CN106520591A - 一种促生芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促生芽孢杆菌及其应用，所述芽孢杆菌这样分离培养获得：取土壤，采用Ashby培养基、亚历山大硅酸盐细菌培养基、蒙金娜有机磷培养基和磷酸三钙无机磷培养基，进行自生固氮菌、解钾菌、溶有机磷和无机磷菌的分离。本发明促生芽孢杆菌具有固氮、溶无机磷、解钾和抑制太子参根腐病菌的作用，可促进太子参生长、增加产量，提高对太子参根腐病的防治效果，同时对块根活性成分皂苷含量也有促进作用。不仅减少化学肥料和农药对太子参种植地环境和块根质量的影响以及生产投入，而且能提高其块根产量和药用价值，有利于太子参田间的大面积种植。

Description

一种促生芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种促生芽孢杆菌及其应用，特别是一种促进太子参生长的芽孢杆菌。
技术背景
太子参为常用的中药，系石竹科植物孩儿参pscudostaria heterophyla(Miq.)的干燥块根。是中医常用补虚药，具有益气健脾、生津润肺的作用，可用于脾虚体倦、病后虚弱、自汗口渴、肺燥干咳。贵州省施秉县从福建柘荣县引进太子参后，发展速度比较快，逐渐成为当地农民脱贫致富的经济作物之一，目前施秉县太子参种植面积已经超过667hm2，有望成为我国太子参的主产区。但随着太子参连作年限的延长，种植过程中出现了严重的连作障碍，导致土壤营养失衡(速效氮、速效磷、速效钾含量下降)和土壤微生态环境的变化(病原菌的数量与种类增加)。土壤营养失衡直接影响太子参植株的正常生长发育；土壤微生态中病原物特别是根腐病病原物数量的增加会导致该病害发生日趋严重，植株自下而上枯萎，最终全株枯死。针对上述问题，为了保证太子参的产量，所以在生产中往往需要使用一些化学肥料(如氮磷钾复合肥)和农药(如多菌灵、克菌康、退菌灵、广枯灵，甲基硫菌灵等)，而这些化学产品将会影响太子参种植地和太子参的质量，进而影响到环境和临床用药安全性。
目前太子参种植中大量施用化学肥料和农药，再加上土壤有机质越来越贫瘠，使得太子参连作障碍表现得愈加明显，如病虫害加重、产量和品质严重降低等，给当地药农造成了很大的经济损失，严重影响了太子参产业化和区域经济的发展。
发明内容：
本发明的目的在于，提供一种促生芽孢杆菌及其应用。本发明促生芽孢杆菌具有固氮、溶无机磷、解钾和抑制太子参根腐病菌的作用，可促进太子参生长、增加产量，提高对太子参根腐病的防治效果，同时对块根活性成分皂苷含量也有促进作用。不仅能减少化学肥料和农药对太子参种植地环境和块根质量的影响以及生产投入，而且能提高其块根产量和药用价值，有利于太子参田间的大面积种植。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案实现：一种促生芽孢杆菌，所述芽孢杆菌这样分离培养获得：取土壤，采用Ashby培养基、亚历山大硅酸盐细菌培养基、蒙金娜有机磷培养基和磷酸三钙无机磷培养基，进行自生固氮菌、解钾菌、溶有机磷和无机磷菌的分离，即得促生芽孢杆菌。
前述的促生芽孢杆菌中，所述芽孢杆菌的分离培养具体包括以下步骤：
(1)自生固氮菌的分离筛选：称取黄泥土，加入19倍量的无菌水，搅拌15min后静置10min；取上述上清液，依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液，然后吸取10-3、10-4、10-5土壤稀释液分别涂布在直径为9cm的Ashby培养基平板上，每个浓度涂布3皿，然后倒置于28℃的恒温培养箱内培养，待有菌落出现时，挑选重复皿内菌落转接入PDA斜面试管中，于25-30℃下培养3-5d后，备用；
(2)固氮兼解钾菌的分离筛选：将上述保存的菌落接入亚历山大硅酸盐细菌培养基平板进行解钾作用的测试，直至平板生长良好，菌落保存，备用；
