CN109652340A - 一种大豆专用多功能促生菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种大豆专用多功能促生菌剂，由FK19菌株发酵而成，所述FK19菌株的分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，2018年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018925。本发明的有益效果是：本发明的多功能促生菌剂对大豆生长有明显的促进作用，对大豆叶片含磷量、含钾量有明显的增加效果，可以提高大豆产量。大豆根部会产生大豆凝集素，凝集素是非免疫来源的糖结合蛋白或糖蛋白，可以和细菌的多糖结合，本发明的多功能促生菌剂具有大豆凝集素亲和性，可以和大豆凝集素结合，吸附在大豆根部，并进而促进大豆合成更多的异黄酮类物质，介导菌株在大豆根部定殖，以发挥菌剂的促生功能。

Description

一种大豆专用多功能促生菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种大豆专用多功能促生菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

大豆是我国主要的经济作物之一，在我国具有广泛的种植率。磷素和钾素对大豆物质积累、产量及品质具有重要意义。我国人口多，耕地少，土壤中虽然含有丰富的磷素和钾素，但多以难溶态磷和钾形式存在，难以被大豆吸收利用。农业上为了提高大豆的产量和质量常使用大量的磷肥和钾肥，但大豆对磷肥和钾肥的利用率过低，无法吸收肥料所给予的营养成分，导致重金属过度积累、土壤贫瘠化等现象，同时也造成了严重的环境污染和资源浪费问题。土壤中存在解磷菌、解钾菌，能够将土壤中难溶性磷、钾转化为可供植物吸收利用的磷元素和钾元素，从而促进植物的生长发育，改善土壤生态环境，因此利用这些有益微生物开发微生物肥料菌剂，是促进大豆磷素和钾素的吸收，降低化肥用量的有效途径。普通微生物肥料如解磷菌剂或解钾菌剂只能为植物提供单一营养元素，难以满足植物对多种营养元素的要求，且无法保证菌剂能长期存活在植物根际，稳定发挥作用。因此开发能够在大豆根部定殖并具有多种促生功能的大豆专用多功能促生菌剂对于促进大豆生长及养分吸收，降低化肥使用量，维持农业可持续发展具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种大豆专用的多功能促生菌剂及其制备方法和应用，该菌剂同时具备溶解土壤中难溶态磷和钾的作用，给大豆生长提供磷和钾，促进大豆生长。

本发明提供了如下的技术方案：

一种大豆专用多功能促生菌剂，由FK19菌株发酵而成，所述菌株FK19 的分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，2018年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2018925。

优选的，所述多功能促生菌剂为液态菌剂或者固态菌剂。

本发明还提供了一种多功能促生菌剂的制备方法，所述液态菌剂的制备方法如下：

S1、菌种活化，将FK19菌株接入LB斜面培养基中，在25-30℃培养 18-30h；

S2、培养基培养，使用生理盐水洗涤斜面菌株后，以2-8％接种量接入 80-120mLLB液体培养基中，于25-30℃、120-180r·min^-1振荡培养24-48h 至菌液OD₆₈₀值为0.7-0.9，即制得所述液态菌剂。

优选的，所述固态菌剂的制备方法如下：

在所述液态菌剂中按照每毫升液态菌剂加入干燥的泥炭0.5-1g，混匀后再发酵1-3h，置于室内晾干即制得所述固态菌剂。

优选的，所述液态菌剂中FK19活菌数在1×10⁸-9×10⁸CFU/mL范围内。

优选的，所述液态菌剂的每亩大豆田使用量为15-60L，所述液态菌剂中活菌数在1×10⁸-9×10⁸CFU/mL范围内。

优选的，所述固态菌剂的每亩大豆田使用量为2-5kg，所述固态菌剂中 FK19活菌数在2×10⁸-8×10⁸CFU·mL^-1范围内。

优选的，所述多功能促生菌株的筛选方法如下：

S1、获取生长28-32天的大豆幼根，置入含有40-60μg·mL^-1制霉菌素的无菌生理盐水中，于28℃、100-200r·min^-1振荡培养1-2h，采用十倍梯度法，制成10^-1至10^-5浓度梯度的菌悬液，分别从各稀释度的菌悬液中取 100-200μL涂布于pH为7.0-7.2的解磷细菌固体培养基平板上，27-29℃培养24-36h，挑取具有解磷圈的菌株，分离纯化得到解磷菌单菌落；

