CN108660098B - 一株耐盐防病促生枯草芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株耐盐防病促生枯草芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用；HG‑15菌株具有较高的耐盐性，能够在盐碱土壤中稳定定殖；能够在液体水溶肥、固体水溶肥中存活并保持较高存活率，可以与有机肥、复合肥、水溶肥、控释肥等肥料混合使用；该菌株具有较广的抗菌谱，对引起小麦、玉米、蔬菜和果树等作物根腐类病害及其他土传病害具有较好的防治效果；能够显著提高土壤中有效磷、有效钾的含量，减少磷、钾化肥施用量；该菌株发酵性状优异，菌剂的制备工艺简单、成本低，利于工业化生产和运输。

Description

一株耐盐防病促生枯草芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用

技术领域

本发明提供了一株耐盐防病促生枯草芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用，属于农用微生物技术领域。

背景技术

土壤盐渍化给农林生产造成严重影响，是当今世界面临的四大生态环境问题之一，盐渍化土壤是重要的土地资源，世界盐渍化土壤面积达1.0×10⁹hm²，占陆地总面积30％左右。中国盐渍化土壤的比例远高于世界平均水平，约有盐渍化土壤1.7×10⁷hm²，近1/3的灌区土壤存在盐渍化问题。土壤盐渍化降低土壤微生物多样性，破坏土壤的结构、通气性，使植物不能正常吸收水、肥、气、热等条件，降低了农林生产力。

土壤盐渍化不仅降低土壤磷素、钾素有效性，还抑制作物对磷、钾的吸收和转运，从而导致植物产生缺磷、缺钾症状。

土壤盐渍化的治理措施主要有物理改良、化学改良、生物改良、综合措施等方式，物理改良方法有通过淋洗等方式合理灌溉、排水洗盐、深翻松耕、压沙、客土改良、添加吸附剂等方式；化学改良方式是通过施用有机或无机肥料、矿质化肥、亚硫酸钙、脱硫石膏等化学改良剂改良土壤理化性质；生物改良措施主要是种植耐盐作物、施加微生物肥料、生物有机肥来调理土壤理化性质，生物措施被普遍认为是最有效的改良途径，可以逐渐改变土壤的结构，增强土壤透气贮水能力，提高土壤微生物多样性，防止土壤返盐。

解磷菌、硅酸盐细菌通过自身分泌氨基酸、有机酸、荚膜多糖等代谢产物，可以破坏土壤矿物的晶格结构，释放有效磷、速效钾供作物吸收利用，促进作物发育。施用微生物肥料或菌剂可以有效减少化肥和农药使用量，同时具有改善果实品质、提高土壤肥力、改善土壤理化性质、减少病虫害及调节土壤微生物多样性等作用。

通过微生物对土壤微生物生态进行调控，是经济环保的盐碱土壤改良方式，随着生态农林业发展对环境友好型生物肥料的需求及人们环境保护意识的提高，微生物肥料的开发和研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株耐盐防病促生枯草芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用；可用于小麦、玉米、蔬菜、果树等作物盐碱环境下土传病害的防治，释放土壤矿物化磷、钾元素，调理土壤理化环境和促进作物生长。

发明人从黄河三角洲盐碱土壤小麦根际土壤中分离获得一株具有耐盐、拮抗、解磷、解钾功能的菌株；命名为枯草芽孢杆菌HG-15；该菌株已于2018年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏号为CGMCC NO.15773。分类命名：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)HG-15；该菌株的16S rDNA序列如SEQ.NO.1所示，gyrB序列如SEQ.NO.2所示，其rep-PCR基因指纹图谱如图3。

本发明还提供了一种利用枯草芽孢杆菌HG-15制备微生物菌剂的方法，步骤如下：

(1)菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌HG-15划线接种于LB固体培养基平板上，32℃培养24h-36h；挑取单菌落再次划线转接于LB固体培养基平板上，32℃培养24-30h。

