CN107083335A

CN107083335A - 一株dse真菌及蓝莓组培苗快速菌根化的方法

Info

Publication number: CN107083335A
Application number: CN201710277651.9A
Authority: CN
Inventors: 宿红艳; 程显好; 宋方圆; 李媛媛; 孙志超; 曹思琪
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2017-08-22
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: CN107083335B

Abstract

一株DSE真菌及蓝莓组培苗快速菌根化的方法，属于生物技术领域，所述菌株为R16，保藏编号为：CGMCC No.13885。本发明还建立了所述菌株与蓝莓组培苗快速菌根化的方法。该体系采用灭菌苔藓作为无菌条件下的共培养基质，DSE接种剂采用液体培养方法。与现行的采用菌块接种的方法相比，接种液体培养的菌株R16生长快，与蓝莓根菌接触充分，共培养时短，定植率高。DSE菌株R16对蓝莓组培苗生长有显著的促进作用。与未接种对照相比，接种DSE菌的蓝莓苗生长有显著优势，叶片大而浓绿，根系发达，移栽成活率高。

Description

一株DSE真菌及蓝莓组培苗快速菌根化的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体地涉及一株DSE真菌及蓝莓组培苗快速菌根化的方法。

背景技术

深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)是一类广泛存在于植物根内，且具有深色有隔菌丝的菌根真菌。已有的研究证实，DSE与宿主互惠共生，赋予植物优良生长性状，能提高宿主抗病虫能力及在胁迫环境中的抗逆性。

蓝莓(Vaccinium spp.)又称越橘，为杜鹃花科越橘属植物，是具有较高经济价值和广阔开发前景的新兴果树树种，栽培面积的扩大对蓝莓苗的市场需求也日益增大。蓝莓苗的繁育主要采用硬枝扦插和组织培养等方法。其中，组织培养方法繁殖速度快，适宜于优良品种的无病毒工厂化苗木繁育。目前，尽管许多蓝莓品种的组培快繁体系已建立，但仍存在幼苗生根困难，叶片发黄，移栽成活率低等问题，成为制约蓝莓苗规模化组培快繁的主要障碍。对蓝莓苗进行有益促生菌的接种，快速实现其菌根化是克服蓝莓组培苗生长缓慢，提高成活率的一个有效措施。

目前，已有学者对DSE与植物在无菌条件下的共生培养体系开展研究。现行的方法多是采用改良的植物固体培养基，接入的DSE菌种是菌块或菌片的形式。但该方法在实施过程中往往出现DSE菌片在植物培养基中生长缓慢，植物根系不能与DSE充分接触，从而造成共培养周期长、侵染效率低的情况。因此，上述方法不适于根系纤细不发达植物如蓝莓与DSE的共生培养。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一株DSE真菌及蓝莓组培苗快速菌根化的方法，所述菌株为R16，其分类命名为Tricladium splendens，已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)保藏，其保藏编号为：CGMCC No.13885。该菌株菌落为灰白色，绒毡状，边缘光滑，菌落背面灰黄色。菌丝分叉，由主轴从不同平面发出2个侧枝，顶部渐尖，菌丝内有隔，能产生孢子。

本发明为解决蓝莓组培快繁中幼苗生根率低，生长缓慢，移栽成活率低等问题提供了有效途径；稳定高效的DSE菌与蓝莓组培苗共生体系为研究DSE与蓝莓互作机理提供了理想实验系统，也为建立DSE与其它植物尤其是根系纤细植物的共生体系提供借鉴。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一株DSE真菌，所述菌株为R16，其分类命名为Tricladium splendens；该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为：CGMCCNo.13885。

本发明还提供一种所述菌株与蓝莓组培苗快速菌根化的方法，所述方法的具体步骤如下:

1)蓝莓苗的培养

选取生长状态良好，株高4-5cm的蓝莓组培苗进行快速繁殖，选取繁殖的高5-7cm生长状态良好的蓝莓组培苗进行生根培养；

2)DSE接种剂的制备

取斜面保存的菌种R16接入含有50mL PDA培养液的250mL三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震荡培养10天，制备种子液；将种子液按10％(体积比)接入量接入到装有新鲜PDA培养液的三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震荡培养10-15天，备用；所用PDA培养液的成分及终浓度：0.6％马铃薯浸粉，2％葡萄糖，pH 5.6；高压灭菌；

3)共培养基质的准备

先将干苔藓剪短，用清水洗净，在蒸馏水中浸泡过夜，让其充分吸水，pH为5.5，再分装到组培瓶中，容器装量体积比为15％-25％，121℃高压灭菌1hr，备用；

4)DSE真菌与蓝莓共生体系的建立

将步骤1)制备的生长状态良好的生根蓝莓苗接入步骤3)制备的共培养基质中，再加入6-8mL步骤2)制备的DSE接种剂，接种后，放至23-25℃，2000-3000lx的光强，光照时间8-16h/天条件下进行共培养；

5)共培养体系的检测

共培养一周后，在共培养基质中有明显的DSE菌丝的生长；30天后取出蓝莓苗，洗净根部，然后将根系剪成4‐5cm长的根段将其放入提前配制好的FAA固定液中固定；12小时后，将蓝莓根段从FAA固定液中取出，冲洗后脱色，随机选取蓝莓根段，在显微镜下镜检观察深色有隔内生真菌的定殖情况，当部分根段看到深色有隔内生真菌的典型特征结构--微菌核时，表明深色有隔内生真菌-植物共生体系建立。

进一步，所述的脱色方法为经过10％KOH(g/ml)透明处理、质量比为10％H₂O₂漂白、质量比为1％HCl酸化、0.05％(g/ml)台盼蓝染色和体积比为50％甘油脱色。

本发明还提供一种包含所述菌株发酵菌液的蓝莓生根制剂。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明从蓝莓根部筛选了一株DSE菌株R16，所述菌株为一株Tricladiumsplendens，已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)保藏，其保藏编号为：CGMCC No.13885，建立了所述菌株与蓝莓组培苗快速菌根化的方法。该体系采用灭菌苔藓作为无菌条件下的共培养基质，DSE接种剂采用液体培养方法。与现行的采用菌块接种的方法相比，接种液体培养的菌株R16生长快，与蓝莓根菌接触充分，共培养时短，定植率高。DSE菌株R16对蓝莓组培苗生长有显著的促进作用。与未接种对照相比，接种DSE菌的蓝莓苗生长有显著优势，叶片大而浓绿，根系发达，移栽成活率高。

附图说明

图1 R16菌落形态特征：A,菌落正面；B，菌落反面；

图2 R16菌丝形态特征；

图3 R16在蓝莓根内定植的菌丝和微菌核：A，箭头所指为细胞内的R16菌丝；B，箭头所指为细胞内的R16微菌核；

图4 R16对蓝莓组培苗的促生效应：A未接种，B接种R16菌块，C接种R16菌块；

菌株为R16，其分类命名为Tricladium splendens；该菌株保藏于2017年4月11日中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏编号为：CGMCC No.13885。

具体实施方式

实施例1

蓝莓根内生真菌的分离、纯化，步骤如下：

1、用清水洗净蓝莓根段，然后将其转移至超净工作台中进行如下操作：将根段浸泡在10％(质量比)双氧水中8min，期间用无菌镊子轻轻翻动几次，以保证消毒彻底；无菌水漂洗2-3次后，将其转入6％(质量比)次氯酸钠，浸泡15分钟，无菌水漂洗2次；滤纸吸干根段表面残留的液体。将消毒后的根段用无菌的剪刀剪成0.5cm长的根段，接入制备好的PDA平板，于25℃恒温培养箱中黑暗倒置培养。PDA平板的配方：0.6％马铃薯浸粉，2％葡萄糖，2％琼脂，pH5.6。115℃灭菌20min，冷却至60℃时，加入无菌的氨苄青霉素(50ug/mL)和硫酸链霉素(100ug/mL)。上述各成份浓度均为PDA培养基中的终浓度。

