CN111647516A - 一株曲霉菌rsopa 18及其在促进芒果幼苗的生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18及其在促进芒果幼苗生长中的应用，曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61040。该菌株具有非常突出的溶解不溶性无机磷源磷酸三钙(TCP)的功能，并且在促进芒果幼苗的茎和根生长方面有良好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株曲霉菌RSOPA 18及其在促进芒果幼苗的生长中的应用。
背景技术
植物生长促进真菌(PGPF)通常对所有与之相关的植物物种都是有益的真菌。在许多作物中，如大豆、黄瓜、番茄、胡萝卜、高粱和棉花中，它们可直接或间接的提高植物生长和多种寄主植物的生产力(Howell et al.2000,Yedidia et al.2001,Gravel etal.2007,Hoyos-Carvajal et al.2009,Kim et al.2017)。据报道，曲霉属、镰刀菌属、青霉属、梨孢属和木霉属是植物生长促进真菌(PGPF)。微生物作为提高植物生长和产量的土壤接种剂早已引起了农业学家的注意(Fasim et al.2002)。溶磷真菌(PSF)是一种植物生长促进真菌(PGPF)，能增强不溶性磷化合物的溶磷作用。它们还具有调动和增加养分吸收、产生有机酸以及提高过磷酸钙和岩石磷酸盐等磷肥效率的能力(Jyoti et al.2013,Li etal.2015)。土壤中的溶磷真菌(PSF)，特别是青霉、曲霉等丝状真菌，已被广泛研究(Eliaset al.2016,Li et al.2016)。但空气中溶磷真菌(PSF)未曾有人进行研究。
芒果在中国的水果市场和农民生活中都变得越来越重要(Chen 2013)。在中国大陆被广泛种植。2008年，中国大陆芒果种植面积约12万公顷，总产量80万吨。2008年，芒果出口量约为260公吨，进口量超过20000公吨(Chen 2013)。然而，芒果幼苗的生长需要时间。芒果幼苗根系是吸收和贮存水分和养分的重要功能，因此，加强根系就变得很有必要。此外，根可以保持土壤和补救土壤的侵蚀。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供能够促进芒果幼苗根冠生长的真菌。
本发明的技术方案为：曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18，本菌株于2020年6月3号保存在广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070，菌种保藏号为GDMCC No：61040，保藏期限为30年。以下简称菌株RSOPA 18。
本发明菌株RSOPA 18是从中国云南省昆明市栓皮栎树下的空气环境中用选择培养基(Pikovskaya(PVK)琼脂糖培养基中加5％磷酸三钙(TCP))分离出的真菌。所选菌株RSOPA 18在Pikovskaya(PVK)琼脂上与5％磷酸三钙(TCP)形成最宽的透明带，用于真菌纯化和磷酸盐筛选。通过对菌株的形态观察和分子鉴定等一系列试验，RSOPA 18属于曲霉属(Aspergillus sp.)，通过实验证明该菌在溶解不溶性无机磷源磷酸三钙(TCP)和促进芒果幼苗的茎和根生长方面有良好的应用价值。
本发明的真菌菌株RSOPA 18，在Pikovskaya(PVK)固体培养基上溶解磷酸三钙(TCP)的增溶指数(SI)＝25.77±0.40mm，并且在液体PVK培养基上28℃下培养7天可溶性磷酸盐可达到1.52±0.05g/mL。
本发明进而提供一株曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18在促进芒果生长上的应用。
将曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18的孢子接种到芒果栽培基质中，能够显著促进芒果的茎和根生长。
进一步地，所述芒果为一年生芒果幼苗。
进一步地，所述孢子的浓度为2×107孢子/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从空气中分离得到了一株曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18，该菌株具有非常突出的溶解不溶性无机磷源磷酸三钙(TCP)的功能，并且在促进芒果幼苗的茎和根生长方面有良好的应用价值。
保藏信息：
曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18，本菌株于2020年6月3号保存在广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070，菌种保藏号为GDMCC No：61040，保藏期限为30年。
附图说明
图1：基于CaM、BenA及其序列数据的最大似然分析生成系统树。这棵树以Penicillium viridissimum(CGMCC 3.18796)为根。最大似然自取值为≥75％。ex-type菌株为加粗字体。
图2：Pikovskaya(PVK)琼脂增溶磷酸三钙(TCP)的菌落特征及溶磷区域形成。对照组。b曲霉菌株RSOPA 18生长时间为5天。