固体LB培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，水1.0L。

(2)一级种子液制备：刮取两环步骤(1)活化好的HG-15菌株菌苔，接种于LB液体培养基中，32℃，180-220r/min，摇瓶培养14-18h，得到一级种子液。

所述一级种子液培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，水1.0L。

(3)二级种子液制备：将一级种子液按照1％-2％(体积比)的比例接种到装有二级种子培养基的发酵罐中发酵培养；转速160-180r/min，温度32℃，通气量为1:0.8-1:1.2，灌压0.04-0.06MPa，培养14-18h，得到二级种子液。

二级种子培养基组分：黄豆饼粉10.00g，玉米粉12.00g，葡萄糖4.50g，氯化钠0.45g，碳酸钙1.50g，硫酸镁0.20g，安琪酵母浸粉3.00g，硫酸锰0.20g，水1.00L。

(4)发酵液培养：将二级种子液按照10％(体积比)的比例接入装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养；转速140r/min，温度为32℃，通气为量1:0.8-1:1.2，灌压0.04-0.06MPa，培养时间为20h-30h，得到HG-15菌株液体菌剂。

发酵培养基组分：黄豆饼粉10.00g，玉米粉12.00g，葡萄糖4.50g，氯化钠0.45g，碳酸钙1.50g，硫酸镁0.20g，安琪酵母浸粉3.00g，硫酸锰0.20g，水1.00L。

(5)固体菌剂制备：将步骤(4)获得的HG-15菌株液体菌剂，6500～8500r/min离心20～30min，去除离心上清液，向沉淀物中缓慢加入硅藻土或玉米粉作为载体基质，加入硅藻土或玉米粉的量为HG-15菌株液体菌剂重量的5％～8％，搅拌均匀后喷雾干燥，通过雾化器(65℃左右)的分散和高温空气(180℃)迅速蒸干，料液中的固体物质经旋风分离器收集，得到HG-15菌株固体菌剂。

(6)菌剂的使用方法：将所述HG-15菌株液体菌剂按照1～2L/亩的用量，使用时与水按照1:200(体积比)混合均匀，灌根使用；固体菌剂的使用按照0.5～1.0kg/亩的用量，拌种或加适量水稀释后灌根施用；两种菌剂能够与有机肥、复合肥、水溶肥、控释肥等肥料复合为微生物水溶肥、微生物有机肥、复合微生物肥料等肥料。

利用枯草芽孢杆菌HG-15制备的HG-15微生物耐盐菌剂，具有较高的耐盐能力；HG-15菌株能够在大量元素含量≥500g/L的液体水溶肥和大量元素含量≥45％的固体水溶肥中保持较高存活率，具有较高的耐盐性。

利用枯草芽孢杆菌HG-15制备的HG-15微生物解钾菌剂，具有较高的解钾能力；HG-15菌株具有较高的解钾活力，根据农业部NY/882-2004关于硅酸盐细菌菌种技术指标要求，在含有钾长石的培养液中，速效钾增加量与未接种相比增加20％以上的标准，HG-15菌株培养液中速效钾含量相比对照增加98.71％，远超过微生物肥料生产中硅酸盐菌株要求。

利用枯草芽孢杆菌HG-15制备的HG-15微生物解磷菌剂，具有较高的解磷能力；HG-15菌株具有较高的解磷活力，根据农业部NY/T 1847-2010关于微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求，在含有难溶性无机磷培养液中，接种菌株与未接种相比，可溶性磷的含量增加70mg/L以上的标准，接种HG-15菌株的培养液中可溶性磷增加量达到83.52mg/L，远超过微生物肥料中解磷菌的标准。

本发明还涉及HG-15菌株在抑制引起小麦、玉米、蔬菜和果树等作物病害的禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、胶胞炭疽菌、链格孢菌、溃疡病中的应用，可以有效降低土壤中病原菌的数量，具有抑制病害发生和促进作物生长的双重作用。