S2、将S1获得的解磷菌株接种至解钾细菌培养基中，于27-29℃培养 24-36h，测定菌株解钾能力，筛选获得具有解磷和解钾功能的多功能菌株；

S3、将S2获得的多功能菌株接种至pH7.0-7.2的LB液体培养基中，于27-29℃、150-200r·min^-1振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，无菌水离心洗涤3-5次后制成菌悬液，取20-30μL菌悬液与等体积的大豆凝集素均匀混合，20-30℃下反应20-40min，自然干燥，染色，镜检，挑选具有凝集反应的菌株，获得具有大豆亲和性的多功能促生菌株，即FK19。

优选的，所述解磷细菌培养基的配方为：葡萄糖8-12g、K₂HPO₄ 1.8-2.2g、硫酸铵0.4-0.6g、NaCl 0.2-0.4g、KCl 0.2-0.4g、MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4g、 FeSO₄·7H₂O 0.02-0.04g、MnSO₄·4H₂O 0.02-0.04g、Ca₃(PO₄)₂ 8-12g、琼脂 15-20g、蒸馏水1000mL；

所述解钾细菌培养基的配方为：Na₂HPO₄ 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeCl₃ 0.005g、CaCO₃ 0.1g、钾矿物质1.0g、蔗糖5.0g、1000mL；

所述LB培养基的配方为：蛋白胨8-12g、酵母粉4-6g、NaCl 8-12g、琼脂15-20g、蒸馏水1000mL本发明的有益效果是：

1、本发明的多功能促生菌剂对大豆生长有明显的促进作用，对大豆叶片含磷量、含钾量有明显的增加效果，可以提高大豆产量。大豆根部会产生大豆凝集素，凝集素是非免疫来源的糖结合蛋白或糖蛋白，可以和细菌的多糖结合，本发明的多功能促生菌剂具有大豆凝集素亲和性，可以和大豆凝集素结合，吸附在大豆根部，并进而促进大豆合成更多的异黄酮类物质，介导菌株在大豆根部定殖，以发挥菌剂的促生功能。

2、本发明的多功能促生菌剂还具有溶解Ca₃PO₄、植酸钙、卵磷脂等难溶态磷的能力，增加土壤中速效磷含量；本发明的多功能促生菌剂具有明显的解钾效果，增加土壤中速效钾含量，改善土壤环境。

FK19菌株溶解无机磷的机理主要是通过：1、菌株在代谢过程中分泌有机酸，如草酸、乳酸、柠檬酸和羟基乙酸等，这些有机酸既可以降低pH值，又能与Fe³⁺、Al³⁺、Ca²⁺等离子结合，从而溶解难溶性无机磷酸盐。2、菌株通过呼吸释放出CO₂，降低环境pH值，从而溶解难溶性无机磷酸盐。

FK19菌株降解有机磷的机理主要是通过：菌株分泌植酸酶、磷酸酶和核酸酶等酶类，将难溶态有机磷为降解为可溶态。

FK19菌株的解钾机理主要有酸解、酶解、配合螯合、溶蚀等作用。FK19 菌株解钾主要是通过：1、分泌有机酸如草酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸，溶解难溶态钾。2、FK19菌株与矿物接触产生特殊的酶，这些酶破坏了土壤中矿石结晶结构，并发生离子交换反应，使其中的钾释放出来。3、FK19菌株分泌的胞外多糖能紧紧的包绕矿物，使菌体与矿石能紧密接触，并且提高矿物表面有机酸的浓度。在有机酸酸溶作用和络合作用的共同作用下，矿物中的钾被释放出来。4、细菌通过分泌的胞外多糖与钾长石形成细菌矿物复合体，细菌对矿物颗粒表面较脆弱的部位产生溶烛作用，以及细菌产生的代谢产物对矿物进行化学降解作用，导致钾离子等的释放，从而将难溶性钾转换为可溶性的速效钾供大豆吸收。