(3)将步骤(2)中的菌落分别接入蒙金娜有机磷培养基平板和磷酸三钙无机磷培养基平板进行溶磷作用测试，取菌落周围出现透明溶磷圈的菌株，保存备用；
(4)固氮、解钾、溶磷兼具抑菌作用的菌株分离筛选：以太子参根腐病菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和黑白轮枝菌Verticillium albo-atrum为作用对象，在步骤(3)所得的菌株基础上进行平板对峙培养，筛选兼有抑菌作用的多功能菌株，即得。
前述的促生芽孢杆菌中，所述Ashby培养基按重量份计算，主要由KH2PO40.1-0.3份、MgSO4·7H2O 0.1-0.3份、NaCl 0.1-0.3份，CaCO33-7份、甘露醇5-15份、CaSO4·2H2O0.05-0.15份、琼脂8-28份和蒸馏水900-1100份混合而成。
前述的促生芽孢杆菌中，所述Ashby培养基按重量份计算，主要由KH2PO40.2份、MgSO4·7H2O 0.2份、NaCl 0.2份，CaCO35.0份、甘露醇10.0份、CaSO4·2H2O 0.1份、琼脂18.0份和蒸馏水1000份混合而成。
前述的促生芽孢杆菌中，所述亚历山大硅酸盐细菌培养基按重量份计算，主要由蔗糖1-10份、MgSO4·7H2O 0.1-1.0份、CaCO30.05-0.15份、磷酸氢二钠1-4份、FeCl3·6H2O0.0025-0.010份、钾长石0.5-1.5份、琼脂8-28份和蒸馏水900-1100份混合而成。
5.如权利要求5所述的促生芽孢杆菌，其特征在于：所述亚历山大硅酸盐细菌培养基按重量份计算，主要由蔗糖5.0份、MgSO4·7H2O 0.5份、CaCO30.1份、磷酸氢二钠2.0份、FeCl3·6H2O0.005份、钾长石1.0份、琼脂18.0份和蒸馏水1000份混合而成。
前述的促生芽孢杆菌中，所述蒙金娜有机磷培养基按重量份计算，主要由葡萄糖5-15份、氯化钠0.1-0.6份、MgSO4﹒7H2O 0.1-0.6份、MnSO4﹒4H2O 0.01-0.06份、卵磷脂0.1-0.3份、蒸馏水900-1100份、(NH4)2SO40.1-1.0份、氯化钾0.1-0.6份、FeSO4﹒7H2O 0.01-0.06份、碳酸钙1-10份和琼脂15.0-18.0份混合而成。
前述的促生芽孢杆菌中，所述蒙金娜有机磷培养基按重量份计算，主要由葡萄糖10.0份、氯化钠0.3份、MgSO4﹒7H2O 0.3份、MnSO4﹒4H2O 0.03份、卵磷脂0.2份、蒸馏水1000份、(NH4)2SO40.5份、氯化钾0.3份、FeSO4﹒7H2O 0.03份、碳酸钙5.0份和琼脂16.5份混合而成。
前述的促生芽孢杆菌中，所述磷酸三钙无机磷培养基按重量份计算，主要由葡萄糖5-15份、氯化钠0.1-0.6份、MgSO4﹒7H2O 0.1-0.6份、MnSO4﹒4H2O 0.01-0.06份、琼脂15.0-18.0份、蒸馏水900-1100份、硫酸铵0.1-1.0份、氯化钾0.1-0.6份、FeSO4﹒7H2O 0.01-0.06份和Ca3(PO4)25-15份混合而成。
一种前述的促生芽孢杆菌的应用，所述促生芽孢杆菌用于种植太子参。
申请人进行了大量实验，以证明本发明具有有效的效果，部分实验如下；
实验例
1多功能微生物的分离筛选
以“S”型采样法从太子参种植基地太子参根际采取0～15cm层土壤，共取5个采样点，每个采样点各取黄泥土1kg，现场混合5个采样点土壤样品，采用四分法弃多余土样，所采集的土壤样品装于塑料袋中，贴好标签，常温运回实验室进行多功能微生物的分离。分别采用Ashby(阿须贝)培养基(KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaCO35.0g，甘露醇10.0g，CaSO4·2H2O 0.1g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，pH6.8～7.0)、亚历山大硅酸盐细菌培养基(蔗糖5.