所述HG-15微生物菌剂作为生物有机肥或复合微生物肥料菌种使用，能提高肥料利用率，减少土壤结构破坏、提高作物产量与品质，有效改良土壤理化环境，改善土壤的微生物群落结构；HG-15微生物菌剂对引起小麦、玉米、蔬菜和果树等作物病害的镰刀菌、立枯丝核菌、小麦根腐平脐蠕孢菌、胶胞炭疽病菌和链格孢菌等病原菌具有较强的抑制效果，能促进小麦、玉米、蔬菜、果树的生长；能够显著提高土壤有效磷、速效钾、有机质的含量；能够与有机肥、复合肥、水溶肥、控释肥等肥料混合使用，有效减少化肥与农药施用量。

本发明具有以下优点：

1、HG-15菌株解磷能力较强，达到国家农业部NY/T 1847-2010标准中对微生物肥料中解磷菌的菌种要求，在含有难溶性无机磷的培养液中，接种HG-15菌株与未接种菌株相比，培养液中可溶性磷的含量增加83.52mg/L。

2、HG-15菌株解钾能力较强，达到国家农业部NY/882-2004标准中对微生物肥料中硅酸盐细菌的菌种要求，在含有钾长石的培养液中，接种HG-15菌株与未接种菌株的对照相比，培养液中速效钾相对增加量达到98.71％。

3、HG-15菌株对引起小麦、玉米、蔬菜和果树等作物病害的镰刀菌、立枯丝核菌、小麦根腐平脐蠕孢菌、胶胞炭疽病菌和链格孢菌等病原菌具有较强的抑制效果。

4、HG-15菌株具有较高的耐盐性，能够在盐碱土壤中稳定定殖，利用HG-15菌株生产的微生物菌剂能够与有机肥、复合肥、水溶肥、控释肥等肥料混合使用，增加土壤中有效磷、有效钾含量，减少化肥施用量。

5、HG-15菌株发酵性状好，菌剂生产工艺简单、生产周期短、原料成本低，有利于工业化生产、运输。

附图说明

图1为根据HG-15菌株的16S rDNA序列，利用Mega 5.0构建的系统进化树。

由图1可以看出，HG-15菌株与已知菌株Bacillus subtilis(EU256502)的16SrDNA同源性达到99％，结合HG-15菌株的菌体形态、菌落特征及生理生化指标测定结果，鉴定HG-15菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)。

图2为根据HG-15菌株的gyrB序列，利用Mega 5.0构建的系统进化树。

由图2可以看出，HG-15菌株与已知菌株Bacillus subtilis(CP014858)的gyrB同源性达到99％，结合HG-15菌株的菌体形态、菌落特征及生理生化指标测定结果，鉴定HG-15菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

图3为HG-15菌株基因组DNA通过重复片段PCR(Repetitive-element PCR)构建的菌株基因指纹图谱，通过电泳条带对比分析，找到HG-15菌株重复序列单元的数量和在染色体分布上的特征，这些重复序列分布在基因组上的不同位点，并以不同的距离分隔，存在种属水平和同种不同株间的差异，经过多次重复试验，电泳图谱完全一致。rep-PCR条带具有菌株种间特异性，因此可在专利菌株HG-15维权中菌株的的识别、鉴定方面提供遗传依据。

图3a为HG-15菌株基因组采用ERIC1R引物(如SEQ.NO.3所示)和ERIC₂引物(如SEQ.NO.4所示)的rep-PCR产物在1.5％浓度琼脂糖凝胶电泳中的基因指纹图谱。

图3b为HG-15菌株与实验室保藏的其他8株枯草芽孢杆菌的基因组采用BOX-AIR引物(如SEQ.NO.5所示)的rep-PCR产物在1％浓度琼脂糖凝胶电泳中基因指纹图谱。