图3：各处理芒果幼苗的根冠长度。误差条指示±SD(标准偏差)。根据方差分析结果，每一条上的不同字母表示显著性差异，在p<0.05。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：
培养基选用：马铃薯-葡萄糖琼脂(PDA)、Pikovskaya(PVK)琼脂糖培养基、PDA培养基是本领域可知悉的培养基。
主要仪器与试剂：MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-1FB型单人双面净化工作台，E360K离心机。PCR 仪Eppendorf No:5345，电泳仪Bio-RadMode200/2.0，凝胶成像仪United-Bio，PCR预混液(TaKaRa Biotechnology)，其余试剂均为分析纯。XseriesⅡ型电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)，美国THERMO公司；DHG-924OA型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；THZ-82气浴恒温振荡箱，江苏金坛诚辉仪器厂；GMSX-280压力蒸汽灭菌器，北京永光明医疗仪器有限公司。试剂均为分析纯，水为超纯水，5％磷酸三钙(TCP)。
实施例一：曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA18的分离、培养、鉴定
1.菌株分离：本发明菌株从中国云南省昆明市栓皮栎树下的空气环境中用选择培养基(Pikovskaya(PVK)琼脂糖培养基中加5％磷酸三钙(TCP))分离出的真菌。具体方法是在云南省昆明市栓皮栎树下放置3个含有5％磷酸三钙(TCP)的Pikovskaya(PVK)琼脂糖培养皿(直径9mm)，在树下放置20分钟。然后将培养皿封闭，小心地转移到实验室，在室温下培养2天。在选择的培养基上，选择菌落周围透明带最宽的菌落进行纯化，得到一株溶磷真菌，命名为RSOPA 18。
2.菌株形态学特征：
菌株RSOPA18在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上以25℃条件下下培养七天后，菌落表面呈丝状，波浪状至丝状，扁平或隆起、致密，致密的白色基部覆盖着一层致密的深棕色至黑色分生孢子头，从上面观察(培养基正面)边缘呈白色；从下面(培养基背面)看呈白色或乳脂状。用复合显微镜在PDA上对菌株RSOPA18在25℃下连续7天的形态观察表明，分生孢子头呈球形、深棕色、变黑、放射状、单列。柄平滑壁，透明或着色，无柄，不分枝，直或弯曲。囊泡为球状到近球形，单列，无梗基；瓶梗透明，烧瓶状，安瓿形。分生孢子为4.3–6×4–6.2μm，球状到近球形，有时为椭圆形，最初为透明，变为深棕色到红棕色，表面粗糙到棘状，深棕色到黑色，壁粗糙。
3.菌株的保藏：
菌株RSOPA18已由广东省微生物菌种保藏中心保存。地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070。存放日期为2020年6月3日，该菌株存放编号为GDMCC No：61040，保藏期限为30年。本菌株已经用多种方法保藏使其保持良好的状态。
4.菌株的系统进化分析：
分离、纯化菌株RSOPA18，并在室温(25–28℃)下培养在PDA平板上。分子研究是对内转录间隔区(ITS5/ITS4)、部分钙调素基因(CaM)和部分β-微管蛋白基因(BenA)进行鉴定。PCR扩增产物经BGI技术溶液有限公司(BGI Tech Solutions Co.,Ltd.(BGITech),P.R.)纯化并测序。
使用
(Biomatters Ltd.,New Zealand)和BioEdit生成一致序列。在核苷酸数据库GenBank(www http://BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/)中使用BLAST搜索框对序列进行比较，用以检查比对和它们最相关的分类群。基因组区域的数据集使用MAFFT 7.450版服务器(http://MAFFT.cbrc.jp/alignment/software/)进行比对。最大似然(ML)计算产生系统发育树。使用FigTreev1.4.0程序可视系统发育进化图，并在Microsoft powerpoint(2010)中进行系统发育树编辑。
根据核核糖体DNA(nrDNA)内转录间隔区(ITS)的序列分析结果，将RSOPA18菌株分为曲霉属(Aspergillus sp)，基于系统发育分析结合钙调素基因(CaM)、β-微管蛋白基因(BenA)和内转录间隔区(ITS5/ITS4)将RSOPA18菌株归类为一株曲霉属真菌。
实施例二：磷酸三钙的体外增溶
1.Pikovskaya(PVK)琼脂培养基的增溶指数：
在PVK琼脂培养基上，筛选出一株真菌菌株RSOPA18，具有溶解磷酸三钙的潜力。一升(1L)的PVK培养基含有以下物质(g/L)：0.5g(NH4)2SO4,0.1g MgSO4·7H2O,0.02g NaCl,0.02g KCl,0.003g FeSO4·7H2O,0.003g MnSO4·H2O,5g Ca3(PO4)2、10.0g葡萄糖、0.5g酵母提取物、15.0g琼脂和1000mL蒸馏水(Pikovskaya 1948)。培养基在121℃高压灭菌15分钟。将灭菌后的PVK培养基倒入灭菌培养板中。在28℃的PDA上培养7天，并用无菌钻(5mm)从每个活跃生长菌落的边缘切下真菌菌丝。在28℃下，将真菌菌丝体转接在含有添加0.5％TCP的PVK培养基的perti平板上7天。无菌PDA琼脂块转接添加0.5％TCP的PVK培养基的perti平板作为对照。每个真菌分离物检测三个重复。培养第1、3、5、7天，测定各分离物菌落周围透明带的直径。磷酸盐增溶指数按下式计算：