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO30.1g，磷酸氢二钠2.0g，FeCl3·6H2O 0.005g，钾长石1.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.5)、蒙金娜有机磷培养基(葡萄糖(C6H12O6﹒H2O)10.0g，氯化钠(NaCl)0.3g，硫酸镁(MgSO4﹒7H2O)0.3g，硫酸锰(MnSO4﹒4H2O)0.03g，卵磷脂0.2g，蒸馏水1000ml，硫酸铵[(NH4)2SO4]0.5g，氯化钾(KCl)0.3g，硫酸亚铁(FeSO4﹒7H2O)0.03g，碳酸钙(CaCO3)5.0g，琼脂15.0～18.0g，pH7.0～7.5)、磷酸三钙无机磷培养基(葡萄糖(C6H12O6﹒H2O)10.0g，氯化钠(NaCl)0.3g，硫酸镁(MgSO4﹒7H2O)0.3g，硫酸锰(MnSO4﹒4H2O)0.03g，琼脂15.0～18.0g，pH7.0～7.5，蒸馏水1000ml，硫酸铵[(NH4)2SO4]0.5g，氯化钾(KCl)0.3g，硫酸亚铁(FeSO4﹒7H2O)0.03g，磷酸三钙[Ca3(PO4)2]10.0g)进行自生固氮菌、解钾菌、溶有机磷和无机磷菌的分离。
1.1自生固氮菌的分离筛选
称取混合土壤样品10g，置于盛有190ml无菌水的三角瓶内，搅拌15min后静置10min。取上述上清液1ml依次进行10倍梯度稀释得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液，然后吸取0.1ml 10-3、10-4、10-5土壤稀释液涂布在Ashby(阿须贝)培养基平板(φ9cm)上，每个浓度涂布3皿，然后倒置于28℃的恒温培养箱内培养，不定期观察培养情况。待有菌落出现时，挑选重复皿内菌落转接入PDA斜面试管培养，4℃恒温保存待用。
1.2固氮兼解钾菌的分离筛选
将1.1获得的菌株PDA平板活化后，接入亚历山大硅酸盐细菌培养基平板进行解钾作用的测试，若平板生长良好，则保存备用。
1.3固氮、解钾兼溶磷菌的分离筛选
将1.2获得的菌株经PDA平板活化后，分别接入蒙金娜有机磷培养基平板和磷酸三钙无机磷培养基平板进行溶磷作用测试，若在菌落周围出现透明溶磷圈的则为待选菌株，保存备用。
1.4固氮、解钾、溶磷兼具抑菌作用的菌株分离筛选
将1.3获得的菌株经PDA平板活化后，以太子参根腐病菌Fusarium oxysporum和Verticillium albo-atrum为作用对象，在PDA平板上进行对峙培养，筛选兼有抑菌作用的多功能菌株。
1.5多功能菌株的鉴定
(1)形态特征观察
形态特征观察包括对菌落形态的观察和细菌个体形态的观察两方面，主要采用《常见细菌系统鉴定手册》中的实验方法进行。
①菌落形态的观察
将菌株于PDA平板上划线培养24h，对其菌落形态、菌落质地、菌落的颜色、菌落边缘及是否分泌可溶性色素等进行观察记录。
②个体形态的观察
革兰氏染色：采用菌龄为10-14h的菌种。涂片后先用结晶紫初染，再用碘液媒染，经95％乙醇脱色后再用番红复染，水洗，吸干。镜检菌体为紫色的是革兰氏阳性菌，菌体为红色的是革兰氏阴性菌。
芽孢染色：涂片后，先用孔雀绿染15min，经水冲洗，风干后用番红复染2min，水洗，吸干。镜检为芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。
菌体大小的测量：用显微测微尺对革兰氏染色涂片进行菌体大小的测量，每个菌株测量10个以上菌体的宽度和长度，平均值即为菌体一般大小。
(2)生理生化测试
生理生化测试按照《常见细菌系统鉴定手册》及《芽孢杆菌属》中的方法，对各菌株进行包括接触酶反应、好氧性试验、甲基红反应、V.P反应试验、硝酸盐还原试验、糖醇发酵试验、吲哚产生试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验、酪素水解试验、硫化氢产生试验及耐盐性试验等生理生化特征的鉴定。