2、当发现组织切口处有真菌长出来的时候，尽快用接种针将其挑入不加青霉素和链霉素的PDA平板中，25℃恒温培养箱中黑暗倒置进行纯化培养，转移3-5次后得到纯菌落。

实施例2菌株R16的形态和分子生物学鉴定

1、挑取上述保存的纯化菌种，接种到PDA平板中，于25℃恒温培养箱中培养活化1-2周。用直径为0.5cm的无菌打孔器从菌落的最外层打取菌饼，接种到新的PDA平板上，于25℃恒温培养箱中培养1周，观察菌落的形态。R16菌落为灰白色，绒毡状，边缘光滑，菌落背面为灰黄色(图1)。

2、用接种针挑取少量纯化后的单菌落菌丝，将其放入滴有一滴生理盐水的载玻片上制成临时装片，并在显微镜下观察内生真菌的菌丝结构。菌丝分叉，由主轴从不同平面发出2个侧枝，顶部渐尖，菌丝内有隔，能产生孢子(图2)。

3、对菌种进行分子生物学鉴定。采用全式金的Plant Genomic DNAKit试剂盒提取培养菌丝的基因组DNA，扩增引物是ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′和ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′。PCR反应体系(25μL)包括：2.5μL 10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)，2μL dNTP(2.5mM each)，1.5μL ITS1(10μM)，1.5μL ITS4(10μM)，0.2μLTaq酶，2μL基因组DNA，15.3μL ddH2O，。扩增反应程序为：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，35次循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物寄至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。将获得的rDNA基因间内源转录间隔区序列，即ITS序列(Internally Transcribed Spacer)，与美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的序列进行Blastn比对，与一株Tricladiumsplendens(GQ152146)相似度最高为98％。该菌种编号为R16，结合形态学鉴定为一株Tricladium splendens，已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC)保藏，其保藏号为CGMCCNo.13885。

测序结果：

GGAAGGATCATTACAGTGTTCCCTGCCCTTCGGGGTAGGACGCCACCCTTGATTATTTTATGAGTGTTGCTTTGGCGGGCCTCGCGGCCTGGCCGCGCCCCGGCTTCGGCGGGGGAGCGCCCGCCAGAGGATTCTACAAACCTGACTATTAGTGTCGTCTGAGTACTATATAATAGTTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCGTGGTATTCCGCGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTATAACCAATCCAGCTCGCTGGGTCTTGGGCACCGCCGCCAGGCGGGCCTCAAAATAAGTGGCGGTACGGCCGGACTCTGAGCGTAGTAAATCTTCTCGCTACAGGGTCCCGGGCGGCACTGGCCAGCAACCCCCAAATCTTTCACAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCC。

实施例3蓝莓组培苗的培养，步骤如下：

(1)蓝莓芽分化

选取生长状态良好，株高4-5cm的蓝莓组培苗进行快速繁殖。在超净工作台中用无菌的剪刀将组培瓶中的蓝莓植株从基部剪断，剪成2-3cm的茎段，然后用无菌的镊子将其接到含有分化培养基的组培瓶中，每瓶中接入3-4个茎段，均匀分散放置。所用的培养基是以WPM培养基为基本培养基，在每升WPM培养基中均添加蔗糖20g、琼脂5-10g，添加植物激素玉米素1.0-3.0mg，培养基pH5.0-5.5，培养容器装量10-30％，121℃高压灭菌20min。培养条件设置为23-25℃，2000-3000lx的光强，光照时间8-16h/天，培养时间40-60天。

