CN106434391A - 一株高效溶磷的塔宾曲霉菌株及其应用 - Google Patents

一株高效溶磷的塔宾曲霉菌株及其应用 Download PDF

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CN106434391A CN201611190824.5A CN201611190824A CN106434391A CN 106434391 A CN106434391 A CN 106434391A CN 201611190824 A CN201611190824 A CN 201611190824A CN 106434391 A CN106434391 A CN 106434391A
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杨顺
杨婷
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Abstract

本发明公开了一株高效溶磷的塔宾曲霉菌株及其应用。本发明从土壤中分离纯化出一株高效的溶磷真菌，该溶磷真菌能活化多种难溶性磷源，将分解溶液中的无机磷转化为能被植物利用的有效磷，可直接应用于植物营养液的制备。通过实验证明：本发明的溶磷真菌不仅具有很强的溶磷特性，而且与一组功能型复合微生物菌群兼容性好，也可用于复合微生物菌肥的研发。

Description

一株高效溶磷的塔宾曲霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株塔宾曲霉及其在溶无机磷方面的应用。
背景技术
磷素是植物生长发育所必需的三大矿质营养元素之一。磷不仅参与许多重要的生命代谢活动，而且还是很多植物器官的组成成分，磷对作物碳水化合物的运输、合成和分解起着重要的作用。可见土壤中磷元素的丰缺度对作物的产量和品质影响非常明显。由于大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+结合形成难溶磷酸盐，导致土壤中95％以上的难溶性磷源不能直接被植物吸收利用。
土壤中存在着大量溶磷微生物，它们能够将难溶性磷酸盐转化为植物可吸收利用的有效磷，具有这种能力的微生物称为溶磷微生物(phosphate-solubilizingmicroorganisms)。溶磷微生物分为溶磷真菌和细菌，研究显示，溶磷细菌的的数量是溶磷真菌的2-50倍；然而，溶磷细菌往往在传代过程中溶磷活性降低或失去活性，溶磷真菌的活性和溶磷能力均高于溶磷细菌。溶磷真菌类主要包括曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、小菌核菌(Sclerotium)和镰刀菌(Fusarium)。其中，研究指出，在众多溶磷微生物中，曲霉属的溶解活性最高。因此，筛选高效溶磷真菌是开发微生物菌肥不可或缺的重要环节，一直是国内外研究的热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2。
本发明提供的塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2的保藏编号为CGMCCNo.13185。菌株P2-2的分类命名为塔宾曲霉Aspergillus tubingensis，该菌株已于2016年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。
本发明的另一个目的是提供上述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2的新用途。
本发明提供了上述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2在作为溶磷微生物中的应用。
本发明还有一个目的是提供上述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。
本发明提供了上述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在溶磷中的应用。
本发明还提供了上述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备溶磷的产品中的应用。
上述应用中，所述溶磷为将难溶性无机磷转化为植物可吸收利用的有效磷；所述难溶性无机磷具体为磷酸三钙、磷酸锌或羟基磷灰石。
本发明还提供了上述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备复合微生物菌肥和/或植物营养液中的应用。
本发明还提供了上述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在促进植物生长中的应用。
上述应用中，所述促进植物生长体现为增加植物株高和/或湿重。
上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
本发明还有一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为上述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；
所述产品具有如下1)-5)中任一所述的功能：
1)活化难溶性磷源；
2)将难溶性无机磷转化为植物可吸收利用的有效磷；
3)促进植物生长；
4)制备复合微生物菌肥；
5)制备植物营养液。
本发明的最后一个目的是提供一种促进植物生长的方法。
本发明提供的促进植物生长的方法包括如下步骤：将植物在含有上述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2的发酵液中培养。
上述方法中，所述促进植物生长体现为增加植物株高和/或湿重。