(3)16S rDNA序列分析
用细菌基因组提取试剂盒进行细菌基因组DNA提取，作为PCR反应的模板。引物用16SrDNA全长扩增通用引物。PCR扩增反应体系30μL：PCR预混料15μL、模板DNA 1μL、引物各0.5μL、双蒸水13μL。PCR反应条件：95℃3min；95℃50s，52℃50s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。用PCR胶回收试剂盒回收PCR产物，经1.5％的凝胶电泳检测后，与克隆载体pGM-T在T4连接酶作用下于16℃过夜连接，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。引物及阳性克隆菌测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。利用Blast将菌株的16S rDNA的序列与GenBank数据库中已知的序列进行比较，分析其同源性。
2多功能菌株用于太子参种植试验
2.1多功能菌株菌悬液的制备
用PDA平板培养已活化的多功能菌株，28℃培养4d后于平板中添加无菌水刮取菌落转入灭菌烧杯中，置于磁力搅拌器上运行30min(300rpm)获得菌悬液，用无菌水调节其浓度达108cfu/ml。
2.2多功能菌株菌悬液的浸种(太子参块根)处理
用塑料容器盛装菌悬液，放入室温储存的太子参块根，块根的放入量以菌悬液刚好没过块根为止，室温下浸泡5min，取出置于筛网上控干水份、阴干备用种植。
2.3浸种块根的种植及产量测定
块根的种植模式―小区面积为(70cm×8m)(宽×长)，垄高20-25cm，厢距30cm，株距4cm。用浸种块根种植，出苗后每个月浇施一次菌悬液(浓度达108cfu/ml)，直到收获；同时设置化学肥料追肥处理和不施肥处理对照(用未经任何处理的块根种植)，其使用时间及次数同菌悬液浇施一致。化学肥料施用量为：300kg/hm2复合肥(贵州西洋肥业有限公司，总养分≥45％，氮：磷：钾＝13：17：15)、750kg/hm2磷肥(钙镁磷，江西江磷磷肥有限公司，养分含量≥12％)、150kg/hm2钾肥(硫酸钾，江苏邳州苏北肥料有限公司，氧化钾≥50％)]；不施肥处理只进行浇水。每个处理3个重复。收获块根后，每个小区随机选取1m2进行测产，折算出产量。同时调查块根发病率及其严重度，严重度分为0、1、2、3、4级，共5级，0级，无病斑；1级，感病面积不高于整个参面积的10％；2级，感病面积占整个参面积的11％-30％；3级，感病面积占整个参面积的31％-50％；4级，感病面积占整个参面积的50％以上，根据发病率和严重度，计算病情指数。
2.4多功能菌株处理对太子参品质的影响
取试验2.3测产后的各处理块根进行多糖和皂苷含量的测定。将各处理块根样品晒干，粉碎，过40目筛，分别制成检测样品。用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量；采用超声法提取太子参的总皂苷，并用5％香草醛-冰醋酸-高氯酸法测定块根中的皂苷含量。
2.5多功能菌株的分离筛选结果
从太子参根际土壤中依次通过Ashby(阿须贝)培养基、亚历山大硅酸盐细菌培养基、磷酸三钙无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基分离筛选微生物菌株数量，见表1。
表1太子参根际不同功能微生物的分离数量结果
对经过3类培养基分离筛选获得的6个功能菌株，在PDA培养基上与太子参根腐病菌Fusarium oxysporum和Verticillium albo-atrum进行对峙培养，获得的菌株KTS-1-1对两种病原菌均有抑制作用(图2)。