(2)蓝莓生根培养

在超净工作台中，选取高6cm生长状态良好的蓝莓组培苗进行生根培养。用无菌的剪刀从蓝莓组培苗的基部剪断，然后用无菌的镊子将剪断的植株插入带有滤纸球的生根培养基中，植株插的深度以植株底部刚浸入培养基为宜，每瓶液体培养基中接入6-10株蓝莓苗。所用培养基为1/2WPM培养基为基本培养基，然后加入蔗糖20g，吲哚丁酸1-2.5mg，定容到1升，调培养基的pH为5.0-5.5，培养容器装量10-30％。将配好的液体培养基倒入装有滤纸球的组培瓶中，121℃高压灭菌20min。滤纸球以铺满组培瓶的底部以固定蓝莓幼苗。培养条件设置为23-25℃，2000-3000lx的光强，光照时间8-16h/天，培养时间40-60天。

实施例4不同接种方法的效果比较

1、DSE接种剂的制备

制备2两种R16接种剂：第一种是现行多采用的菌块的形式：取斜面保存的菌种，接入PDA平板，25-28℃倒置培养14天，备用。第二种是本发明采用的液体培养的形式：取斜面保存的菌种R16接入含有50mL PDA培养液的250mL三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震荡培养10天，制备种子液。将种子液按10％接入量接入到装有100mL新鲜PDA培养液的500mL三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震荡培养10-15天，备用。所用PDA液体培养基的组成：0.6％马铃薯浸粉，2％葡萄糖，pH 5.6，分装到500mL三角瓶中，每瓶分装100mL，并放入10-20个直径为3-5mm的玻璃球，121℃高压灭菌20min。

共培养基质的准备

2、共培养基质的制备

先将干苔藓剪短，用清水洗净，在蒸馏水中浸泡过夜，让其充分吸水，pH5.5，再分装到组培瓶中，容器装量为15％-25％，121℃高压灭菌1hr，备用。

3、DSE真菌与蓝莓共生体系的建立

选择生长状态良好的生根蓝莓苗用无菌的镊子接入上述制备共培养基质中。设置三个实例组：一个不接菌对照组和两个接菌实例组。两个接菌实例组分别采用两种方法：一是利用上述制备的R16培养平板，使用打孔器打取直径5mm的R16菌块，每棵蓝莓苗周围均匀放置3块。二是采用本发明优化的方法：用移液枪加入6-8mL上述制备的R16培养液。吸取前，需要将DSE接种剂晃动混匀。移液枪头前端需剪掉2-3mm，并灭菌后才能使用。每组各20瓶蓝莓苗，均放至23-25℃，2000-3000lx的光强，光照时间8-16h/天条件下进行共培养。

4、共培养体系的检测

共培养30天时，从上述3个实例组各取10瓶蓝莓苗检测R16在蓝莓根部的定植情况，剩余10瓶蓝莓苗继续培养，用于分析R16对蓝莓苗的接种效应。用清水洗净根部，然后用剪刀将根系剪成4‐5cm长的根段将其放入提前配制好的FAA固定液中固定。时间后，将蓝莓根段从FAA固定液中取出，用蒸馏水冲洗3次。经过10％KOH(g/ml)透明、质量比为10％H₂O₂漂白、质量比为1％HCl酸化、0.05％(g/ml)台盼蓝染色和体积比为50％甘油脱色后，随机选取蓝莓根段，在显微镜下镜检观察深色有隔内生真菌的定殖情况，当部分根段看到深色有隔内生真菌的典型特征结构--微菌核时，表明深色有隔内生真菌-植物共生体系建立。结果显示，接种R16培养液的蓝莓苗根中，R16菌丝定殖率达到21.1％，微菌核的定殖率为6.8％(图3)；而接种R16菌块的蓝莓根中，仅观察到R16菌丝定植，定植率为7.9％；未接菌对照组的蓝莓根样中没有观察到相应的菌丝和微菌核。同时，从上述两个接菌实例组的蓝莓根样中，只分离得到与接种剂形态特征相同的DSE菌株R16，进一步表明R16在蓝莓根内成功定植。以上结果说明，对于根系纤细不发达的蓝莓苗来说，采用液体培养的接种剂可有效提高DSE真菌定植率，实现快速菌根化。

5、DSE菌对蓝莓组培苗的促生效应

共培养90天后，观察接种R16对蓝莓苗生长的影响。与未接种对照相比，接种R16的蓝莓苗生长均表现出优势，根系发达，叶片大而浓绿。接种R16培养液实验组的蓝莓苗优势更为显著(图4)。