3、除了提供P、K等必需元素外，细菌分泌吲哚乙酸、铁载体等也对大豆的生长有重要作用。

本发明的多功能促生菌剂不仅具有解磷解钾功能，还具有产吲哚乙酸、产铁载体的能力。吲哚乙酸是重要的生长素，对植物茎、芽、根的发育均有明显的促进作用；铁载体对游离的Fe³⁺具有较高亲和力，可与根际周围可以被植物利用的Fe³⁺结合，导致植物根际周围铁元素缺乏，从而有效阻止病原菌在植物根际的繁殖，减少病原菌对植株的伤害。

4、本发明的多功能促生菌剂通过不同的施菌方式，使操作过程更加简便，易于大规模操作且均可达到显著的促生效果。

5、本发明的液态菌剂施入土壤中用量为15-60L/hm²。目前种植大豆磷肥的施用量为30-50kg/hm²，钾肥的施用量为30-60kg/hm²，相比之下，使用多功能促生菌剂用量少，效果显著，同时避免了化学肥料带来的环境及安全问题。

附图说明

图1是FK19菌株菌落图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做具体说明。

实施例1菌株的筛选

菌株的筛选方法如下：

获取生长28-32天的大豆幼根，置入含有40-60μg·mL^-1制霉菌素的无菌生理盐水中，于28℃、100-200r·min^-1振荡培养1-2h，采用十倍梯度法，制成10^-1至10^-5浓度梯度的菌悬液，分别从各稀释度的菌悬液中取100-200μL 涂布于pH为7.0-7.2的解磷细菌固体培养基平板上，解磷细菌培养基的配方是葡萄糖10g、K₂HPO₄ 2.0g、硫酸铵0.5g、NaCl 0.3g、KCl0.3g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、FeSO₄·7H₂O 0.03g、MnSO₄·4H₂O 0.03g、Ca₃(PO₄)₂ 10g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。27-29℃培养24-36h，挑取具有解磷圈的菌落，分离纯化得到解磷菌单菌落；获得的解磷菌株接种至解钾细菌培养基中，解钾培养基配方是Na₂HPO₄ 2.0g、MgSO₄·7H₂O0.5g、FeCl₃ 0.005g、CaCO₃ 0.1g、钾矿物质1.0g、蔗糖5.0g、琼脂粉15g、蒸馏水1000mL，pH7.0。将菌株于27-29℃培养24-36h，测定菌株解钾能力，筛选获得具有解磷和解钾功能的多功能菌株；将获得的多功能菌株接种至pH 7.0-7.2的LB液体培养基中，于27-29℃、 150-200r·min^-1振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，无菌水离心洗涤 3-5次后制成菌悬液，取20-30μL菌悬液与等体积的大豆凝集素均匀混合， 20-30℃下反应20-40min，自然干燥，染色，镜检，挑选具有凝集反应的菌株，获得具有大豆亲和性的多功能促生菌株，即FK19。

所述LB培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。

实施例2菌株解磷、解钾能力的测定

采用选择性培养基和凝集素双重筛选法从大豆根际筛选出与大豆具有特异亲和性的具有解磷解钾双重功能的促生菌株共20株，并测定这些菌株的解磷、解钾能力。

制备各菌株菌悬液，将菌株以2％的接种量分别接入含有磷酸三钙、植酸钙和卵磷脂的解磷培养基中，培养基配方是葡萄糖10g、K₂HPO₄ 2.0g、硫酸铵0.5g、NaCl 0.3g、KCl0.3g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、FeSO₄·7H₂O 0.03g、MnSO₄·4H₂O 0.03g、难溶性磷10g、蒸馏水1000mL，pH 7.2，并于28℃， 160r·min^-1振荡培养5d。采用钼锑抗法测定培养液中速效磷含量。

制备各菌株菌悬液，将菌株以2％的接种量分别接入解钾液体培养基中，解钾培养基配方是Na₂HPO₄ 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeCl₃ 0.005g、CaCO₃ 0.1g、钾长石1.0g、蔗糖5.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5，并于28℃，160r·min^-1振荡培养5d。每瓶菌液接入4mLH₂O₂，于121℃消解30min后6000r·min^-1离心5min，取上清液定容至100mL，采用火焰光度计法测定上清液中速效钾含量。