图4中：

图4a为HG-15菌株的蛋白酶水解圈；

图4a表明HG-15菌株能够产生蛋白水解酶。

图4b为HG-15菌株的纤维素刚果红水解透明圈；

图4b表明HG-15菌株能够产生纤维素酶。

图4c为HG-15菌株的无机磷水解圈；

图4c表明HG-15菌株能够分解矿物化无机磷为有效磷。

图4d为HG-15菌株的钾长石水解圈；

图4d表明HG-15菌株能够分解钾长石为有效钾。

图5中：

图5a为HG-15菌株解无机磷活力测定标准曲线，线性回归方程为y＝0.0508x-0.002，决定系数R²＝0.9997，P＜0.0001；

图5a说明，磷浓度与吸光度呈线性关系，模型极显著，符合测定HG-15菌株解无机磷活力测定要求。

图5b为HG-15菌株解钾活力测定标准曲线，线性回归方程为y＝0.0016x-0.0004，决定系数R²＝0.9994，P＜0.0001；

图5b说明，钾离子浓度与吸光度呈线性关系，模型极显著，符合HG-15菌株解钾活力测定要求。

图5c为HG-15菌株种子液生长曲线；

图5c说明，HG-15菌株种子液最适发酵时间为9h。

图6为HG-15菌株的抑菌谱；

图6说明，HG-15菌株能够有效抑制假禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、胶胞炭疽菌、禾谷镰刀菌、杨树溃疡病菌、链格孢病菌等植物病原真菌。

具体实施方式：

实施例1

HG-15菌株的分离

本研究分别从黄河三角洲地区的农田、湖边、盐碱地、石油区取得土样，将土样样本分为4组，每组取10g土壤置于装有50mL无菌水的250mL三角瓶中，加入玻璃珠充分打散，于32℃、120r/min的摇床中充分振荡30min，按照稀释涂布方法，分别稀释10^-1、10^-2、10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7梯度，每个梯度三次重复，分别涂布到PDA培养基、解无机磷培养基、解钾培养基、刚果红培养基、脱脂乳培养基中，32℃恒温培养2-5d。挑取单菌落，划线成纯培养物，保存。

PDA培养基组分为：马铃薯200.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，(NH₄)₂SO₄1.0g，MgSO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 0.6g，CaCO₃ 3.0g，pH 6.8-7.2，水1L。

解无机磷固体培养基：葡萄糖10.00g，(NH₄)₂SO₄ 0.50g，NaCl 0.30g，KCl 0.30g，MgSO₄·7H₂O 0.30g，FeSO₄ 0.03g，MnSO₄ 1.00g，Ca₃(PO₄)₂ 5.00g，去离子水1.00L，琼脂15.00g。

解钾固体培养基：蔗糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，MgSO₄ 0.5g，酵母膏0.5g，Na₂HPO₄2.0g，CaCO₃ 1.0g，钾长石粉1.0g，去离子水1.0L，琼脂15.0g。

脱脂乳筛选培养基：K₂HPO₄ 1.0g，KCl 5.0g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，琼脂20.0g，水1.0L，琼脂15.0g。

刚果红培养基：K₂HPO₄ 0.50g，微晶纤维素1.88g，MgSO₄ 0.25g，明胶2.00g，刚果红0.20g，Agar 15.00g，水1.00L。

将上述获得的若干株纯培养物进行平板对峙试验，用接种环挑取一环纯化的菌落，点在距PDA平板中央两端3cm处，以假禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、胶胞炭疽菌、禾谷镰刀菌、杨树溃疡病菌、链格孢病菌为靶标病原菌，用打孔器切下直径为5mm的菌盘接种于PDA平板中央，28℃培养48h，测量抑菌带宽度，筛选获得抗菌谱广，抗菌效果强的拮抗细菌；将上述获得的若干株纯培养物进行解无机磷试验，测量无机磷水解圈的大小，参照国家农业部颁布的NY/T 1847-2010标准测定菌株解磷活性，筛选获得微生物肥料中解磷菌生产要求的菌株；将上述获得的若干株纯培养物进行解钾试验，测量钾长石水解圈的大小，参照国家农业部颁布的NY/882-2004标准测定菌株解钾活性，筛选获得达到微生物肥料中硅酸盐细菌生产要求的菌株。经过试验筛得抗菌谱广、解磷和解钾活力高的HG-15菌株。

