CN110699261A

CN110699261A - 一株促进药用石斛种子萌发形成幼苗的蜡壳耳目真菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN110699261A
Application number: CN201910945692.XA
Authority: CN
Inventors: 高江云; 王新菊
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110699261B

Abstract

本发明公开一株促进药用石斛种子萌发形成幼苗的蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:M 2019744，本发明提供了该菌株的形态学及其生理生化特征。根据形态学、生理生化、核苷酸序列及系统发育分析结果表明，Sebacinales sp.LQ属于蜡壳耳目的一株真菌，该菌株可用于促进铁皮石斛种子和曲茎石斛种子萌发形成幼苗，具有较强的专一性，可利用蜡壳耳目真菌菌株分别接种铁皮石斛种子与曲茎石斛种子获取优质的共生种苗，实现共生萌发的高效培育种苗，可用于苗圃育苗或野外树干种子直播，相对于组织培养具有成本低廉，野外成活率高，无组织退化问题等优点，具有代替组织培养获得共生种苗的应用价值。

Description

一株促进药用石斛种子萌发形成幼苗的蜡壳耳目真菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株促进药用石斛种子萌发形成幼苗的蜡壳耳目真菌菌株及其应用，属于应用微生物领域。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale)和曲茎石斛(Dendrobium flexicaule)作为我国传统名贵中药材，有着极高的药用价值，已有2000多年的使用历史，被誉为“中华九大仙草之首”和“还魂草”。过去以采集野生石斛为主，由于野生资源枯竭，从上世纪90年代开始石斛产业以大棚集约化栽培为主，通过近30年的发展，这样的产业模式由于基础设施投入巨大、种植技术要求高、产品安全性和道地性受到质疑等问题。目前整个药用石斛产业处于转型期，生态栽培已被业界认为是石斛产业发展的方向。

由于兰科植物种子本身的生物学特性：种子非常细小仅有发育不完全的胚，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质。目前兰科植物种子的萌发，多采用人工培养基在无菌条件下进行非共生萌发，萌发率虽高，但在进行濒危种类野外回归时，非共生萌发(无菌萌发)幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受阻。而通过种子和真菌的共生萌发获得的幼苗在回归到自然生境后具有较好的环境适应性。因此获得促进种子萌发的有效共生真菌是进行珍稀濒危兰科植物保护的第一步，也是开展生态栽培的关键环节。有效真菌的获得目前多采用从兰科植物野生植株的根中分离，但由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得种子萌发有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供了一株促进药用石斛种子萌发形成幼苗的蜡壳耳目真菌菌株及其应用，该菌株已于2019年9月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019744。

本发明所述蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明所述蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ，其nrDNA ITS序列提交美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)保存，其Genbank号为：MN173026.1；进行BLAST比对，鉴定结果表明该菌株与其与MH348615.1真菌Sebacinalessp.最为相似，最大相似度达到98.38％，以及系统发育分析结果表明其分类上属于蜡壳耳目的一株真菌(如图1所示)。

本发明所述分子生物学鉴定涉及的真菌总DNA提取采用CTAB法；PCR扩增所用引物为真菌通用引物ITS4和ITS5；PCR反应体系和条件参照相应的产品说明书进行；扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序；在美国国立生物技术信息中心数据库对所测序列进行比对分析，结合形态学特征确认其分类学地位。

本发明中所述的蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ的分离：

(1)原球茎的获得：2018年9月在重庆罗田铁皮石斛和曲茎石斛的原生境采集到自然萌发的24颗铁皮石斛原球茎和3颗曲茎石斛原球茎，用湿润苔藓包裹好后带回；

(2)原球茎内共生真菌的诱导、分离纯化及保存：取出萌发的铁皮石斛原球茎和/或曲茎石斛原球茎，放入盛有1％次氯酸钠(NaClO)溶液的灭菌烧杯中，轻轻摇动烧杯，5min后用灭菌钝头镊子取出，用无菌水冲洗3～4次；在超净工作台上，用无菌刀片将铁皮石斛原球茎和/或曲茎石斛原球茎切成两半，置于PDA培养基中25℃培养箱培养，待在铁皮石斛原球茎和/或曲茎石斛原球茎伤口处长出真菌菌丝，不断地切取菌丝尖端到新的PDA培养基上作系列转移，转移3～5次后，可得纯菌落；