2.6多功能菌株KTS-1-1的鉴定结果
2.6.1个体及及菌落形态观察结果
菌株KTS-1-1的菌体形态为杆状，大小为1.2×2.8μm，链生或单生，革兰氏染色阳性，芽孢中生或亚端生，有荚膜。在营养琼脂培养基平板上菌落扁平、白色圆形、边缘整齐、无可溶性色素分泌(图1)。
2.6.2生理生化性状测定结果
菌株KTS-1-1为严格好氧菌，甲基红试验、V.P.试验、淀粉水解、七叶苷水解、尿素水解、明胶液化试验、过氧化氢酶、色氨酸脱氨酶、氧化酶、硝酸盐还原酶试验为阳性，产氨试验、吲哚产生试验、3-酮基乳糖试验、H2S产生试验、苯丙氨酸脱氨酶试验为阴性；能利用蔗糖、果糖作为唯一碳源和能源，不能利用丙二酸盐、卫矛醇、枸橼酸盐、甘露醇、鼠李糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、血清菊糖、糊精、木糖和山梨醇。能发酵葡萄糖产酸，根据菌株KTS-1-1的形态特征和生理生化特征，并参照《常见细菌系统鉴定手册》及《芽孢杆菌属》，可以确定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(表2)。
表2菌株KTS-1-1生理生化性状测定结果
2.6.3 16S rDNA测序结果
以细菌基因组为模板，经过PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测出现大约1500bp条带。通过阳性克隆菌质粒的目标区域测序，16S rDNA片段大小为1311bp，16SrDNA序列如SEQUENCE LISTING所示。序列分析结果显示与已知菌株芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens SSH100-12(KU321523)，Bacillus subtilis CSL2(KX281166)、Bacillus velezensis JS650(KX129854)、Bacillus sp.S204(KX033842)等菌株的亲缘关系最为接近，同源性均达到99％。结合菌株个体形态、菌落形态以及生理生化及分子鉴定的结果，确定菌株KTS-1-1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
2.7多功能菌株KTS-1-1处理的太子参发病率及产量
7月份收获太子参，测定各处理产量见下表3。
表3不同处理下太子参病情指数及产量
从表3可以看出，多功能菌株KTS-1-1处理的太子参产量与其它两种处理相比，产量明显增加；太子参根腐病发病率的调查结果表明，多功能菌株KTS-1-1处理的太子参块根发病程度明显低于其它两种处理。由此可看出多功能菌株可用于太子参的种植。
2.8多功能菌株KTS-1-1处理太子参多糖及皂苷含量测定结果
收获太子参后，晾干及粉碎太子参后测定块根多糖及总皂苷含量见表4。由表4可看出，与浇施化学肥料相比，多功能菌株KTS-1-1处理对太子参块根多糖影响不大，但对皂苷含量有明显影响，其施用能明显增加太子参块根皂苷的含量。由此可得多功能菌株KTS-1-1施用对太子参块根皂苷含量有促进作用，因此可以提高块根的药用价值，适合用于太子参种植。
表4不同处理下太子参块根多糖和皂苷含量
附图说明
图1是菌株KTS-1-1在营养琼脂平板上的形态特征；
图2是KTS-1-1对病原菌Fusarium oxysporum(A)和Verticillium albo-atrum(B)的抑制作用图；A为芽孢杆菌与尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的对峙试验结果图；B为芽孢杆菌与黑白轮枝菌Verticillium albo-atrum的对峙试验结果图。
下面结合实施例对发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
具体实施方式：
实施例1.