实施例5适宜共培养基质的筛选

选择苔藓、草炭土和蛭石三种常用栽培基质按不同体积比例混合作为待用共培养基质。设定三个实例组：苔藓：草炭土：蛭石1：1：1；苔藓：草炭土1：1；纯苔藓。先将干苔藓(pH5.5)剪短，用清水洗净，在蒸馏水中浸泡过夜，让其充分吸水，按不同体积比例与草炭土或蛭石混合，分装到培养瓶中，容器装量为15％-25％。，121℃高压灭菌2hr，备用。按实施例4中的步骤3接入蓝莓生根苗和菌株R16液体接种剂。每组各10瓶蓝莓苗，均放至23-25℃，2000-3000lx的光强，光照时间8-16h/天条件下进行共培养。共培养50天时，检测上述三个实例组中R16在蓝莓根部的定植情况。检测方法同实施例4的步骤4。表1示在不同共培养基质中R16对蓝莓根部定植率的比较。在苔藓、草炭土、蛭石三种等体积混合的基质中，R16的定植率最低，而在纯苔藓中，R16定植率最高。并且，以纯苔藓作为共培养基质，操作更简单，因此本发明确定纯苔藓为最佳共培养基质。

表1不同共培养基质对R16在蓝莓根内定植率的影响

本发明提供了一株DSE真菌R16及利用所述菌株快速、高效实现蓝莓组培苗菌根化的方法，因此该菌株的菌液可以制成蓝莓促生长制剂，在蓝莓苗工厂化组培快繁中推广应用，具有广阔的应用前景和市场空间。

SEQUENCE LISTING

<110> 鲁东大学

<120> 一株DSE真菌及蓝莓组培苗快速菌根化的方法

<130> 无

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 512

<212> DNA

<213> Tricladium splendens

<400> 1

ggaaggatca ttacagtgtt ccctgccctt cggggtagga cgccaccctt gattatttta 60

tgagtgttgc tttggcgggc ctcgcggcct ggccgcgccc cggcttcggc gggggagcgc 120

ccgccagagg attctacaaa cctgactatt agtgtcgtct gagtactata taatagttaa 180

aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 240

aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccc 300

gtggtattcc gcggggcatg cctgttcgag cgtcattata accaatccag ctcgctgggt 360

cttgggcacc gccgccaggc gggcctcaaa ataagtggcg gtacggccgg actctgagcg 420

tagtaaatct tctcgctaca gggtcccggg cggcactggc cagcaacccc caaatctttc 480

acaggttgac ctcggatcag gtagggatac cc 512

Claims

1.一株DSE真菌，其特征在于所述菌株为R16，其分类命名为Tricladium splendens；该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCCNo.13885。

2.权利要求1所述菌株与蓝莓组培苗快速高效菌根化的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下:

1)蓝莓苗的培养

2)DSE接种剂的制备

取斜面保存的菌种R16接入含有50mL PDA培养液的250mL三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震荡培养10天，制备种子液；将种子液按体积比10％接入量接入到装有新鲜PDA培养液的三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震荡培养10-15天，备用；所用PDA培养液的成分及终浓度：质量比为0.6％马铃薯浸粉，质量比为2％葡萄糖，pH 5.6；高压灭菌；

3)共培养基质的准备

先将干苔藓剪短，用清水洗净，在蒸馏水中浸泡过夜，让其充分吸水，pH为5.5，再分装到组培瓶中，容器装量体积比为15％-25％，高压灭菌，备用；

4)DSE真菌与蓝莓共生体系的建立

5)共培养体系的检测

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的脱色方法为经过10％(g/ml)KOH透明处理、质量比为10％H₂O₂漂白、质量比为1％HCl酸化、0.05％(g/ml)台盼蓝染色和体积比为50％甘油脱色。

4.一种包含权利要求1所述菌株发酵菌液的蓝莓促生长制剂。