(3)真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存：将配制好的适量PDA培养基倒入规格为18×20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的1/3，硅胶塞后，放入高压灭菌锅内灭菌(121℃，20min)，灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待用，在超净工作台上，将纯化后的菌株用无菌接种针挑取边缘菌丝接种于PDA斜面上，并注明菌种、编号、日期；将接种后的试管置于人工气候箱内25±2℃培养，待菌丝要长满PDA斜面时，将试管取出存入4℃冰箱内保存；

分离得到的菌株于2019年1月4日保藏在云南大学生态学与进化生物学实验室兰科植物菌根真菌库，该菌株分类命名为蜡壳耳目菌(Sebacinales sp.)LQ，保藏号为YUOF10001；并已于2019年9月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M2019744。

蜡壳耳目菌LQ菌株的鉴定：

将蜡壳耳目菌LQ菌株的nrDNA ITS序列提交美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)保存，其Genbank号为：MN173026.1；对其进行BLAST比对，鉴定结果表明该菌株与其与MH348615.1真菌Sebacinales sp.最为相似，最大相似度达到98.38％；

本发明中所述的蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ主要具有以下微生物学特征(如表1所示)：

1、形态学特征

蜡壳耳目菌株在PDA平板上培养7天其菌落呈浅棕褐色，略显放射状，规则圆形发散生长，表面湿润；

2、生理生化特性

观察菌株显微形态特征使用盖玻片插片培养法，在25±2℃条件下霉菌培养箱内培养7～14天，取插片按常规制片方法制片。光学显微镜下观察,菌丝具隔膜，粗2.5～5.5μm，细胞长20.0～74.0μm，分枝近直角，分枝菌丝在分枝不远处有隔膜；菌丝大致分两种类型，一类菌丝较规则，细长；另一类略显不规则，其上生有较多厚垣孢子；老菌丝细胞壁有加厚现象。培养1周以上开始形成串珠状的厚垣孢子，厚垣孢子数量不等2～7个，孢子可生出孢子链，孢子出芽生殖或从孢子侧壁长出孢子链，孢子之间有隔膜开，孢子细胞壁稍微加厚。

根据形态学、生理生化、核苷酸序列及系统发育分析结果表明，Sebacinalessp.LQ属于蜡壳耳目的一株真菌。

本发明另一目的是提供蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ在促进药用石斛种子萌发形成幼苗中的应用。

蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ在促进铁皮石斛Dendrobium officinale种子和曲茎石斛Dendrobium flexicaule种子萌发形成幼苗中的应用：

(1)配制共生萌发培养基：共生萌发培养基为燕麦琼脂培养基，包括4g·L^-1燕麦粉和8g·L^-1琼脂，培养基pH为5.6～5.8；

(2)将蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ取出，接种在PDA培养基上，然后置于人工气候箱内，在温度为25±2℃培养活化至真菌菌丝长满培养皿得到共生萌发菌株；

(3)将消毒灭菌预处理的铁皮石斛Dendrobium officinale种子或曲茎石斛Dendrobium flexicaule种子加入到1g·L^-1的无菌琼脂悬浮液中混合均匀得到种子悬浮液，再将种子悬浮液均匀的播撒在燕麦琼脂培养基的培养皿中；

(4)将共生萌发菌株接种至燕麦琼脂培养基的培养皿中，再置于人工气候箱内，在温度为25±2℃条件下恒温培养，其中光照周期L/D＝12/12，光照强度为2000～3000Lx；