一种促生芽孢杆菌，所述芽孢杆菌这样分离培养获得：具体包括以下步骤：
(1)自生固氮菌的分离筛选：称取黄泥土，加入19倍量的无菌水，搅拌15min后静置10min；取上述上清液，依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液，然后吸取10-3、10-4、10-5土壤稀释液分别涂布在直径为9cm的Ashby培养基平板上，每个浓度涂布3皿，然后倒置于28℃的恒温培养箱内培养，待有菌落出现时，挑选重复皿内菌落转接入PDA斜面试管中，于25-30℃下培养4d后，备用；
(2)固氮兼解钾菌的分离筛选：将上述保存的菌落接入亚历山大硅酸盐细菌培养基平板进行解钾作用的测试，直至平板生长良好，菌落保存，备用；
(3)将步骤(2)中的菌落分别接入蒙金娜有机磷培养基平板和磷酸三钙无机磷培养基平板进行溶磷作用测试，取菌落周围出现透明溶磷圈的菌株，保存备用；
(4)固氮、解钾、溶磷兼具抑菌作用的菌株分离筛选：以太子参根腐病菌Fusariumoxysporum和Verticillium albo-atrum为作用对象，在步骤(3)所得的菌株上进行培养，筛选兼有抑菌作用的多功能菌株，即得。
所述Ashby培养基主要由KH2PO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.2g，CaCO35.0g、甘露醇10.0g、CaSO4·2H2O 0.1g、琼脂18.0g和蒸馏水1000g混合而成；
所述亚历山大硅酸盐细菌培养基主要由蔗糖5.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCO30.1g、磷酸氢二钠2.0g、FeCl3·6H2O 0.005g、钾长石1.0g、琼脂18.0g和蒸馏水1000g混合而成；
所述蒙金娜有机磷培养基主要由葡萄糖10.0g、氯化钠0.3g、MgSO4﹒7H2O 0.3g、MnSO4﹒4H2O 0.03g、卵磷脂0.2g、蒸馏水1000g、(NH4)2SO40.5g、氯化钾0.3g、FeSO4﹒7H2O0.03g、碳酸钙5.0g和琼脂16.5g混合而成；
所述磷酸三钙无机磷培养基主要由葡萄糖10.0g、氯化钠0.3g、MgSO4﹒7H2O 0.3g、MnSO4﹒4H2O 0.03g、琼脂15.0-18.0g、蒸馏水1000g、硫酸铵0.5g、氯化钾0.3g、FeSO4﹒7H2O0.03g和Ca3(PO4)210.0g混合而成。
实施例2.
一种促生芽孢杆菌，所述芽孢杆菌这样分离培养获得：具体包括以下步骤：
(1)自生固氮菌的分离筛选：称取混合土壤样品，加入19倍量的无菌水，搅拌15min后静置10min；取上述上清液依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液，然后吸取10-3、10-4、10-5土壤稀释液分别涂布在直径为9cm的Ashby培养基平板上，每个浓度涂布3皿，然后倒置于28℃的恒温培养箱内培养，待有菌落出现时，挑选重复皿内菌落转接入PDA斜面试管培养，4℃恒温保存，备用；
(2)固氮兼解钾菌的分离筛选：将上述保存的菌落接入亚历山大硅酸盐细菌培养基平板进行解钾作用的测试，直至平板生长良好，菌落保存，备用；
(3)将步骤(2)中的菌落分别接入蒙金娜有机磷培养基平板和磷酸三钙无机磷培养基平板进行溶磷作用测试，取菌落周围出现透明溶磷圈的菌株，保存备用；
(4)固氮、解钾、溶磷兼具抑菌作用的菌株分离筛选：以太子参根腐病菌Fusariumoxysporum和Verticillium albo-atrum为作用对象，在步骤(3)所得的菌株上进行培养，筛选兼有抑菌作用的多功能菌株，即得。
所述Ashby培养基主要由KH2PO40.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、NaCl 0.3g，CaCO37g、甘露醇15g、CaSO4·2H2O 0.15g、琼脂28g和蒸馏水1100g混合而成。
所述亚历山大硅酸盐细菌培养基主要由蔗糖10g、MgSO4·7H2O 1.0g、CaCO300.15g、磷酸氢二钠4g、FeCl3·6H2O 0.010g、钾长石1.5g、琼脂28g和蒸馏水1100g混合而成。
所述蒙金娜有机磷培养基主要由葡萄糖15g、氯化钠0.6g、MgSO4﹒7H2O 0.6g、MnSO4﹒4H2O 0.06g、卵磷脂0.3g、蒸馏水1100g、(NH4)2SO41.0g、氯化钾0.6g、FeSO4﹒7H2O0.06g、碳酸钙10g和琼脂18.0g混合而成。
所述磷酸三钙无机磷培养基主要由葡萄糖15g、氯化钠0.6g、MgSO4﹒7H2O 0.6g、MnSO4﹒4H2O 0.06g、琼脂18.0g、蒸馏水1100g、硫酸铵1.0g、氯化钾0.6g、FeSO4﹒7H2O 0.06g和Ca3(PO4)215g混合而成。
实施例3.
