CN105733954A - 一种高效解磷真菌草酸青霉菌及其培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效解磷真菌草酸青霉菌，该菌株的保藏号为CGMCC No.11126，从多年耕作大棚土壤分离所得，上述青霉菌的培养基由以下组分制备而成：10g葡萄糖，0.5g硫酸铵，0.3g氯化钠，0.3g氯化钾，0.03g七水合硫酸亚铁，0.03g四水合硫酸锰，0.3g七水合硫酸镁，5g磷酸三钙，20g琼脂制备而成的培养基上，培养温度：30℃，培养pH：7.0～7.2。本发明所提供的真菌草酸青霉菌具有很强的解磷功能，可用于制作用来提高植物磷素利用的土壤磷素活化剂，使其能成功定殖在植物本部，减少了含磷化肥的使用，提高果蔬产量。

Description

一种高效解磷真菌草酸青霉菌及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及菌株领域，具体涉及一种高效解磷真菌草酸青霉菌及其培养方法和应用。
背景技术
设施栽培越来越成为人们获得高产、优质、高效果蔬的主要途径，但是近几十年来，人们为了追求更高的经济利益，不惜向土壤过量施入肥料，尤其以氮肥、磷肥为最多，这就导致设施土壤养分富积，养分严重失衡，氮素、磷素累积严重。然而，当易溶性的磷肥施入土壤后，部分可被植物吸收利用，而另一部分与土壤组分发生反应后移出土壤相，成为植物难以利用的不溶性磷酸盐形态，固定在土壤中。因此，尽管土壤中磷含量很高，但可提供给植物生长发育的有效磷含量却很低。土壤中存在许多溶磷菌，溶磷微生物不仅能改善植物磷素营养，还能促进土壤中有益微生物的代谢活动，显著改善植物根部营养，提高作物的增产效果。利用微生物调节土壤难溶性无机磷向可溶性磷的转化是提高土壤中磷素的利用效率的重要途径。
目前已报道的具有溶磷能力的微生物包括细菌、真菌和放线菌等。溶磷真菌在数量上远不如溶磷细菌多，其种类也少，主要局限于青霉、曲霉、镰刀菌、小丝核菌等几个属种。但一般认为真菌的溶磷能力要强于细菌，可以达到细菌的10倍以上。许多溶磷细菌在传代培养后会丧失解磷能力，而且一旦丧失就不能再恢复，而溶磷真菌遗传较稳定，一般不易失去溶磷能力
发明内容
针对上述问题，本发明在多年耕作大棚土壤中分离、纯化出一株高效解磷真菌，能有效提高土壤中的可溶性磷含量，对其进行形态观察及分子鉴定，观察溶磷圈，测试其液体的溶磷能力，为利用、开发溶磷菌提高土壤磷利用率，提供理论依据。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种高效解磷真菌草酸青霉菌，命名为草酸青霉Penicilliumoxalicum，该菌株的保藏号为CGMCCNo.11126。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年07月31日。
上述的高效解磷真菌草酸青霉菌的培养方法，包括如下步骤：将该青霉菌接种于由10g葡萄糖，0.5g硫酸铵，0.3g氯化钠，0.3g氯化钾，0.03g七水合硫酸亚铁，0.03g四水合硫酸锰，0.3g七水合硫酸镁，5g磷酸三钙，20g琼脂制备而成的培养基上，培养温度：30℃，培养pH：7.0～7.2
上述的高效解磷真菌草酸青霉菌可用于提高土壤中的可溶性磷含量。
上述的高效解磷真菌草酸青霉菌可用于制作用来提高植物磷素利用的土壤磷素活化剂。
上述的高效解磷真菌草酸青霉菌分离方法为
(1)解磷真菌的初筛及纯化：
PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
称取10g土壤样品置于90mL无菌水中，高速震荡制成土壤悬液，土壤悬液梯度稀释后涂布在无机磷固体培养基上，涂好的平板用封口膜封口倒置于生化培养箱中30℃培养7d左右。通过观察平板上所长的真菌菌落周围是否能产生透明圈来初步筛选解无机磷真菌。挑取具有较明显透明圈的真菌菌落转至PDA平板上进行纯化培养，并作为解磷真菌复筛的出发菌株。
(2)解磷菌的复筛：
挑取各初筛菌株的菌丝，放于PDA斜面试管中，30℃恒温培养至长出孢子，用无菌水冲洗孢子，即制备成真菌的孢子悬液(孢子数约为1×107CFU/mL)。吸取5mL孢子悬液接入100mL无机磷液体培养基中，30℃摇床培养7d。培养完毕，发酵10000r/min离心5min，采用钼锑抗比色法定量测定上清液中可溶性磷的含量(使用光程10mm的比色皿，波长采用700nm)，以不接菌作为空白对照。对比各菌株发酵液中溶磷量的大小，筛选出高效解磷菌。
利用无机磷固体培养基平板分离所采集的土壤中的解磷真菌，获得2株能产生明显溶磷圈的真菌，说明这两株真菌具有溶解无机磷能力。将这两株真菌分别利用无机磷液体培养基培养初筛菌株7d后，钼蓝比色法测定发酵液中的可溶性磷含量发现其中一株真菌的溶磷能力最强，培养第7天时发酵液中可溶性磷含量达556.36mg/L，远远高于对照组(64.45mg/L)。本株菌命名为YYL1408-F-001。