实施例2

HG-15菌株的鉴定

(1)菌体形态与菌落特征

HG-15菌株在PDA平板上的菌落呈微黄色，表面粗糙不透明，边缘不整齐，随培养时间延长，菌落表面形成微小皱褶，显微镜下观察的菌体形态呈杆状。HG-15菌株为革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央位置，芽孢形成后菌体不膨大。

(2)生理生化特征

HG-15菌株的生理生化特征见表1。该菌株需氧性为兼性厌氧，革兰氏反应、葡萄糖氧化发酵试验、接触酶，淀粉水解试验、V-P试验、耐盐性试验、苯丙氨基酸脱氨酶试验和柠檬酸盐利用等反应呈阳性；甲基红试验、硝酸盐还原呈阴性；可在NaCl浓度为5％和10％的液体LB液体培养基中生长。

LB液体培养基组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g,水1L。

表1HG-15菌株的生理生化

注：+为阳性；－为阴性。Note:+positive；－negative.

(3)菌株16S rDNA序列分析

HG-15菌株的16S rDNA序列如下：

GCCATGGGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGTGACAGAGG

将此序列与Genbank数据库中序列进行Blast分析比对，发现与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属，选取6株与HG-15菌株序列相似性较高的菌株进行系统发育分析，利用Mega5.0软件，采取Neighbor-Joining法构建以16S rDNA全序列为基础的系统进化树(附图1)。HG-15菌株的16S rDNA序列同公开发表的Bacillus subtilis(EU256502)的16SrDNA的同源性达到100％，结合其菌体形态、菌落特征和生理生化特征，鉴定HG-15菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)。

(4)HG-15菌株gyrB序列分析

HG-15菌株的gyrB序列如下：

TCGGTTGATGTATCTGCTGCGGATACGGGCTTTCTCAGGTTGAAGTCTTCCCCAATACCTGTGCCGAGCGCTGTGATCATAGAGCGAACTTCGTTGTTAGAAAGGATTTTATCCAGTCTGGCCTTTTCAACGTTTAGGATTTTACCTCTAAGCGGCAAAATGGCTTGGAAATGTCTGTCGCGTCCTTGTTTAGCAGATCCTCCGGCAGAGTCACCCTCTACGATATATAACTCGGAGATGCTCGGATCTTTTGAAGAGCAGTCCGCTAACTTACCGGGCAGGTTTGAAATTTCCAAAGCACTCTTACGACGTGTTAGTTCACGGGCTTTTTTCGCAGCCATTCTTGCTCTTGCCGCCATTAAGCCTTTATCGACAATTTTTTTGGCTGCATCTGGATTTTCCAGCATAAATGTTTCCATCGCCGTAGAAAATAACGTATCGGTGATCGTCCGTGCTTCTGAGTTGCCCAGCTTTGTTTTCGTTTGGCCCTCAAACTGCGGATCAGGGTGTTTGATTGAAATAATCGCTGTCAGCCCTTCCCTTACGTCATCTCCGCTTAGGTTTGGATCATTTTCTTTAATAAGCCCTTTTTTTCTGGCGTAATCGTTGATAACACGAGTCAGGCCCGTTTTGAAGCCAGCTTCATGGGTACCGCCTTCGTACGTGTTAATGTTGTTTGTAAACGAGTAAATGTTGCTTGTGTAGCTGTCATTGTATTGCAAAGCCACTTCAACCGTAATGCCGTCCTTTTCGCCTTCAATGTAAATCGGCTCTTCATGGACAACCTCTTTAGAGCGGTTTAAATACTCTACATAACTTTTAATTCCGCCTTCGTAATGGTATTCATTTTTGCGCTCTTGTCCTTCACGTTTATCCTCAATCGTGATGTTTACGCCCTTTGTTAAAAAGGCTAATTCACGTACGCGGTTGGCAAGCAGATCATAATCATACTCGGTTGTTTCTGAGAAAATTTCAGGGTCCGGGACAAAATGTGTCGTCGTTCCTGTATGATCCGTTTCGCCAATGATTTCAAGGTCTGTAACCGGAACTCCGCGTTTATAAGTTTGGCGGTGAATTTTACCGTCACGGTGAACCGTCACATCAAGCTCTGTTGATAGTGCGTTTACGACAGACGCACCTACACCGTGTAATCCTCCGGATACTATAGCCGCTCCCGTG