比较各菌株解磷和解钾能力，其中FK19菌株解磷和解钾能力最佳。FK19 菌株对难溶性磷和钾的溶解能力见表1。由表1可见，FK19菌株具有溶解多种难溶性磷的能力，对Ca₃PO₄、植酸钙和卵磷脂均有较好的溶解能力，且具有较高的解钾能力。

表1 FK19菌株对难溶性磷和难溶性钾的溶解能力

实施例3菌株的鉴定

结合形态学观察、生理生化试验和16SrRNA基因序列比对分析鉴定FK19 菌株种属。

根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对FK19 菌株进行生理生化特性检测。其中形态学试验包括革兰氏染色；生理生化试验包括淀粉水解试验、V-P试验、接触酶试验、葡萄糖氧化分解试验、硫化氢试验、明胶液化试验、甲基红试验，结果见表2。

表2 菌株部分生理生化特征

测定FK19菌株16SrRNA基因序列，向NCBI数据库中检索相似序列，进行比对，结合生理生化试验结构，确定FK19菌株属巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。FK19菌株16SrRNA基因序列见附表。

实施例4FK19菌株产IAA和铁载体能力的测定

将FK19菌株以2％接种量接种至有氮液体培养基中，于28℃、160 r·min^-1振荡培养5d，离心去沉淀，取上清，按照1:2的比例加入相应的 Fe-HClO₄混合液，在暗处25℃混合反应30min，以不接菌的有氮培养液作为空白对照，测定530nm处的吸光值，计算FK19菌株产IAA水平。Fe-HClO₄混合液：1mL 0.5mol·L^-1FeCl₃溶液加入到50mL 35％HClO₄溶液中，混合均匀。有氮液体培养基配方：蔗糖10.0g、K₂HPO₄ 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl 0.1g、酵母膏0.5g、CaCO₃ 0.5g、琼脂20g、蒸馏水400mL，pH7.0。

将FK19菌株以2％接种量接种至MKB液体培养基中，于28℃、160 r·min^-1振荡培养48h，离心取上清，以1:1比例加入CAS检测液，混匀，静置1h后，以蒸馏水为对照调零，在630nm波长下测吸光值(A)。另取CAS 检测液与未接菌的MKB培养基按1：1比例混合，测630nm吸光值(Ar)，采用紫外分光光度计法测定FK19菌株产铁载体能力。MKB培养基配方：酪蛋白氨基酸5.0g、甘油15mL、K₂HPO₄ 2.5g、MgSO₄·7H₂O 2.5g、蒸馏水1000mL， pH 7.2。CAS检测液：取6mL 10mmol·L^-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液至100mL容量瓶中，用双蒸水稍作稀释。再将1.5mL 1mmol·L^-1FeCl₃溶液与7.5mL 2mmol·L^-1铬天青(CAS)溶液的混合液沿着玻璃棒缓慢加入至上述容量瓶中。称取4.307g无水双二甲胺(无水哌嗪)溶解于约30mL双蒸水中，加入6.25mL 12mol·L^-1HCl，此时得到pH为5.6的缓冲液。将此溶液转移至上述容量瓶中，加入双蒸水定容至100mL，备用。

表3 FK19菌株产IAA和铁载体能力

FK19菌株产IAA和铁载体能力见表3。由表可见FK19菌株具有较强的产IAA和铁载体能力，说明该菌株具有促进植物生长，抵抗病原菌的潜能。

实施例5液态菌剂的制备以及用于大豆的盆栽试验

液态菌剂的制备

将FK19菌株以2％接种量接种至LB液体培养基中，28℃，120-180 r·min^-1振荡培养24-36h，至液体菌剂OD₆₈₀值达0.8。

液态菌剂的盆栽试验

大豆盆栽试验分成两组，一组为施液态菌剂的实验组，另一组为未施菌剂的对照组，实验组设3个重复，对照组设7个重复。将催芽后的大豆种于花盆中，每盆接种液态菌剂5mL，对照组施加等量的LB液体培养基。大豆成熟后分别测定实验组和对照组大豆的根鲜重、根干重、株高、单株豆重，叶片含氮量、含磷量、含钾量及土壤含氮量、含磷量和含氮量，结果见表4、表5、表6。