其中，钼锑抗比色法定量测定上清液中可溶性磷的含量的方法参照国标GB11893-89水质总磷的测定。
经检测上述分离的解磷真菌在液体培养基中培养7d的可溶性磷含量达556.36mg/L。
本发明具有以下有益效果：
在多年耕作大棚土壤中分离、纯化出一株高效解磷真菌，此株菌的解磷功能很强，可制成土壤磷素活化剂用来提高植物磷素利用，使其能成功定殖在植物本部，减少了含磷化肥的使用，提高果蔬产量。
附图说明
图1为本发明实施例一种高效解磷真菌草酸青霉菌的分离方法的流程图。
图2为本发明实施例1中土壤有效磷含量测定方法测定土壤中有效磷含量的结果示意图。
图3为本发明实施例的解磷真菌菌株不同培养天数发酵液pH值与可溶性磷含量的关系。
图4为本发明实施例的解磷真菌菌株不同培养天数菌丝质量与发酵液中可溶性磷含量的关系。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
土壤过2mm筛，测含水量和pH值。土壤样品培养在250mL三角瓶中，每瓶加土壤100g，每瓶中加10mL真菌孢子悬液，孢子悬液浓度为1×107CFU/ml，对照组加入等体积无菌去离子水。向土壤中添加适量尿素(0.36g/kg土)，补充水分，使土壤中的总含水量保持在18％-20％。最后三角瓶用封口膜封口。放在生化培养箱中28℃培养。设置处理组(添加菌液，设置4个重复)和对照组(不添加菌液，同样设置4个重复)。分别在第0天、第3天、5天、10天、第15天、第20天、第30天、第45天、60天取样(对照组也是要定期取样)。按照《土壤农化分析》中土壤有效磷含量测定方法测定土壤中有效磷含量，结果如图2所示。
实施例2
盆栽试验设计
试验设3个处理，处理1施入液体菌肥30ml/盆，孢子悬液浓度为1×107CFU/ml，处理2每盆施入化肥磷肥30mg/kg土，每盆施入等量的氮钾肥，氮肥种类为尿素，施用量为60mg/kg土，钾肥为硫酸钾，施入量为75mg/kg土，处理3为不施氮磷钾肥(CK)。每个处理6个重复，每盆装土2kg。番茄供试品种为“辽园多丽”。全部肥料作为基肥一次性施入土壤。盆栽于苗期、花期、果期、盛果期测定番茄株高、茎粗，采集番茄样品带回实验室成鲜重、干重，测番茄根茎叶的养分吸收量，结果见表1-表5。
表1为番茄的四个时期，每个时期三个处理的株高比较
株高(mm) 苗期 花期 果期 盛果期
CK 21.81 30.12 43.87 47.22
P1 22.49 32.86 45.21 51.89
P2 23.67 35.01 47.92 53.43
表2为番茄的四个时期，每个时期三个处理的茎粗比较
茎粗(mm) 苗期 花期 果期 盛果期
CK 3.16 4.41 5.37 6.42
P1 4.35 5.04 6.01 7.12
P2 4.52 5.23 6.28 7.31
表3为番茄采收期，三个处理下，番茄植株的根茎叶部位分别对氮的含量和吸收量的值
表4为番茄采收期，三个处理下，番茄植株的根茎叶部位分别对钾的含量和吸收量的值
表5为番茄采收期，三个处理下，番茄植株的根茎叶部位分别对磷的含量和吸收量的值
表1-表5中CK为不施肥处理，P1为施化肥处理(氮磷钾肥均为化肥)，P2为化肥与解磷菌菌液配施(氮钾肥为化肥，磷化肥用解磷菌菌液代替)。
将上述解磷真菌接种于培养基上，检测水溶性磷含量、发酵离心液pH值和菌丝生长量的测定结果如图3和图4所示，培养基的配方为
葡萄糖：10g；硫酸铵：0.5g；氯化钠：0.3g；氯化钾：0.3g；七水合硫酸亚铁：0.03g；四水合硫酸锰：0.03g；七水合硫酸镁：0.3g；磷酸三钙：5g；琼脂：20g。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种高效解磷真菌草酸青霉菌，其特征在于，命名为草酸青霉Penicilliumoxalicum，该菌株的保藏号为CGMCCNo.11126。
2.如权利要求1所述的一种高效解磷真菌草酸青霉菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将该青霉菌接种于由10g葡萄糖，0.5g硫酸铵，0.3g氯化钠，0.3g氯化钾，0.03g七水合硫酸亚铁，0.03g四水合硫酸锰，0.3g七水合硫酸镁，5g磷酸三钙，20g琼脂制备而成的培养基上，培养温度：30℃，培养pH：7.0～7.2。
3.如权利要求1所述的一种高效解磷真菌草酸青霉菌的应用，其特征在于，用于提高土壤中的可溶性磷含量。
4.如权利要求1所述的一种高效解磷真菌草酸青霉菌的应用，其特征在于，用于制作用来提高植物磷素利用的土壤磷素活化剂。
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