌丝的培养基作为接种菌剂；

（8）菌株接种：将拟接种的蓝莓组培苗在超净工作台内移栽到菌株接种基质内，每瓶接种1株苗木，用脱脂棉将瓶身内壁擦净，将接种菌剂切成5 mm × 5 mm的方形菌丝块，浅埋在接种蓝莓周围1.5cm~ 2.0cm距离的基质表层，每瓶接种3个菌丝块，将没有菌丝生长的麦芽浸膏琼脂培养基切成同等大小的方块，浅埋在接种蓝莓周围1.5cm ~ 2.0cm距离的基质表层，每瓶接种3个培养基方块，作为对照组，将苗木置于25 ℃、光照周期10 h ~14 h，光照强度3000 lux的培养室进行培养；

（9）接种效应检测：培养60 天后，观察菌株接种组与未接种菌株组蓝莓的生长态势，检测并统计蓝莓的菌根侵染率、叶片增加数、高度增长率、鲜重增重率、干重增重率。

作为优选，所述的步骤（1）至步骤（9）中的材料与用具的准备包括：

（1）菌根材料：野外采集猴头杜鹃的健壮生活根，连同泥土保湿放在封口袋内，放置在冰桶内，带回实验室；

（2）玻璃匀浆器、玻璃涂布器：洗净晾干后用报纸包扎，121 ℃高压灭菌25 min，备用；

（3）5 ml、10 ml、20 ml、50 ml、100 ml烧杯，移液枪枪头：洗净晾干后用报纸包扎，121 ℃高压灭菌25 min，备用；

（4）滤纸、牙签：滤纸与牙签置于培养皿内并用报纸包扎，121 ℃高压灭菌25 min，备用；

（5）移液枪：置于超净工作台内紫外灯灭菌30 min，备用。

作为优选，所述的步骤（1）至步骤（9）中化学试剂与培养基的配置包括：

（1）75 %乙醇水：量取150 ml无水乙醇，用蒸馏水定容至200 ml；

（2）10 %家用84消毒液：量取10 ml家用84消毒液，用蒸馏水定容至100 ml；

（3）马丁-孟加拉红培养基：葡萄糖10 g，胰蛋白胨5 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5g，孟加拉红0.033 g，琼脂20 g，调节pH至5.0，蒸馏水定容至1000 ml，然后121 ℃高压灭菌20 min，冷却至60 ℃以下时于超净工作台中加入0.03 g链霉素，混合均匀倒入平板，冷却凝固后待用；

（4）麦芽浸膏琼脂培养基：麦芽浸膏20 g，胰蛋白胨1 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1000 ml，调节pH至5.0，然后121℃高压灭菌20 min，冷却至60 ℃以下时于超净工作台中加入0.03 g链霉素，混合均匀倒入平板，冷却凝固后待用；

（5）菌株接种基质：按照泥炭土与蛭石3：1的比例用自来水打湿后混合均匀，分装到组培瓶中，每个组培瓶装入约1/4瓶高的基质，盖紧瓶盖，然后121℃高压灭菌20 min，冷却后待用。

作为优选，所述的步骤（9）中菌根侵染率、叶片增加数、高度增长率、鲜重增重率、干重增重率的计算方法为：

菌根侵染率（％）=被侵染的根段数/镜检的总根段数×100％，叶片增加数（片）=培养60天后单棵苗木的平均叶片数－接种时单棵苗木的平均叶片数，高度增长率（%）=（培养60天后平均高度－接种时平均高度）/接种时平均高度×100%，鲜重增重率（%）=（培养60天后平均鲜重－接种时平均鲜重）/接种时平均鲜重×100%，干重增重率（%）=（培养60天后平均干重－接种时平均干重）/接种时平均干重×100%。

作为优选，所述的步骤（4）中用无菌水稀释到1/20浓度时，单个平板内出菌数量与出菌密度较为平衡与合适，既避免菌落长出数量过多、分布密度过大而相互覆盖、难以分离纯化，也避免单个平板内菌落长出数量过少、分布密度过稀而降低操作效率。

作为优选，所述的步骤（9）菌株接种组蓝莓的菌根侵染率高达76%，叶片增加数达5片，植株高度增长率达72.5%，鲜重增重率达81.8%，干重增重率达78.9%，均明显高于未接种菌株组蓝莓。

一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A，所述的核糖体脱氧核糖核酸（rDNA）内转录间隔区（ITS）序列为：

