CN113789270A

CN113789270A - 一株蜡壳菌m-9及其应用

Info

Publication number: CN113789270A
Application number: CN202111175706.8A
Authority: CN
Inventors: 陈娟; 唐燕静; 周冬宇; 李杨; 邢咏梅; 郭顺星
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2021-10-09
Filing date: 2021-10-09
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2041-10-09
Also published as: CN113789270B

Abstract

本发明公开了一株蜡壳菌(Serendipitasp.)M‑9及其在促进霍山石斛种子萌发中的应用。保藏编号为CGMCCNo.23248。本发明蜡壳菌M‑9与霍山石斛种子能够形成良好的共生萌发关系，具有良好的促进霍山石斛种子萌发的能力。

Description

一株蜡壳菌M-9及其应用

技术领域

本发明涉及霍山石斛栽培技术领域，更具体的说是涉及一株蜡壳菌M-9及其应用。

背景技术

霍山石斛(Dendrobium huoshanense)俗称霍石斛、霍斛、米斛，属兰科石斛属多年生草本植物。霍山石斛自然分布地域极其狭窄，主要分布于大别山区安徽霍山及邻近地区，河南省也有分布，是安徽省道地药材之一。一般生长在水旁岩石或树干上，最适合通风较好的西北、东北向的潮湿石壁上或有瀑布的悬崖上。霍山石斛以其味甘、粘质厚的上乘品质备受历代医家推崇，其性微寒，具有强阴益精、厚肠胃、生津止渴、补五脏虚赢、益智除惊、轻身延年等多种功效。现代研究表明，霍山石斛含有石斛多糖、石斛碱、蛋白质以及人体所需氨基酸等，在抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、治疗白内障和降糖保肝等方面有很好的作用。然而自20世纪80年代以来，霍山石斛由于自然分布地域狭窄、生长环境特殊、产量极低等原因，加之人工过度采集和生态环境恶化，野生种质资源濒临灭绝，现已被列为国家一级濒危保护药用植物。

霍山石斛种子细小如尘，仅具发育不完全的原胚，繁殖发育率低。因此，如何高效、经济的培育出霍山石斛，尝试在原始生境进行资源保护和恢复是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株蜡壳菌(Serendipita sp.)M-9及其在促进霍山石斛种子萌发中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株蜡壳菌(Serendipita sp.)M-9，于2021年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.23248，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌可与霍山石斛种子形成共生萌发关系，具有良好的促进霍山石斛种子萌发的能力。

蜡壳菌M-9在PDA培养基上菌落呈白色，生长速度缓慢；菌丝不发达，水浸状，有不明显的放射状条纹；念珠状细胞不明显。

本发明的另一目的是提供上述蜡壳菌M-9在促进霍山石斛种子萌发中的应用。

优选的，上述蜡壳菌M-9在制备促进霍山石斛种子萌发制剂中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株蜡壳菌M-9，该菌株与霍山石斛种子能够形成良好的共生萌发关系，具有良好的促进霍山石斛种子萌发的能力，对解决濒危药用植物霍山石斛的资源再生有重要作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明蜡壳菌M-9菌落生长示意图，在PDA培养基上培养2周时图片；

图2为本发明蜡壳菌M-9显微镜镜检示意图，比例尺为20μm；

图3为本发明基于核糖体内转录间隔区(ITS)构建的系统发育树鉴定蜡壳菌M-9的系统位置示意图；

图4为本发明霍山石斛种子生活力检测TTC法染色示意图；

图5为本发明蜡壳菌M-9与霍山石斛种子共生萌发效果示意图 (比例尺1mm)，其中A为非共生对照组(CK组)，B为M-9与霍山石斛种子共培养促进其萌发的效果图，C为M-9促进种子萌发至 5级阶段(培养至12周)效果图，D为M5胶膜菌与种子共生萌发的效果(12周),多萌发至2级阶段，E为WX-11镰孢菌不能促进种子萌发(12周)；F为NC-1胶膜菌与种子共生萌发的效果(12周)；图6为蜡壳菌M-9侵染定殖在霍山石斛种子胚基部细胞中示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所涉及的试剂均为市售渠道采购，未提及的方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1

蜡壳菌M-9的筛选与鉴定

1、菌株的形态特征鉴定

对从霍山石斛的根部通过菌丝团分离法获得的68株内生真菌进行促霍山石斛种子萌发试验，通过试验成功筛选到一株真菌菌株，命名为M-9。该菌在PDA培养基上菌落生长缓慢，菌丝不发达，水浸状，菌落正面呈现污白色，有不明显的放射状条纹，菌落边缘不整齐，厚薄不均匀，菌丝的生长速度0.22-0.25mm/h，菌丝较细，直径 2.47-3.09μm，蔡司光学显微镜下分枝近直角，念珠状细胞不明显，未见有性生殖孢子或无性孢子产生(M-9菌落形态参见附图1，显微镜镜检参见附图2)。

2、菌株的分子鉴定

提取该菌株的基因组DNA，对其核糖体内转录间隔区(ITS)序列进行扩增，测序，并构建系统发育树(参见附图3)。该菌株ITS 序列与蜡壳菌目真菌(Sebacinalessp.MN918490)ITS序列相似性为100％，结合形态观察与分子鉴定，将其鉴定为蜡壳菌目Serendipita 属(Serendipita属目前尚无对应的中文名称)。

PCR扩增rDNA-ITS区反应引物:

正向引物ITS1OF-C:5’-AACTCGGCCATTTAGAGGAAG-3’， SEQ ID NO.1；

反向引物ITS4-OF:5’-GTTACTAGGGGAATCCTTGTT-3’， SEQ ID NO.2。

实施例2

蜡壳菌M-9与霍山石斛种子共生萌发鉴定

1、霍山石斛种子生活力检测(TTC法)

实验原理：

生活力强的种胚在呼吸作用过程中会将TTC(2，3，5－三苯基氯化四氮唑)氧化还原成不溶性的红色TTF(三苯甲腙)，如果种胚死亡或生活力衰退，则不能染成红色或染色较浅。

鉴定标准：

种胚染成鲜红色为有生活力的种子。

实验方法：(三次重复，取平均值)

①将采自安徽省六安县的霍山石斛种子随机取500粒，放到 2mL离心管中，温水(30-35℃)浸泡2-6h，使种子充分吸胀。

②弃温水后，在盛放种子的离心管中加入1mL 1％TTC溶液(PH 6.9的磷酸盐缓冲液)，于30℃恒温培养箱内，黑暗培养24h。

③弃TTC溶液，用去离子水冲洗种子2-3次后在体视镜下观察种胚着色情况(随机选择5个视野进行观察统计)。

实验结果：

种子生活力(％)＝有活力的种子数/种子总数×100％

种子被染成鲜红色计为有活力的种子(参见附图4)，经计算有活力的种子占种子总数的93.75％±0.04，说明本次采集的种子活力较好，可以用于种子萌发实验。

2、蜡壳菌M-9与霍山石斛种子共生萌发试验

共生培养基(燕麦培养基OMA)：燕麦片5g/L，加入500ml蒸馏水煮沸15min，过滤。将滤液定容至1L，滤液再次煮沸后加入10g 琼脂粉，待充分融化后分装，pH调至5.0-5.2，于121℃高压蒸汽灭菌21min，用作种子共生萌发培养基备用。

试验方法：

将贮存于4℃冰箱的霍山石斛种子取出，取1mg种子放入 10mLEP管中，加入8mL无菌水，充分混匀后静置2h，将无菌水去掉，加入1％NaClO溶液，消毒3min，弃去NaClO溶液，用无菌水冲洗3次后，加入500μl无菌水稀释成浓度为2mg/ml的种子悬浮液用于播种。用移液枪吸取50μl种子悬浮液均匀打入共生培养基中间位置，然后用打孔器在PDA培养基上取4块培养好的真菌(直径为 5mm)，分别置于共生培养基上(OMA培养基)种子的四周作为共生培养实验组，培养基用parafilm封口膜封口后置于25℃暗培养室中培养。同时设置非共生对照组和其他菌株共生对照组，实验组与对照组各设置10皿重复。每隔1周用蔡司体式镜观察种子萌发情况，并用以下标准进行分级描述。

分级标准：根据(Stewart&Zettler,2002)的方法稍作修改后，将兰科植物种子萌发划分为六个阶段。

0级：种胚透明，种皮完好，种子未萌发；

1级：种子吸水膨胀，转绿，出现表皮毛或假根；

2级：种子继续吸水膨胀，种皮破裂；

3级：种子出现顶端分生组织；

4级：顶端组织继续生长，伸长弯曲，形成第一片叶；

5级：第一片叶伸长，长出弯曲，并出现第二片叶。

通常将出现顶端分生组织到幼苗形成前的兰科植物种子称为原球茎(protocorm),即萌发到3级至4级之前阶段的种子成为原球茎，萌发4级到5级阶段的种子称为幼苗“seedling”。

试验结果：

种子总萌发率(％)＝(萌发种子数/种子总数)×100％

种子各萌发级别百分率＝(各级别萌发种子数/种子总数)×100％

蜡壳菌M-9与霍山石斛种子共生萌发试验结果数据如表1所示(共生萌发效果参见附图5)。试验结果表明，实验室条件下，蜡壳菌M-9与霍山石斛种子共生培养20天达到2级，45天达到3级，60 天达到4级，70达到5级。而非共生对照组(CK组，种子不接菌仅在OMA培养基上培养)只能萌发至2级种子吸水膨胀阶段，停止生长。通过台盼蓝染色的方法(将新鲜的共生培养的种子，在10％的KOH溶液中煮8-10min，无菌水冲洗3次后，用0.4％的台盼蓝染色3-5min,随后用10％的甘油冲洗，冲洗后取染色的种子在蔡司显微镜(Axio ImagerA1,CarlZeiss AG)下观察真菌侵染种子的情况，可观察到蜡壳菌M-9侵染定殖在霍山石斛种子胚基部细胞中(蓝色表示真菌与种子共生后形成典型的菌丝圈结构，说明共生关系成功建立，参见附图6)。因此，本发明蜡壳菌M-9与霍山石斛种子能够形成良好的共生萌发关系，对于促进霍山石斛种子萌发具有重要意义。

表1不同真菌对霍山石斛种子作用12周后效果比较

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院药用植物研究所

<120> 一株蜡壳菌M-9及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aactcggcca tttagaggaa g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttactaggg gaatccttgt t 21

Claims

1.一株蜡壳菌(Serendipita sp.)M-9，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.23248。

2.如权利要求1所述的一株蜡壳菌M-9，其特征在于，在PDA培养基上菌落呈白色，生长速度缓慢；菌丝不发达，水浸状，有不明显的放射状条纹；念珠状细胞不明显。

3.如权利要求1或2所述的一株蜡壳菌M-9在促进霍山石斛种子萌发中的应用。

4.如权利要求1或2所述的一株蜡壳菌M-9在制备促进霍山石斛种子萌发制剂中的应用。