从第1天起，在菌株RSOPA 18中发现了清除区。菌株RSOPA 18在真菌菌落周围清晰地产生了溶磷清除带(参见附图2)。
菌株RSOPA 18的溶磷指数从第1天开始升高。菌株RSOPA 18是PVK培养基上一种有效的磷酸盐增溶剂，其磷酸盐增溶指数(SI)＝25.77±0.40mm，对照组无SI(表1)。
2.在150mL锥形瓶中，加入100mL PVK液体培养基，添加0.5％TCP，对真菌菌株RSOPA 18进行溶磷活性试验。灭菌前将培养基的初始pH值调整为7.01。将10毫升真菌培养的孢子悬浮液(107个孢子/mL)接种到每个锥形瓶的消毒PVK液体培养基中。以消毒后的PVK液体培养基中的10毫升无菌蒸馏水作为对照。每次真菌试验保持三个重复。培养物在旋转振动筛(Sanco,India)上以28℃和130rpm孵育7天。在第1、3、5和7天，从每个锥形瓶中无菌收集1.5mL培养上清液的等份。样品用离心机(Sigma,Germany)以12000转/分离心2分钟，以沉淀悬浮固体和菌丝碎片并弃去。然后取出每种培养物的上清液(0.1mL)测试真菌菌株磷酸三钙释放的磷量。用钼蓝法在700nm下测定培养上清液中的有效可溶性磷。用钼蓝法在700nm下测定培养上清液中的有效可溶性磷。
真菌菌株RSOPA 18在含有TCP的PVK肉汤培养基(PVK broth medium)中培养1、3、5和7天后溶解磷酸盐(表1)。菌株RSOPA 18在7天内以1.52+0.05g/mL溶解磷酸盐(表1)。
与已授权的公开号CN1847388A中的黑曲霉菌株CCTCC NO:M 206021相比，本研究接种量虽然是黑曲霉菌株CCTCC NO:M 206021的50倍，但第五天的溶磷量高达黑曲霉菌株CCTCC NO:M 206021的2528倍。菌株的溶磷能力并不与接种量呈线性关系，接种量过高会导致菌体营养吸收不足溶磷能力下降。即便按照线性关系，本研究菌株的溶磷能力也高达黑曲霉菌株CCTCC NO:M 206021的50.56倍。显然，本专利菌株具有突出的溶磷能力。
表1曲霉菌菌株RSOPA 18的体外溶磷效率及对Pikovskaya(PVK)固体和液体培养基的对照培养。
备注：菌株CCTCC NO:M 206021为已授权的公开号CN1847388A中的黑曲霉菌株，接种量为本研究的2％，“—”表示参数不一致或未检测。
实施例三:利用曲霉菌株RSOPA18促进盆栽芒果幼苗生长实验
1.真菌培养：本发明中使用的菌株RSOPA 18的真菌菌丝体是用无菌钻孔取样器(5mm)从培养皿中活跃的生长菌落的边缘取样，并在25℃的PDA上培养7天
2.孢子悬浮液：本发明所用菌株RSOPA 18的孢子悬浮液是通过在PDA平板上7天培养液中加入10mL无菌蒸馏水制备的。然后用灭菌的玻片轻轻刮去真菌菌落表面。然后用10mL微量吸管将孢子悬浮液移入无菌锥形瓶中。用血细胞仪进行孢子计数，并将菌株RSOPA18的悬浮液调整至约每毫升107个孢子，置于10mL灭菌蒸馏水中。孢子悬浮液以200转/分离心1分钟。
3.真菌菌剂在芒果幼苗上的应用：
用灭菌的土、砂、石按重量比例(2.5:4.0:1.5)混合后将1年生芒果幼苗种植在黑色营养袋中。接种物制备完成后，将曲霉菌株RSOPA18的悬浮液(2×107孢子/mL)10mL充分混合，倒在每个芒果育苗盆的土壤上。实验方案见表2。在芒果幼苗生长期间(在芒果幼苗生长八个月零两周后)添加两次孢子悬浮液。
每个处理的花盆放置在温室中，白天温度为30–32℃，夜间温度为10–20℃。光照16h，暗照8h的光周期。通过每天用无菌蒸馏水浇水，使花盆保持60％的保水能力。随机选取三个试验土壤样品风干，每个土壤样品取10克，并按照表3的规定测定其物理化学性质。
表2实验方案
表3试验土壤理化性质及NPK分析.
此表数据代表三个样品的平均值。
实施例四：用根和茎生长的数据分析曲霉RSOPA18对芒果幼苗生长的影响对接种9个月后芒果幼苗的根长和芽长进行了记录。将茎和根分开，用蒸馏水冲洗三次，然后称重。所有处理的根长在从盆中取出后立即测定。每种试验方法重复5次。
真菌菌株RSOPA18在白天温度30–32℃、夜间温度10–20℃条件下接种1年生芒果幼苗9个月后，显著地增加了芽长(10.50±2.77cm)、主根长(32.26±3.25cm)。光照16h，暗照8h，与对照处理相比(见图3)。
Claims (5)
1.曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61040。
2.权利要求1所述的曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18在促进芒果生长上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将曲霉菌(Aspergillus sp.)RSOPA 18的孢子接种到芒果栽培基质中，促进芒果的茎和根生长。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述芒果为一年生芒果幼苗。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述孢子的浓度为2×107孢子/mL。
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