表4 FK19液态菌剂对大豆根系发育、株高及产量的影响

注：*表示处理间差异显著(p<0.05)。

由表4可见，施加FK19液态菌剂的实验组，其大豆植株根鲜重、根干重、株高、单株豆重分别较未施菌剂的对照提高47.16％、63.87％、26.05％和60.22％，其中单株豆重较对照组有显著增加。施用FK19液态菌剂能够促进大豆根系发育，提高大豆产量。

表5 FK19液态菌剂对大豆叶片含氮量、含磷量及含钾量的影响

注：*表示处理间差异显著(p<0.05)，**表示处理间差异极显著(p<0.01)。

由表5可见，施加FK19液态菌剂的实验组，其大豆叶片含氮量、含磷量、含钾量分别较未施菌剂的对照提高2.43％、34.05％和25.00％，其中叶片含钾量的提高达显著水平，叶片含磷量的提高达极显著水平。施用FK19液态菌剂能够提高大豆对营养物质的吸收，特别是对磷素和钾素的吸收。

表6 FK19液态菌剂对土壤含氮量、含磷量及含钾量的影响

注：*表示处理间差异显著(p<0.05)，**表示处理间差异极显著(p<0.01)。

由表6可见，施加FK19液态菌剂的实验组，其大豆根际土壤含氮量、含磷量、含钾量分别较未施菌剂的对照提高5.61％、286.82％和28.21％，土壤含钾量的提高达显著水平，土壤含磷量的提高达极显著水平。研究结果表明FK19液态菌剂可以将土壤中难溶态的磷和钾转变成可供植物吸收利用的可溶性磷和钾，供大豆吸收利用。

综上，FK19液态菌剂可将土壤中难溶态磷和钾释放出来，显著提高土壤含磷量、含钾量，以促进大豆对磷素和钾素的吸收，提高叶片含磷量和含钾量，进而促进大豆的生长，提高大豆产量。

实施例6固态菌剂的制备以及用于大豆的盆栽试验

将浓度为1×10⁸-9×10⁸CFU·mL^-1的FK19菌液以2-10％的接种量接入 100mL LB液体培养基中，于28℃、160r·min^-1振荡培养30h，加入干燥的泥炭150g混匀，再发酵1-3h，置于室内晾干即制得固态菌剂。

将催芽后的大豆种于花盆中，在大豆根部施入5g固态菌剂，以施入泥炭的大豆作为对照组。日常管理至大豆成熟后测定大豆根鲜重、根干重、株高、单株豆重、叶片含氮量、叶片含磷量、叶片含钾量、土壤含氮量、土壤含磷量和土壤含钾量，结果见表7、表8、表9。

表7 FK19固态菌剂对大豆根系发育、株高及产量的影响

注：*表示处理间差异显著(p<0.05)。

由表7可见，施加FK19固态菌剂的实验组，其大豆植株根鲜重、根干重、株高、单株豆重分别较未施菌剂的对照提高45.54％、62.74％、23.74％和57.31％，其中根鲜种和单株豆重较对照组有显著增加。施用FK19固态菌剂能够促进大豆根系发育，提高大豆产量。

表8 FK19固态菌剂对大豆叶片含氮量、含磷量及含钾量的影响

注：*表示处理间差异显著(p<0.05)，**表示处理间差异极显著(p<0.01)。

由表8可见，施加FK19固态菌剂的实验组，其大豆叶片含氮量、含磷量、含钾量分别较未施菌剂的对照提高3.66％、30.04％和23.07％，其中叶片含钾量的提高达显著水平，叶片含磷量的提高达极显著水平。施用FK19固态菌剂能够提高大豆对营养物质的吸收，特别是对磷素和钾素的吸收。