(5)种子萌发情况检测和数据统计分析：统计4个阶段，即种子未萌发、种子萌发(种胚膨大并产生根状物)、原球茎形成和发育(种胚膨大突破种皮至出现原生分生组织)、幼苗分化和发育阶段(长出第一片叶片及后续生长)的量，计算出种子萌发率(G)、形成原球茎率(C)以及幼苗率(K)，

G＝mean(g/t)±SE,C＝mean(c/t)±SE，K＝mean(k/t)±SE；其中，g为每种处理下的各培养皿中萌发的种子数；c为每种处理下的各培养皿中形成原球茎的种子数(原球茎与幼苗之和)，k为每种处理下的各培养皿中处于各萌发阶段的幼苗数量；t为各培养皿中播种的种子数；SE为标准误；

利用非参数检验方法Kruskal-Wallis test(KW)和Mann-Whitney U–test(U)对不同处理的种子萌发率、形成原球茎比率及幼苗率进行显著性检验，α＝0.05。

所述步骤(3)消毒灭菌预处理方法：将储存在温度为-20℃中的种子取出，放在室温下10h，使种子温度恢复至室温；将种子放在纸质的种子包内，用订书钉将纸袋封好；将装有种子的纸袋浸泡在蒸馏水中5～10min，轻轻的挤压出气泡；用镊子将纸袋转移到盛有次氯酸钠溶液(有效氯离子浓度为1％)及一滴洗涤剂的烧杯中，轻轻搅拌或摇动烧杯；10min后，将纸袋移至超净工作台，用无菌镊子将纸袋转移到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，轻轻摇动；重复冲洗种子3～4次，轻轻挤压出纸袋内多余的水，用无菌剪刀剪开纸袋获得灭菌种子。

本发明的蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ具有如下优点：

(1)本发明蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ从铁皮石斛和曲茎石斛原球茎中分离获取，其分离方法简单便捷；

(2)蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ可用于促进铁皮石斛Dendrobiumofficinale种子和曲茎石斛Dendrobium flexicaule种子萌发形成幼苗，具有较强的专一性，可利用蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ分别与铁皮石斛种子和曲茎石斛种子共生获取优质的共生种苗，实现药用铁皮石斛和曲茎石斛共生萌发的高效培育种苗；

(3)本发明蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ分别与铁皮石斛种子和曲茎石斛种子共生可用于苗圃育苗或者野外树干种子直播，相对于组织培养具有成本低廉，野外成活率高，无组织退化问题等优点，具有代替组织培养获得共生种苗的应用价值；

(4)本发明工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，在珍稀濒危兰科植物的回归、药用兰科植物的仿生态栽培、解决药用铁皮石斛和曲茎石斛栽培产业的种苗来源瓶颈问题等方面都具有巨大的推广价值。

附图说明

图1是本发明蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ的基因序列的系统发育进化树。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进一步的详细说明，但是本发明的保护范围并不仅限于所述内容。

实施例1：蜡壳耳目菌(Sebacinales sp.)LQ菌株的分离

(2)原球茎内共生真菌的诱导、分离纯化及保存：取出萌发的铁皮石斛原球茎和/或曲茎石斛原球茎，分别放入盛有1％次氯酸钠(NaClO)溶液的灭菌烧杯中，轻轻摇动烧杯，5min后用灭菌钝头镊子取出，用无菌水冲洗3～4次；在超净工作台上，用无菌刀片将铁皮石斛原球茎和/或曲茎石斛原球茎切成两半，置于PDA培养基中25℃培养箱培养，待在铁皮石斛原球茎和/或曲茎石斛原球茎伤口处长出真菌菌丝，不断地切取菌丝尖端到新的PDA培养基上作系列转移，转移3～5次后，可得纯菌落；

分离得到的菌株于2019年1月4日保藏在云南大学生态学与进化生物学实验室兰科植物菌根真菌库，该菌株分类命名为蜡壳耳目菌(Sebacinales sp.)LQ，保藏号为YUOF10001；并已于2019年9月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M2019744；