将此序列与Genbank数据库中序列进行Blast分析比对，发现与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属，选取7株与HG-15菌株序列相似性较高的菌株进行系统发育分析，利用Mega5.0软件，采取Neighbor-Joining法构建以gyrB全序列为基础的系统进化树(附图2)。HG-15菌株的gyrB序列同公开发表的Bacillus subtilis(CP014858)的16S rDNA的同源性达到100％，结合其菌体形态、菌落特征和生理生化特征，鉴定HG-15菌株为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HG-15。

实施例3

HG-15菌株rep-PCR基因指纹图谱。

1、HG-15菌株基因组DNA提取

采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒DP302

(1)取细菌培养液1mL，10000rpm离心1min，尽量吸净上清液；

(2)向菌体沉淀中加入110μL TE缓冲液和70μL溶菌酶，37℃处理30min以上；

(3)向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀；

(4)加入200μL缓冲液GB震荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心10-15sec以去除管盖内壁的水珠；

(5)加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心10-15sec以去除管盖内壁的水珠；

(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(9)重复操作步骤8)；

(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟至彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱液TE，室温放置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。离心管所收集的溶液即为HG-15菌株基因组DNA。

2、Rep-PCR

本发明通过BOX、ERIC两种引物对HG-15菌株基因组DNA进行rep-PCR。HG-15菌株rep-PCR引物序列见表2。

表2HG-15菌株rep-PCR引物序列

BOX-AIR引物扩增体系(50μL)为：10×Taq PCR master mix 25μL，模板1μL，BOX-AIR2μL，用ddH₂O补齐至50μL。rep-PCR反应条件如下：95℃7min；94℃1min，53℃1min，65℃8min，35个循环；65℃16min；4℃Pause。

ERIC1R、ERIC₂引物扩增体系(50μL)为：10×Taq PCR master mix 25μL，模板1μL，ERIC1R引物1μL，ERIC₂引物1μL，用ddH₂O补齐至50mL。反应条件如下：95℃7min；94℃1min，53℃1min，65℃8min，35个循环；65℃16min；4℃Pause。

3、HG-15菌株基因指纹图谱

HG-15菌株rep-PCR产物进行1％、1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电解液为1×TAE，选取Trans8KDNA Marker、NormalRunTM 250bp-IV DNA ladder作为Marker，电压105-120V，恒压电泳30-40min。

采用ERIC1R引物和ERIC₂引物的rep-PCR产物在1.5％浓度琼脂糖凝胶电泳中的基因指纹图谱见附图3a。

采用BOX-AIR引物对HG-15菌株与实验室保藏的其他8株枯草芽孢杆菌的基因组DNA进行rep-PCR，其产物在1％浓度琼脂糖凝胶电泳中基因指纹图谱见附图3b。

重复片段PCR(Repetitive-element PCR)构建的菌株基因指纹图谱，通过电泳条带对比分析，找到HG-15菌株重复序列单元的数量和在染色体分布上的特征，这些重复序列存在种属水平和同种不同株间的差异，经过多次重复试验，电泳图谱完全一致。本发明涉及的HG-15菌株为发明人分离获得，为更好的保护HG-15菌株，发明人将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15773。对HG-15菌株16SrDNA、gyrB序列进行比对鉴定，对BOX、ERIC两种引物扩增后基因指纹图谱表现出的特征条带进行反复验证，HG-15菌株与其他枯草芽孢杆菌在条带大小及数量上存在明显差异，不同引物下HG-15菌株的条带信息具有特异性。HG-15菌株的16S rDNA、gyrB基因鉴定和基因指纹图谱信息，对专利菌株枯草芽孢杆菌HG-15维权中的菌株识别、鉴定提供依据。