表9 FK19固态菌剂对土壤含氮量、含磷量及含钾量的影响

注：*表示处理间差异显著(p<0.05)，**表示处理间差异极显著(p<0.01)。

由表9可见，施加FK19固态菌剂的实验组，其大豆根际土壤含氮量、含磷量、含钾量分别较未施菌剂的对照提高6.33％、106.15％和25.53％，其中土壤含钾量的提高达显著水平，土壤含磷量的提高达极显著水平。研究结果表明FK19固态菌剂可以将土壤中难溶态的磷和钾转变成可供植物吸收利用的可溶性磷和钾，供大豆吸收利用。

综上，FK19固态菌剂可将土壤中难溶态磷和钾释放出来，显著提高土壤含磷量、含钾量，以促进大豆对磷素和钾素的吸收，提高叶片含磷量和含钾量，进而促进大豆的生长，提高大豆产量。

实施例7液态菌剂用于大豆的田间试验

将FK19菌株以2％接种量接种至LB液体培养基中，于28℃，120-180 r·min^-1振荡培养24-36h，至OD₆₈₀达0.8，制得液态菌剂。将未催芽大豆种子种植于田间，待大豆出苗后于根部接入20mL液态菌剂，以未施液态菌剂的大豆为对照组1，以施加20mL LB培养基的大豆为对照组2，田间管理至大豆成熟后测定大豆株高、单株豆重、叶片含氮量、叶片含磷量、叶片含钾量及大豆根际土壤含氮量、含磷量、含钾量。结果如表10、表11、表12。

表10 田间试验中液态菌剂对大豆株高及产量的影响

注：同列数值后不同字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。

表11 田间试验中液态菌剂对大豆叶片含氮量、含磷量及含钾量的影响

注：同列数值后不同字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。

表12田间试验中液态菌剂对对大豆土壤含氮量、含磷量及含钾量的影响

注：同列数值后不同字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。

由表10、11、12可见:处理组1和处理组2各项指标均无显著差异，说明LB培养基对大豆生长、产量、叶片氮磷钾含量及土壤氮磷钾含量均无影响。施加FK19固态菌剂的实验组，其大豆单株豆重、叶片含磷量、叶片含钾量、土壤含磷量、土壤含钾量较未施菌剂的对照达显著水平，说明FK19 菌剂可将土壤中难溶态磷和钾释放出来，显著提高土壤含磷量、含钾量，以促进大豆对磷素和钾素的吸收，提高叶片含磷量和含钾量，进而促进大豆的生长，提高大豆产量。该多功能菌剂在田间试验中效果显著，可显著提高大豆的产量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种大豆专用多功能促生菌剂及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1426

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 1

tacgaacccc tcttccaacg ggcttccctc cacaagggtt aggccaccgg cttcaggtgt 60

taccgacttt catgacttga cgggcggtgt gtacaagacc cgggaacgta ttcaccgcag 120

cgttgctgat ctgcgattac tagcgactcc gacttcatga ggtcgagttg cagacctcaa 180

tccgaactgg gaccggcttt ttgggattcg ctccacctca cggtattgca gccctttgta 240

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cccaccttcc tccgagttga ccccggcagt atcccatgag ttcccaccat tacgtgctgg 360

caacatagaa cgagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc 420

tgacgacaac catgcaccac ctgtttacga gtgtccaaag agttgaccat ttctggcccg 480

ttctcgtata tgtcaagcct tggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta atccgcatgc 540

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ctttcgctcc tcagcgtcag ttacggccca gagatctgcc ttcgccatcg gtgttcctcc 780

tgatatctgc gcattccacc gctacaccag gaattccaat ctcccctacc gcactctagt 840

ctgcccgtac ccactgcagg cccgaggttg agcctcggga tttcacagca gacgcgacaa 900

accgcctacg agctctttac gcccaataat tccggataac gcttgcgccc tacgtattac 960

cgcggctgct ggcacgtagt tagccggcgc tttttctgca ggtaccgtca ctttcgcttc 1020

ttccctgcta aaagaggttt acaacccgaa ggccgtcatc cctcacgcgg cgttgctgca 1080

tcaggcttcc gcccattgtg caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg 1140

tgtctcagtc ccagtgtggc cggtcaccct ctcaggccgg ctacccgtcg acgccttggt 1200

gagccattac ctcaccaaca agctgatagg ccgcgagccc atccccaacc gaaaaatctt 1260

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Claims (9)