上述方法中，所述发酵液为将P2-2菌株的菌悬液接种于难溶无机磷液体培养基中进行发酵培养得到的溶液；所述难溶无机磷液体培养基具体为磷酸三钙难溶无机磷液体培养基、磷酸锌难溶无机磷液体培养基或羟基磷灰石难溶无机磷液体培养基；所述发酵培养的条件为25℃，200r/min摇床培养5天。
本发明从土壤中分离纯化出一株高效的溶磷真菌，该溶磷真菌能活化多种难溶性磷源，将分解溶液中的无机磷转化为能被植物利用的有效磷，可直接应用于植物营养液的制备。通过实验证明：本发明的溶磷真菌不仅具有很强的溶磷特性，而且与一组功能型复合微生物菌群兼容性好，也可用于复合微生物菌肥的研发。
附图说明
图1为p2-2在Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石为磷源的培养基上产生的溶磷圈。图1a:p2-2；b、c、d分别表示p2-2在Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石为磷源的培养基上产生的溶磷圈。
图2为磷标准曲线。
图3为P2-2菌株与功能菌株间的亲和性检验。
图4为大豆幼苗在各溶液中的生长情况。
保藏说明
菌种名称：塔宾曲霉
拉丁名：Aspergillus tubingensis
菌株编号：P2-2
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年11月18日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13185
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的培养基：
(1)难溶无机磷固体培养基：葡萄糖10g，MgSO4·7H2O 0.3g，磷源5g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.2g，KCl 0.2g，MnSO4 0.03g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，酵母膏0.5g，水1L，pH值7.0±0.2，121℃灭菌30分钟备用。
(2)难溶无机磷液体培养基：葡萄糖10g，MgSO4·7H2O 0.3g，磷源5g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.2g，KCl 0.2g，MnSO4 0.03g，FeSO4·7H2O 0.01g，酵母膏0.5g，水1L，pH值7.0±0.2，121℃灭菌30分钟备用。
上述培养中的磷源为难溶磷酸盐，难溶磷酸盐为磷酸三钙(Ca3(PO4)2)、磷酸锌(Zn3(PO4)2)或羟基磷灰石。其中，磷酸三钙(Ca3(PO4)2)和羟基磷灰石购于上海百舜生物科技有限公司；磷酸锌(Zn3(PO4)2)购于北京普益华科技有限公司。
(3)查氏酵母膏琼脂培养基(CYA)：K2HPO4 1g，查氏浓缩液10mL，酵母抽提粉5g，蔗糖30g，琼脂15g，水1L。查氏浓缩液配方:NaNO3 30g，KCl 5g，MgSO4·7H2O 5g，FeSO4·7H2O0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.05g，无菌水100mL。
(4)混合培养基：是将PDA(美国BD公司)、LA(美国BD公司)培养基和高氏1号(广东环凯微生物科技有限公司)等体积比混匀得到的培养基。
下述实施例中的试剂：
钼锑贮存溶液：量取153ml浓硫酸(分析纯，密度1.84g/ml)，缓缓加入到400ml蒸馏水中，不断搅拌，冷却。另称取经磨细的钼酸铵10g溶于温度约60℃300ml水中，冷却。然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中。再加入0.5％酒石酸锑钾溶液100ml，冷却后，加水稀释至1000ml，摇匀，贮于棕色试剂瓶中，此贮备液含钼酸铵1％，硫酸2.75mol/L。
钼锑抗显色剂：称取1.50g抗坏血酸溶于100ml钼锑贮存溶液中，此溶液有效期不长，宜随配随用。
5mg/L磷标准溶液：将0.4394g磷酸二氢钾溶于100ml水，加5ml浓硫酸防腐，用水定容到1L，得到浓度为100mg/L磷标准溶液，此溶液可以长期保存。吸取10ml浓度为100mg/L磷标准溶液于200ml容量瓶中，加水至标度，得到浓度为5mg/L磷标准溶液，此溶液不宜久存。
下述实施例中的供试菌株：
淡紫拟青霉YES-2(CGMCC No.2012)、红灰链霉菌HDZ-9-47(CGMCC No.2878)(Sr)和苍白杆菌NC1(CGMCC No.12154)。
实施例1、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株P2-2的分离及鉴定
一、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株P2-2的分离
1、土壤中微生物的初步筛选
将土壤(北京昌平(E116°07.909′；N 40°11.303′)大豆地的土壤)制备得到10-2-10-4的悬液，然后将土壤悬液涂布于以Ca3(PO4)2为磷源的含有链霉素(100μg/ml)和氯霉素(100μg/ml)的难溶无机磷固体培养基上，25℃培养，观察，分离、纯化产生溶磷圈的菌株，并将分离纯化获得的菌株为命名为P2-2，用15％甘油-80℃保存菌株，备用。
二、菌株P2-2的鉴定
1、菌株P2-2的形态学观察
将菌株P2-2在CYA培养基上25℃培养5天后，菌落直径为2.8cm；菌落颜色为褐色，反面为淡黄褐色；菌落质地有放射状沟纹；渗出液少量；顶囊为球形，直径为25-50μm；分生孢子球形，直径2.8-4.5μm。
2、菌株P2-2的分子生物学鉴定