实施例4

1、HG-15菌株的耐盐性试验

(1)菌种活化

将低温保存的枯草芽孢杆菌HG-15划线或涂布接种于LB固体培养基平板上，32℃培养24h-36h；挑取单菌落再次划线转接于LB固体培养基平板上，32℃活化培养16h-30h，得到HG-15菌株菌苔，备用。

LB固体培养基组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g,琼脂15g，去离子水1L。

(2)种子液制备

用接种环刮取两环步骤(1)活化后HG-15菌株菌苔，接种于LB液体培养基中，32℃，200r/min，摇瓶培养16h得到种子液。

LB液体培养基组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g,水1L。

(3)菌株的耐盐性试验

制备NaCl浓度50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L的LB液体培养基，每个浓度设置三个重复，吸取步骤(2)种子液1mL接入不同盐浓度LB培养基中，32℃，200r/min，摇瓶培养48h，测定其生长状况。菌株HG-15可以在50-150g/L盐浓度中生长最好，在200-250g/L盐浓度中生长一般，在300-350g/L盐浓度下依然能够正常存活，表明HG-15菌株具有较高的耐盐性，试验结果如表3。

表3HG-15菌株在不同NaCI浓度中生长状况

注：+，可以生长；++，生长良好；+++，生长旺盛。

2、pH对菌株HG-15生长的影响

制备pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的LB液体培养基。接种等量的HG-15菌株种子液，200r/min，32℃振荡培养24h，测定不同pH培养基OD₆₀₀值。菌株HG-15生长的最适pH在6.0-9.0之间，在pH为6.0-10.0的环境中生长良好，在碱性环境中生长状况好于酸性环境。结果如表4。

表4pH对HG-15菌株生长状况的影响

LB液体培养基组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g,水1L。

3、HG-15菌株在水溶肥中的存活率试验

(1)HG-15菌株在液体水溶肥中的存活率

试验选用山东农大肥业科技有限公司液体水溶肥(超速硝钾-含腐殖酸水溶肥料)产品，该产品主要成分为：大量元素≥400g/L，总氮≥360g，钾≥45g/L，腐殖酸≥30g/L，硝态氮≥90g/L，铵态氮≥90g/L，酰胺态氮≥180g/L。

将HG-15菌株发酵液(芽孢率95％以上)以10％(体积比)加入液体水溶肥中，混合均匀，密封储存于阴凉处，每隔30d测定一次水溶肥中的活菌数，连续测定330d。结果显示，液体水溶肥中菌体数量降幅较小，总体水平较高，菌体损失率较低，经过为期330d的试验，菌株存活率为82.63％，计数结果见表5。

HG-15菌株发酵液组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，水1.0L。

HG-15菌株计数培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，水1.0L。

表5HG-15菌株加入到液体水溶肥中菌株存活数量

(2)HG-15菌株在固体水溶肥中的存活率

试验选用山东农大肥业科技有限公司固体水溶肥(硝铵黄钾-含腐殖酸水溶肥料)产品，该产品主要成分为：N-P₂O₅-K₂O＝17-5-23，大量元素≥45％，硝态氮≥9％，黄腐酸≥3％。

将HG-15菌株发酵液(芽孢率95％以上)以5％(体积比)加入上述固体水溶肥中，混合均匀，密封储存于阴凉处，每隔30d测定一次水溶肥中的活菌数，连续测定330d。结果显示，固体水溶肥中菌体数量随时间降幅较小，菌体损失率较低，经过为期330d的试验，菌株存活率为85.37％，计数结果见表6。

发酵液组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，水1.0L。

计数培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，水1.0L。

表6HG-15菌株加入到固体水溶肥中菌株存活数量

实施例5

1、HG-15菌株的溶磷能力测定

采用钼锑抗比色法进行可溶性磷含量的测定。将HG-15菌株种子液培养基以2％(体积比)比例接种到解无机磷培养基中，在适宜条件下培养一定时间，即获得菌株的发酵产物，同时以2％(体积比)加入无菌去离子水的解无机磷培养基做空白对照。实验组与空白对照组各设置5个重复，所得结果相对误差不超过10％，测定结果用算数平均值表示。