一种促生芽孢杆菌，所述芽孢杆菌这样分离培养获得：具体包括以下步骤：
(1)自生固氮菌的分离筛选：称取混合土壤样品，加入19倍量的无菌水，搅拌15min后静置10min；取上述上清液，依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液，然后吸取10-3、10-4、10-5土壤稀释液分别涂布在直径为9cm的Ashby培养基平板上，每个浓度涂布3皿，然后倒置于28℃的恒温培养箱内培养，待有菌落出现时，挑选重复皿内菌落转接入PDA斜面试管培养，4℃恒温保存，备用；
(2)固氮兼解钾菌的分离筛选：将上述保存的菌落接入亚历山大硅酸盐细菌培养基平板进行解钾作用的测试，直至平板生长良好，菌落保存，备用；
(3)将步骤(2)中的菌落分别接入蒙金娜有机磷培养基平板和磷酸三钙无机磷培养基平板进行溶磷作用测试，取菌落周围出现透明溶磷圈的菌株，保存备用；
(4)固氮、解钾、溶磷兼具抑菌作用的菌株分离筛选：以太子参根腐病菌Fusariumoxysporum和Verticillium albo-atrum为作用对象，在步骤(3)所得的菌株上进行培养，筛选兼有抑菌作用的多功能菌株，即得。
所述Ashby培养基主要由KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaCl 0.1g，CaCO33g、甘露醇5g、CaSO4·2H2O 0.05g、琼脂8g和蒸馏水900g混合而成。
所述亚历山大硅酸盐细菌培养基主要由蔗糖1g、MgSO4·7H2O 0.1g、CaCO30.05g、磷酸氢二钠1g、FeCl3·6H2O 0.0025g、钾长石0.5g、琼脂8g和蒸馏水900g混合而成。
所述蒙金娜有机磷培养基主要由葡萄糖5g、氯化钠0.1g、MgSO4﹒7H2O 0.1g、MnSO4﹒4H2O 0.01g、卵磷脂0.1g、蒸馏水900g、(NH4)2SO40.1g、氯化钾0.1g、FeSO4﹒7H2O 0.01g、碳酸钙1g和琼脂15.0g混合而成。
所述磷酸三钙无机磷培养基主要由葡萄糖5g、氯化钠0.1g、MgSO4﹒7H2O 0.1g、MnSO4﹒4H2O 0.01g、琼脂15.0g、蒸馏水900g、硫酸铵0.1g、氯化钾0.1g、FeSO4﹒7H2O 0.01g和Ca3(PO4)25g混合而成。

Claims (10)

1.一种促生芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌这样分离培养获得：取土壤，采用Ashby培养基、亚历山大硅酸盐细菌培养基、蒙金娜有机磷培养基和磷酸三钙无机磷培养基，进行自生固氮菌、解钾菌、溶有机磷和无机磷菌的分离，即得促生芽孢杆菌。
2.如权利要求1所述的促生芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌的分离培养具体包括以下步骤：
(1)自生固氮菌的分离筛选：称取黄泥土，加入19倍量的无菌水，搅拌15min后静置10min；取上述上清液，依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液，然后吸取10-3、10-4、10-5土壤稀释液分别涂布在直径为9cm的Ashby培养基平板上，每个浓度涂布3皿，然后倒置于28℃的恒温培养箱内培养，待有菌落出现时，挑选重复皿内菌落转接入PDA斜面试管中，于25-30℃下培养3-5d后，备用；
(2)固氮兼解钾菌的分离筛选：将上述保存的菌落接入亚历山大硅酸盐细菌培养基平板进行解钾作用的测试，直至平板生长良好，菌落保存，备用；