用热裂解法提取菌株P2-2的DNA，以获得的DNA为模板，采用引物Bt2a(GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC)和Bt2b(ACCCTCAGTGTAGTGACCC TTGGC)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为菌株P2-2的真菌微管蛋白β-tubulin基因。并将PCR扩增产物由北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。
菌株P2-2的真菌微管蛋白β-tubulin基因序列如序列1所示，然后利用Blast程序将序列1所示的β-tubulin序列与数据库中的所有序列进行比对。
综合上述鉴定结果，菌株P2-2的分类命名为塔宾曲霉Aspergillus tubingensis，该菌株已于2016年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.13185。
实施例2、菌株P2-2对Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石为磷源的无机磷培养基的溶解作用
一、菌株P2-2对Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石为磷源的固体无机磷培养基的溶解作用
将菌株P2-2制作成菌悬液(菌悬液为将菌株P2-2的孢子溶于水得到的溶液)，使菌悬液中孢子数达到1×106cfu/ml。取200μl菌悬液于6cm培养皿中，每个培养皿倒入5颗玻璃珠均匀涂板。25℃培养2天后用6mm的打孔器打成菌饼，将菌饼分别接入以Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石为磷源的固体无机磷平板上，25℃培养5天后照相，并分别测定溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)大小，以此来确定菌株的溶磷能力。
表1、P2-2在不同磷源的无机磷培养基中产生溶磷圈的大小与菌落的比值
D:溶磷圈的直径(cm)；d:菌落直径(cm)
研究表明：菌株P2-2在不同磷源的无机磷培养基上产生的溶磷圈明显(图1)，且溶磷圈的直径与菌落的比值均大于1.2(表1)，证明菌株P2-2对不同无机磷的溶解效果均较好，是一种溶磷菌，且菌株P2-2能溶解Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石等多种磷源的培养基，证明溶磷菌P2-2菌株溶解磷源的范围广。
二、菌株P2-2对Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石为磷源的液体无机磷培养基的溶解作用
1、磷标准曲线的绘制
分别吸取0、2、4、6、8、10mL的浓度为5mg/L的磷标准溶液至50mL容量瓶中，再分别加入蒸馏水至体积为30mL；然后加入2滴2.4-二硝基酚指示剂，逐滴加入4mol/L的NaOH溶液至容量瓶中液体呈微黄色，再逐滴加入1mol/L的H2SO4至黄色刚刚消去，接着加入5mL钼锑抗显色剂，并用蒸馏水定容至刻度。在常温下显色1小时，然后与上述样品的显色液同在分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700nm。以磷浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制磷标准曲线。磷标准曲线如图2所示。
2、钼锑抗比色法测定发酵液中有效磷的含量
在500ml三角瓶中装入50mL已灭菌的难溶无机磷液体培养基，难溶磷酸盐分别为磷酸三钙(Ca3(PO4)2)、磷酸锌(Zn3(PO4)2)和羟基磷灰石，难溶磷酸盐浓度均为5g/L。将1mLP2-2菌悬液分别接种于上述难溶无机磷液体培养基，25℃,200r/min摇床培养5d，分别得到发酵液。将发酵液摇匀，取20mL到离心管中，8000r/min，离心10min，收集上清液；吸取5mL上清液到50mL的容量瓶中，加入蒸馏水至体积为30mL，加入2滴2.4-二硝基酚指示剂，再加入1滴1mol/L的H2SO4至溶液黄色刚好退去，接着加入5mL的钼锑抗试剂，定容至刻度，在常温下显色1小时。然后与上述样品的显色液同在分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700nm。根据标准曲线计算出对应的有效磷含量。同时以不接菌的溶液为对照。
结果如表2所示。菌株P2-2接种5天后各发酵液中有效磷含量分别是不接菌溶液的19.97倍、65.58倍和18.11倍。说明由于溶磷菌株P2-2对无机磷底物的溶解，显著增加了溶液中可溶性磷的含量。
表2、溶磷菌在不同磷源溶液中的溶解情况(mg/L)
实施例3、菌株P2-2与功能菌株的亲和性检验
淡紫拟青霉YES-2(YES-2)、红灰链霉菌HDZ-9-47(HDZ-9-47)和苍白杆菌NC1(NC1)均为具有防治黄瓜根结线虫的功能型复合微生物。
1、将PDA、高氏1号和LA培养基按照等质量比例混匀灭菌后倒入9cm培养皿中，得到混合培养基，待混合培养基凝固后将红灰链霉菌HDZ-9-47(HDZ-9-47)和苍白杆菌NC1(NC1)菌体以“井”字形划线方式接种到混合培养基，30℃培养2天；然后用打孔器从培养5d的菌株P2-2和淡紫拟青霉YES-2(YES-2)菌落边缘打取0.6cm的菌饼，分别接入距红灰链霉菌HDZ-9-47(HDZ-9-47)和苍白杆菌NC1(NC1)菌体0.5cm的位置，于25℃下倒置培养5d后观察各菌株间生物兼容性。
各功能菌株在混合培养基上共培养5d后的菌落形态如图3所示。菌株P2-2生长良好，且与各菌株间无拮抗现象，表明菌株P2-2与功能菌株淡紫拟青霉YES-2(YES-2)、红灰链霉菌HDZ-9-47(HDZ-9-47)和苍白杆菌NC1(NC1)间具有良好的生物兼容性。说明溶磷菌株P2-2具有用作功能型微生物菌群研究的潜在价值。
实施例4、菌株P2-2的发酵液对大豆幼苗的水培促生实验
1、幼苗的培育：把无菌纱布放入9cm培养皿中，倒入无菌水使纱布湿透，每皿加入大豆种子50粒，萌发，注意加水保湿；待幼苗长到5cm左右移栽。