分子生物学鉴定涉及的真菌总DNA提取采用CTAB法；PCR扩增所用引物为真菌通用引物ITS4和ITS5；PCR反应体系和条件参照相应的产品说明书进行；扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序；在美国国立生物技术信息中心数据库对所测序列进行比对分析，结合形态学特征确认其分类学地位；

具体的，采用CTAB法提取真菌DNA，PCR扩增所用引物为ITS1和ITS4；PCR反应体系(25μl)包括：2.5μl 10×PCR缓冲液，0.4μl dNTP，1.5μl Mg2+，1.5μl ITS1，1.5μl ITS4，0.2μl Taq酶，15.4μl ddH2O，2μl DNA模板；扩增反应在PCR仪Perkin Elmer上进行，如下PCR循环：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，30次循环；最后72℃延伸10min；PCR扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序；对所测序列提交美国国立生物技术信息中心数据库进行比对，初步确认其分类下地位；

通过BLAST搜索将本实施例菌株的所有序列与其从GenBank数据库下载的最近的序列进行比较，以角担菌属的菌株Ceratobasidium AG-B(o)和Ceratobasidium 1246作为外群；核苷酸序列的比对由Clustal X version 1.81进行；采用基于最优模型Kimura 2-parameter+Gamma模型(BIC＝8533.566,AIC＝8265.917,lnL ＝-4095.821)的最大似然法在MEGA7.0中进行系统发育分析，自展检验值＝1000；采用最近邻交换法得到启发式搜索的初始树；相关分类单元聚集在一起的树的百分比显示在分支旁边，所有包含间隙和丢失数据的位置都从数据集中删除；

本实施例菌株与其与MH348615.1真菌Sebacinales sp.最为相似，最大相似度达到98.38％；根据菌落、形态特征及分子生物学手段将本实施例真菌鉴定为蜡壳耳目真菌。

实施例2：蜡壳耳目菌LQ菌株促进铁皮石斛共生萌发有效性实验：

利用种子与真菌在培养基内的共生萌发实验来检测分离到的真菌是否对种子萌发阶段有促进效果以及对比不同真菌对种子萌发阶段促进效果的差异：

(1)配制共生萌发培养基：共生萌发培养基为燕麦琼脂培养基，包括4g·L^-1燕麦粉和8g·L^-1琼脂，培养基pH为5.6～5.8；制备360皿燕麦培养基灭菌备用，共6个处理组；

(2)将存于温度为4℃试管斜面内的供试蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ取出，接种在PDA培养基上，然后置于人工气候箱内，在温度为25±2℃培养活化至真菌菌丝长满培养皿得到共生萌发菌株；

(3)将消毒灭菌预处理的铁皮石斛Dendrobium officinale种子加入到1g·L^-1的无菌琼脂悬浮液中混合均匀得到种子悬浮液，用移液枪吸取种子悬浮液并将种子悬浮液均匀的播撒在燕麦琼脂培养基的培养皿中；其中消毒灭菌预处理方法：将储存在温度为-20℃中的种子取出，放在室温下10h，使种子温度恢复至室温；将种子放在纸质的种子包内，用订书钉将纸袋封好；将装有种子的纸袋浸泡在蒸馏水中5～10min，轻轻的挤压出气泡；用镊子将纸袋转移到盛有次氯酸钠溶液(有效氯离子浓度为1％)及一滴洗涤剂的烧杯中，轻轻搅拌或摇动烧杯；10min后，将纸袋移至超净工作台，用无菌镊子将纸袋转移到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，轻轻摇动；重复冲洗种子3～4次，轻轻挤压出纸袋内多余的水，用无菌剪刀剪开纸袋获得灭菌种子；