TTCCTTGGGTAGACCTCCCACCCTGTGTCGTTATACCTTCGTTGCTTTGGCGGGCCGCGGGGCCCCGGCCCCGCCCCTGGCTCCGGCTAGGGCGCGCCCGCCAGAGGACCTCAAAACCTGAATGTTAGTGTCGTCTGAGTACTATATAATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTCTTGGGCGTCACCGGTCCCGGTGTGCCTTAAAATCAGTGGCGGCGCCATCTGGCTCTAAGCGTAGTACATACTCTCGCTACAGACGTCCGGTGGATGCTGGCCAGCAACCCCCAACTTATCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA。

作为优选，所述的猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A的拉丁学名为Pezicula ericae，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年8月3日，保藏编号为CGMCC No.16093，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的有益条件在于：通过根系组织匀浆法，每0.05 g根系样品加入5 ml无菌水进行匀浆，其中匀浆液作20倍稀释浓度，培养基平板上出菌数量与出菌密度较为均衡，而且菌株分离与纯化周期较短，技术操作简便，实现了猴头杜鹃菌根真菌分离与纯化的高效率与大规模操作，为其他杜鹃花科植物的菌根研究提供了参考与借鉴，猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A，可与杜鹃花科植物蓝莓形成良好的共生关系，菌株接种60天后，菌根侵染率高达76%，叶片增加数达5片，植株高度增长率达72.5%，鲜重增重率达81.8%，干重增重率达78.9%，均显著高于未接种的蓝莓，对于促进栽培环境缺少菌根真菌共生的杜鹃花科植物菌根化应用，提升杜鹃花科植物市场化供苗能力具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明中根系组织匀浆液稀释到1/20浓度时在马丁-孟加拉红培养基上培养5天时菌落生长效果。

图2 为本发明菌株DPS-A纯化后在麦芽浸膏琼脂培养基上培养7天后的菌落形态。

图3 为本发明中菌株接种组与未接种菌株组蓝莓培养60天后的叶片生长对比。

图4 为本发明中菌株接种组与未接种菌株组蓝莓培养60天后的全株对比。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实例，进一步阐述本发明。但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用药品与试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市场销售购买获得的常规产品

通过本方法，统计不同稀释浓度对培养基上出菌数量与出菌密度影响，结果如下表所示：

稀释浓度	25 ℃暗培养5天后出菌情况描述
		1/5	单个平板内菌落生长过于密集，很难有效纯化菌株
1/10	单个平板内菌落生长10 ~ 16个，较难纯化菌株
		1/20	单个平板内菌落生长6 ~ 9个，容易纯化菌株
1/50	单个平板内菌落最多生长1 ~ 3个，菌根真菌分离效率较低
		1/100	单个平板内几无菌落生长，菌根真菌分离效率极低

在猴头杜鹃菌根真菌的分离、纯化过程中，用无菌水将根系组织匀浆液稀释到1/20浓度，平板培养5天，单个平板内菌落生长6~9个，相邻菌落相互覆盖程度较轻，菌落的长出数量与分布密度较为均衡，既避免单个平板内菌落长出数量过多、分布密度过大而相互覆盖、难以分离，也避免单个平板内菌落长出数量过少、分布密度过稀而降低试验效率。

通过本方法，统计菌株接种组与未接种菌株组蓝莓的菌根侵染率、叶片增加数、高度增长率、鲜重增重率、干重增重率，统计结果如下表所示：

处理	菌根侵染率（%）	叶片增加数（片）	高度增长率（%）	鲜重增重率（%）	干重增重率（%）
						菌株接种组	76	5	72.5	81.8	78.9
未接种菌株组	0	3	44.6	48.3	39.8

通过本方法，接种本发明猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A的蓝莓的菌根侵染率达到76%，叶片增加数达5片，植株高度增长率达72.5%，鲜重增重率81.8%，干重增重率达78.9%，均明显高于未接种菌株组的蓝莓。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省大盘山国家级自然保护区管理局

<120> 一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A的分离纯化及其接种应用方法

<130> 2018.9.4

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 519

<212> DNA

<213> Rhododendron simiarum Hance

<400> 1

ttccttgggt agacctccca ccctgtgtcg ttataccttc gttgctttgg cgggccgcgg 60

ggccccggcc ccgcccctgg ctccggctag ggcgcgcccg ccagaggacc tcaaaacctg 120

aatgttagtg tcgtctgagt actatataat agttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 180

ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag 240

tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gccccttggt attccggggg gcatgcctgt 300

tcgagcgtca ttacaaccct caagctctgc ttggtcttgg gcgtcaccgg tcccggtgtg 360

ccttaaaatc agtggcggcg ccatctggct ctaagcgtag tacatactct cgctacagac 420

gtccggtgga tgctggccag caacccccaa cttatcaagg ttgacctcgg atcaggtagg 480

gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaa 519

Claims

1.一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A，其特征在于，所述的猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A的拉丁学名为Pezicula ericae，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年8月3日，保藏编号为CGMCC No.16093，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。