1.一种大豆专用多功能促生菌剂，其特征在于，由FK19菌株发酵而成，所述FK19菌株的分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，2018年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018925。

2.根据权利要求1所述的一种大豆专用多功能促生菌剂，其特征在于，所述多功能促生菌剂为液态菌剂或者固态菌剂。

3.一种根据权利要求2所述的大豆专用多功能促生菌剂的制备方法，其特征在于，所述液态菌剂的制备方法如下：

S1、菌种活化，将FK19菌株接入LB斜面培养基中，在25-30℃培养18-30h；

S2、培养基培养，使用生理盐水洗涤斜面菌株后，以2-8％接种量接入80-120mL LB液体培养基中，于25-30℃、120-180r·min^-1振荡培养至FK19菌液浓度为OD₆₈₀＝0.7-0.9，即制得所述液态菌剂。

4.根据权利要求3所述的一种大豆专用多功能促生菌剂的制备方法，其特征在于，所述固态菌剂的制备方法如下：

在所述液态菌剂中按照每毫升液态菌剂加入干燥的泥炭0.5-1g混匀后再发酵1-3h，置于室内晾干即制得所述固态菌剂。

5.根据权利要求3所述的一种大豆专用多功能促生菌剂的制备方法，其特征在于，所述液态菌剂中FK19菌株活菌数在1×10⁸-9×10⁸CFU·mL^-1范围内。

6.根据权利要求2所述的一种大豆专用多功能促生菌剂，其特征在于，所述液态菌剂的每亩大豆田使用量为15-60L，所述液态菌剂中FK19菌株活菌数在1×10⁸-9×10⁸CFU·mL^-1范围内。

7.根据权利要求2所述的一种大豆专用多功能促生菌剂，其特征在于，所述固态菌剂的每亩大豆田使用量为2-5kg，所述固态菌剂中FK19菌株活菌数在2×10⁸-8×10⁸CFU·mL^-1范围内。

8.根据权利要求1所述的一种大豆专用多功能促生菌剂，其特征在于，所述FK19菌株的筛选方法包括如下步骤，

S1、获取生长28-32天的大豆幼根，置入含有40-60μg·mL^-1制霉菌素的无菌生理盐水中，于28℃、100-200r·min^-1振荡培养1-2h，采用十倍梯度法，制成10^-1至10^-5浓度梯度的菌悬液，从各稀释度的菌悬液中分别取100-200μL涂布于pH为7.0-7.2的解磷细菌固体培养基平板上，27-29℃培养24-36h，挑取具有解磷圈的菌株，分离纯化得到解磷菌单菌落；

S2、将S1获得的解磷菌株接种至解钾细菌培养基中，于27-29℃培养24-36h，测定菌株解钾能力，筛选获得具有解磷和解钾功能的多功能菌株；

S3、将S2筛选获得的多功能菌株接种至pH 7.0-7.2的LB液体培养基中，于27-29℃、150-200r·min^-1振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，无菌水离心洗涤3-5次后制成菌悬液，取20-30μL菌悬液与等体积的大豆凝集素均匀混合，20-30℃下反应20-40min，自然干燥，染色，镜检，挑选具有凝集反应的菌株，获得具有大豆亲和性的多功能促生菌株，即FK19。

9.根据权利要求8所述的一种大豆专用多功能促生菌剂，其特征在于，所述解磷细菌培养基的配方为：葡萄糖8-12g、K₂HPO₄ 1.8-2.2g、硫酸铵0.4-0.6g、NaCl 0.2-0.4g、KCl 0.2-0.4g、MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4g、FeSO₄·7H₂O 0.02-0.04g、MnSO₄·4H₂O 0.02-0.04g、Ca₃(PO₄)₂ 8-12g、琼脂15-20g、蒸馏水1000mL；

所述解钾细菌培养基的配方为：Na₂HPO₄ 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeCl₃ 0.005g、CaCO₃0.1g、钾矿物质1.0g、蔗糖5.0g、1000mL；

所述LB培养基的配方为：蛋白胨8-12g、酵母粉4-6g、NaCl 8-12g、琼脂15-20g、蒸馏水1000mL。