(4)播种与培养：将无菌种子与1g·L^-1无菌琼脂溶液制作成无菌种子悬浮液；在OMA培养基中间接种约0.5cm³(1×1×0.5cm)含有单一真菌纯培养物的琼脂块，用移液枪吸取150μl种子悬浮液(150微升的悬浮液约含35粒种子)均匀播种菌块四周，用封口膜将培养皿密封；其中3组燕麦琼脂培养基的培养皿中分别接种从铁皮石斛原球茎中分离得到的3株不同菌株，分别是JM(Tulasnella calospora)、LQ(Sebacinales sp.)、SSCDO-5(Tulasnella sp.)，一组燕麦琼脂培养基的培养皿中接种从金钗石斛(Dendrobiumnobile)原球茎中分离得到的菌株JC-1(Sebacinaceae sp.)；另外2组燕麦琼脂培养基的培养皿中分别设置不接菌的MS和OMA培养基作为营养丰富培养基和营养缺乏培养基作为对照处理；每组处理30个重复，再置于人工气候箱内，在温度为25±2℃条件下恒温培养，其中光照周期L/D＝12/12，光照强度为2000～3000Lx；

(5)播种后30天检测种子萌发情况，记录种子萌发及形成原球茎的时间；培养60天后，当培养皿中产生大量处于发育初期阶段的幼苗时将全部培养皿取出，在立体显微镜下观察记录种子萌发及原球茎发育情况；种子萌发情况检测和数据统计分析：统计4个阶段，即种子未萌发、种子萌发(种胚膨大并产生根状物)、原球茎形成和发育(种胚膨大突破种皮至出现原生分生组织)、幼苗分化和发育阶段(长出第一片叶片及后续生长)的量，计算出种子萌发率(G)、形成原球茎率(C)以及幼苗率(K)，

共生培养60天截止实验时，利用非参数检验方法Kruskal-Wallis test(KW)和Mann-Whitney U–test(U)对不同处理的种子萌发率、形成原球茎比率及幼苗率进行显著性检验，α＝0.05；铁皮石斛任意接种处理包括空白对照均有种子萌发(表1)，

表1不同真菌对铁皮石斛种子在燕麦培养基上萌发的影响(60天统计)

接菌处理	菌株分类	萌发率(％)	原球茎率(％)	幼苗率(％)
					LQ	Sebacinales sp.	85.43％±2.93％	83.71％±2.90％	68.19％±3.90％
JC-1	Sebacinaceae sp.	66.09％±3.66％	64.38％±3.75％	51.14％±4.32％
					SSCDO-5	Tulasnella sp.	65.04％±7.31％	65.04％±7.31％	0
JM	Tulasnella calospora	64.76％±4.29％	51.61％±4.01％	34.48％±3.47％
					MS	不接菌	11.71％±1.12％	10.67％±1.60％	0
OMA	不接菌	4.76％±1.59％	2.67％±0.55％	0

从表1可知，不接菌的OMA对照组种子萌发率和原球茎率均很低且无幼苗形成，而从铁皮石斛的原球茎中分离到的LQ菌株在第60天时不仅能显著促进铁皮石斛种子萌发(85.43％±2.93％)，且能显著促进原球茎的形成(83.71％±2.90％)以及显著促进原球茎后续发育成幼苗(68.19％±3.90％)；虽然其它3株菌能促进种子萌发形成原球茎，但形成原球茎后JC-1和JM菌株表现出生长缓慢，有少量幼苗形成，但SSCDO-5菌株很难继续发育形成幼苗。说明蜡壳耳目菌LQ菌株能有效促进铁皮石斛种子生长发育到幼苗阶段。

实施例3：蜡壳耳目菌LQ菌株促进曲茎石斛共生萌发有效性实验：

(1)配制共生萌发培养基：共生萌发培养基为燕麦琼脂培养基，包括4g·L^-1燕麦粉和8g·L^-1琼脂，培养基pH为5.6～5.8；制备360皿燕麦培养基灭菌备用，每个实验处理30个皿，共12个处理；