(3)将步骤(2)中的菌落分别接入蒙金娜有机磷培养基平板和磷酸三钙无机磷培养基平板进行溶磷作用测试，取菌落周围出现透明溶磷圈的菌株，保存备用；
(4)固氮、解钾、溶磷兼具抑菌作用的菌株分离筛选：以太子参根腐病菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和黑白轮枝菌Verticillium albo-atrum为作用对象，在步骤(3)所得的菌株基础上进行平板对峙培养，筛选兼有抑菌作用的多功能菌株，即得。
3.如权利要求2所述的促生芽孢杆菌，其特征在于：所述Ashby培养基按重量份计算，主要由KH2PO40.1-0.3份、MgSO4·7H2O 0.1-0.3份、NaCl 0.1-0.3份，CaCO33-7份、甘露醇5-15份、CaSO4·2H2O 0.05-0.15份、琼脂8-28份和蒸馏水900-1100份混合而成。
4.如权利要求3所述的促生芽孢杆菌，其特征在于：所述Ashby培养基按重量份计算，主要由KH2PO40.2份、MgSO4·7H2O 0.2份、NaCl 0.2份，CaCO35.0份、甘露醇10.0份、CaSO4·2H2O0.1份、琼脂18.0份和蒸馏水1000份混合而成。
5.如权利要求2所述的促生芽孢杆菌，其特征在于：所述亚历山大硅酸盐细菌培养基按重量份计算，主要由蔗糖1-10份、MgSO4·7H2O 0.1-1.0份、CaCO30.05-0.15份、磷酸氢二钠1-4份、FeCl3·6H2O 0.0025-0.010份、钾长石0.5-1.5份、琼脂8-28份和蒸馏水900-1100份混合而成。
6.如权利要求5所述的促生芽孢杆菌，其特征在于：所述亚历山大硅酸盐细菌培养基按重量份计算，主要由蔗糖5.0份、MgSO4·7H2O 0.5份、CaCO30.1份、磷酸氢二钠2.0份、FeCl3·6H2O0.005份、钾长石1.0份、琼脂18.0份和蒸馏水1000份混合而成。
7.如权利要求2所述的促生芽孢杆菌，其特征在于：所述蒙金娜有机磷培养基按重量份计算，主要由葡萄糖5-15份、氯化钠0.1-0.6份、MgSO4﹒7H2O 0.1-0.6份、MnSO4﹒4H2O 0.01-0.06份、卵磷脂0.1-0.3份、蒸馏水900-1100份、(NH4)2SO40.1-1.0份、氯化钾0.1-0.6份、FeSO4﹒7H2O 0.01-0.06份、碳酸钙1-10份和琼脂15.0-18.0份混合而成。
8.如权利要求7所述的促生芽孢杆菌，其特征在于：所述蒙金娜有机磷培养基按重量份计算，主要由葡萄糖10.0份、氯化钠0.3份、MgSO4﹒7H2O 0.3份、MnSO4﹒4H2O 0.03份、卵磷脂0.2份、蒸馏水1000份、(NH4)2SO40.5份、氯化钾0.3份、FeSO4﹒7H2O 0.03份、碳酸钙5.0份和琼脂16.5份混合而成。
9.如权利要求2所述的促生芽孢杆菌，其特征在于：所述磷酸三钙无机磷培养基按重量份计算，主要由葡萄糖5-15份、氯化钠0.1-0.6份、MgSO4﹒7H2O 0.1-0.6份、MnSO4﹒4H2O0.01-0.06份、琼脂15.0-18.0份、蒸馏水900-1100份、硫酸铵0.1-1.0份、氯化钾0.1-0.6份、FeSO4﹒7H2O 0.01-0.06份和Ca3(PO4)25-15份混合而成。
10.一种如权利要求1-9中任一项所述的促生芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述促生芽孢杆菌用于种植太子参。
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