2、难溶无机磷液体培养基的制备：在500ml三角瓶中装入难溶无机磷液体培养基，难溶磷酸盐分别为磷酸三钙(Ca3(PO4)2)、磷酸锌(Zn3(PO4)2)和羟基磷灰石，难溶磷酸盐浓度均为5g/L，分别得到磷酸三钙难溶无机磷液体培养基、磷酸锌难溶无机磷液体培养基和羟基磷灰石难溶无机磷液体培养基。
3、菌株P2-2的发酵液的制备：将200μL P2-2菌悬液分别接种于磷酸三钙难溶无机磷液体培养基、磷酸锌难溶无机磷液体培养基和羟基磷灰石难溶无机磷液体培养基，25℃，200r/min摇床培养5d，使菌株P2-2完全溶解难溶无机磷为有效磷，分别得到发酵液，灭活上述发酵液，并用无菌水稀释50倍，分别得到菌株P2-2溶解磷酸三钙的发酵液、P2-2溶解磷酸锌的发酵液和P2-2溶解羟基磷灰石的发酵液。装入容量瓶保存、备用。
4、菌株P2-2的发酵液对大豆幼苗的水培促生作用：将步骤1中的幼苗分别移至装有菌株P2-2溶解磷酸三钙的发酵液、P2-2溶解磷酸锌的发酵液和P2-2溶解羟基磷灰石的发酵液的50ml离心管中，每管1颗幼苗，3个重复。以水(CK，H2O)和未用菌株P2-2溶解的难溶无机磷液体培养基(CKS)为对照进行培养。培养12天后，分别观察大豆幼苗的长势，并测定大豆幼苗的株高和湿重。
表3、P2-2菌株发酵液对大豆幼苗的水培促生作用(12d)
结果如图4和表3所示。结果表明：菌株P2-2的发酵液与CKS相比，在菌株P2-2溶解磷酸三钙的发酵液、P2-2溶解磷酸锌的发酵液和P2-2溶解羟基磷灰石的发酵液中，大豆幼苗株高分别增加39.6％、26.7％、42.7％；湿重分别增加3.9％、3.9％、7.9％(表3)。从而说明，菌株P2-2能有效分解各种无机磷为有效磷，并且分解出的有效磷对植物幼苗具有明显的促生作用。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一株高效溶磷的塔宾曲霉菌株及其应用
<160>1
<210>1
<211>490bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ggaacatcat ctctcaagct atcttagctt gagttcagat gttatccatc gggtatatag 60
ctatcgggtt aagaacacgt ctaacaactc aacaggcaga ccatctctgg cgagcacggc 120
cttgacggct ccggtgtgta agtacaactt tttcacacct ctcaattggt caacaatgtg 180
gaaaggattg ggtttcctga cgcgcaggat agttacaatg gcacctccga cctccagctg 240
gagcgcatga acgtctactt caacgaggtt agatcacacc gtccctgagt tttttcacga 300
caatatcatc aatgtcctga ccacttcagc aggctagcgg taacaagtat gtcccccgtg 360
ccgtcctcgt cgatctcgag cccggtacca tggacgccgt ccgtgccggt cccttcggcc 420
agctcttccg ccccgacaac ttcgtcttcg gccagtccgg tgctggtaac aactgggcca 480
agggtcacta 490

Claims (10)

1.一株塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2，其保藏编号为CGMCC No.13185。
2.权利要求1所述的塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2在作为溶磷微生物中的应用。
3.权利要求1所述的塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在溶磷中的应用；
或权利要求1所述的塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备溶磷的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述溶磷为将难溶性无机磷转化为植物可吸收利用的有效磷；所述难溶性无机磷具体为磷酸三钙、磷酸锌或羟基磷灰石。
5.权利要求1所述的塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备复合微生物菌肥和/或植物营养液中的应用。
6.权利要求1所述的塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在促进植物生长中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述促进植物生长体现为增加植物株高和/或湿重。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
9.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的塔宾曲霉Aspergillus tubingensisP2-2或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；
所述产品具有如下1)-5)中任一所述的功能：
1)活化难溶性磷源；
2)将难溶性无机磷转化为植物可吸收利用的有效磷；
3)促进植物生长；
4)制备复合微生物菌肥；
5)制备植物营养液。
10.一种促进植物生长的方法，包括如下步骤：将植物在含有权利要求1所述的塔宾曲霉Aspergillus tubingensis P2-2的发酵液中培养。
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