(3)将消毒灭菌预处理的曲茎石斛Dendrobium flexicaule种子加入到1g·L^-1的无菌琼脂悬浮液中混合均匀得到种子悬浮液，用移液枪吸取种子悬浮液并将种子悬浮液均匀的播撒在燕麦琼脂培养基的培养皿中；其中消毒灭菌预处理方法：将储存在温度为-20℃中的种子取出，放在室温下10h，使种子温度恢复至室温；将种子放在纸质的种子包内，用订书钉将纸袋封好；将装有种子的纸袋浸泡在蒸馏水中5～10min，轻轻的挤压出气泡；用镊子将纸袋转移到盛有次氯酸钠溶液(有效氯离子浓度为1％)及一滴洗涤剂的烧杯中，轻轻搅拌或摇动烧杯；10min后，将纸袋移至超净工作台，用无菌镊子将纸袋转移到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，轻轻摇动；重复冲洗种子3～4次，轻轻挤压出纸袋内多余的水，用无菌剪刀剪开纸袋获得灭菌种子；

(4)播种与培养：将无菌种子与1g·L^-1无菌琼脂溶液制作成无菌种子悬浮液；在OMA培养基中间接种约0.5cm³(1×1×0.5cm)含有单一真菌纯培养物的琼脂块，用移液枪吸取150μl种子悬浮液均匀播种菌块四周，用封口膜将培养皿密封；其中2组燕麦琼脂培养基的培养皿中分别接种从曲茎石斛原球茎中分离得到的2株不同真菌，分别是QY1(Sebacinaceae sp.)、QY2(Epulorhiza sp.)，一组燕麦琼脂培养基的培养皿中接种从曲茎石斛根中分离得到的1株真菌QG4(Sebacina sp.)，一组燕麦琼脂培养基的培养皿中接种从铁皮石斛原球茎的菌株LQ(Sebacinales sp.)；另外2组燕麦琼脂培养基的培养皿中分别设置不接菌的MS和OMA培养基作为营养丰富培养基和营养缺乏培养基作为对照处理；每组处理30个重复，再置于人工气候箱内，在温度为25±2℃条件下恒温培养，其中光照周期L/D＝12/12，光照强度为2000～3000Lx；

共生培养60天截止实验时，曲茎石斛任意接种处理包括空白对照均有种子萌发，利用非参数检验方法Kruskal-Wallis test(KW)和Mann-Whitney U–test(U)对不同处理的种子萌发率、形成原球茎比率及幼苗率进行显著性检验，α＝0.05；曲茎石斛种子在燕麦培养基上进行共生萌发60天后，不同处理条件下种子萌发率、原球茎形成率、幼苗率见表2；

表2不同真菌对曲茎石斛种子在燕麦培养基上萌发的影响(60天统计)

接菌处理	菌株分类	萌发率(％)	原球茎率(％)	幼苗率(％)
					LQ	Sebacinales sp.	96.41％±3.15％	82.58％±4.13％	37.75％±3.56％
QG4	Sebacina sp.	51.04％±5.32％	0	0
					QY1	Sebacinaceae sp.	63.33％±3.60％	0	0
QY2	Epulorhiza sp.	72.91％±6.50％	60.92％±7.12％	34.75％±6.55％
					MS	不接菌	17.74％±1.95％	6.33％±0.72％	0
OMA	不接菌	3.42％±1.27％	0.16％±0.16％	0

从表2可知，任意接种处理包括空白对照均有种子萌发，不接菌的OMA对照组种子萌发率和原球茎率均很低且无幼苗形成，而从铁皮石斛的原球茎中分离到的LQ菌株在第60天时不仅能显著促进曲茎石斛种子萌发(96.41％±3.15％)，且能显著促进原球茎的形成(82.58％±4.13％)以及显著促进原球茎后续发育成幼苗(37.75％±3.56％)，虽然其他3株菌能促进种子萌发，但只有QY2菌株观测到原球茎与幼苗形成，且效果不如LQ菌株；说明蜡壳耳目菌LQ菌株能在短时间内有效促进曲茎石斛种子生长发育到幼苗阶段；

铁皮石斛和曲茎石斛与不同菌株在共生培养初期都能萌发，但种子萌发仅指种胚吸水膨胀尚未突破种皮，不具有实际应用价值，更重要的指标是幼苗形成比率；共生培养后期即幼苗形成时期，虽然接种从其他菌株也可以一定程度上促进2种药用石斛发育成为幼苗，然而从铁皮石斛原球茎分离得到的蜡壳耳目菌LQ菌株有最好的促进铁皮石斛和曲茎石斛种子萌发的效果，这2种药用石斛的种子和本发明菌株表现出了较强的专一性，可以利用蜡壳耳目菌LQ菌株分别和铁皮石斛与曲茎石斛种子共生萌发生产种苗；

兰科植物种子的萌发可以通过非共生萌发培养和共生萌发培养两种方式；虽然大多数兰科植物可通过非共生萌发培养，且具有较高的萌发率，但是此方式获得的幼苗移植到自然界中，生长缓慢，抗病原微生物能力差，存活率较低，同时由于很难与后接触的真菌建立共生关系而导致后继生长严重受阻；共生萌发培养技术是指在特定的基质(培养基)中同时播种植物种子和共生真菌，该方法可以提高种子的萌发率、幼苗的生长速度以及移植到自然环境后的幼苗存活率；由于兰科植物种子与真菌的共生关系具有专一性，故不同兰科植物种子的共生真菌不同；确定能与药用铁皮石斛和曲茎石斛种子形成共生关系并促进其萌发的有效真菌是培育这2种药用石斛幼苗的关键环节；共生种苗的获取是开展药用石斛原生境回归工作的基础；本发明的菌株通过共生萌发实验将铁皮石斛、曲茎石斛种子分别和不同的真菌及对照分别在人工基质上培养，通过种子萌发率的比较成功的获得促进2种药用石斛种子萌发的有效菌株，从而为利用药用铁皮石斛和曲茎石斛种子和真菌共生萌发来高效培育种苗开辟了一条新的途径。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一株促进药用石斛种子萌发形成幼苗的蜡壳耳目真菌菌株及其应用

<141> 2019-09-30

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 621

<212> DNA

<213> 蜡壳耳目真菌菌株(Sebacinales sp.LQ菌株)

<400> 1

tattgatatg cttaagttca gcgggtagtc ccacccgatt tgaggtcaaa ttgtcaagat 60

tgtccaaaga cggtttgcag cgcagagccc actttgctta cgtgtcccga aggaactttg 120

atcagtgaag atgtttatca cactgaagac gctgcaacag cagggtacac tcatgcattt 180

aaggccagtc gtcatgacac gacattgccc aagtccactt cgtacaacaa aagtcataga 240

ggtgagatta caatgacact caaacgggcg tacccttcgg aataccaaag ggtgcaaggt 300

gcgttcaaag attcgatgat tcactgaatt ctgcaattca cattacttat cgcatttcgc 360

tgcgttcttc atcggtgcga gagccaagag atccgttgtt gaaagttgta tttatatgcg 420

ttatgcaaag acattccatt acattcagag tgtgtaaaaa taccatgaga ccccagtcaa 480

acacgacgtt caaccagctg ctcgtcaaag acaagcggac ctcacagtca aaggtgcaca 540

ggtgtatgga tttgcaatcg acgtgcacat gtgttgccac cagcacagac gaccgctatg 600

attcattaat gatccttccg c 621

Claims

1.一株促进药用石斛种子萌发形成幼苗的蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC No:M 2019744。

2.根据权利要求1所述促进药用石斛种子萌发形成幼苗的蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ，其特征在于：该菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ在促进药用石斛种子萌发形成幼苗中的应用。

4.根据权利要求3蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ在促进铁皮石斛Dendrobiumofficinale种子萌发形成幼苗中的应用。

5.根据权利要求3蜡壳耳目真菌菌株Sebacinales sp.LQ在促进曲茎石斛Dendrobiumflexicaule种子萌发形成幼苗中的应用。