将样品4000r/min离心20min后，吸取上清液5-10mL(含磷5μg-25μg)于50mL容量瓶中，加入约30mL水稀释上清液，加二硝基酚指示剂2滴，用氢氧化钠溶液或稀硫酸溶液调节上清液pH至溶液刚呈微黄色。然后加入钼锑抗显色剂5mL，摇匀，定容至刻度。在室温高于15℃的条件下放置30min后，以空白试验溶液作参比调零点，与标准溶液同条件显色、比色，读取吸光度。从磷浓度与吸光度的标准曲线上查出所测吸光度对应磷的质量浓度。

标准曲线绘制：分别吸取磷标准溶液0mL，1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，6mL于50mL容量瓶中，加入约30mL水稀释，加二硝基酚指示剂2滴，用氢氧化钠溶液或稀硫酸溶液调节pH至溶液刚呈微黄色。然后加入钼锑抗显色剂5mL，摇匀后定容至50mL。在室温高于15℃的条件下放置30min后，在分光光度计上700nm比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，磷浓度为横坐标，绘制标准曲线。

计算结果：

式中：X——培养液中磷的含量(mg/L)

P——工作曲线查得磷的质量浓度(mg/L)

V₁——显色液体积(mL)

K——稀释倍数

V₂——吸取上清液体积(mL)

HG-15菌株种子液培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，水1.0L。

解无机磷培养基：葡萄糖10.00g，(NH₄)₂SO₄ 0.50g，NaCl 0.30g，KCl 0.30g，MgSO₄·7H₂O0.30g，FeSO₄ 0.03g，MnSO₄ 1.00g，Ca₃(PO₄)₂ 5.00g，去离子水1.00L，琼脂15.00g。

HG-15菌株于解磷发酵培养基中培养5d，利用上述标准曲线测定培养基中可溶性磷的含量为89.33mg/L。根据农业部NY/T 1847-2010关于微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求，在含有难溶性无机磷培养液中，接种菌株与未接种相比，可溶性磷的含量增加70mg/L以上的要求，接种HG-15菌株达到微生物肥料中解磷菌标准。

实施例6

1、HG-15菌株的解钾能力测定

将HG-15菌株种子液培养基以2％(体积比)比例接种到解钾培养基中作为试验组，以2％(体积比)加入无菌去离子水作为空白对照，均在28℃、摇床200r/min条件下培养7d。处理组与空白对照组各设置5个重复，所得结果相对误差不超过10％，测定结果用算数平均值表示。

种子培养液组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g,水1L。

解钾发酵液培养基：蔗糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，MgSO₄ 0.5g，酵母膏0.5g，Na₂HPO₄2.0g，CaCO₃ 1.0g，钾长石粉1.0g，去离子水1.0L。

解钾发酵液的处理采用过氧化氢灰化法：将全部发酵液转入消煮管中，消煮浓缩至10mL左右，加2mLH₂O₂溶液，继续蒸发，反复加浓度为30％H₂O₂溶液几次直至黏性物质完全消化。取下冷却后，3500r/min离心10min，将上清液收集在50mL容量瓶中，用水定容至50mL，然后测定溶液中速效钾含量。

标准溶液制备：吸取钾标准溶液0mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL分别置于8个容量瓶中，加10.00mL硝酸溶液，用水定容，配制溶液中钾含量分别是0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、15.00、20.00μg/mL的标准溶液系列。在火焰光度计上用空白溶液调节仪器零点，以标准溶液系列中的最高浓度的标准溶液调节仪器满刻度，测量其他标准溶液，记录仪器示值。根据钾浓度和仪器示值绘制校准曲线或求出直线回归方程。

利用上述标准曲线测定试验组培养基与空白对照组培养基中有效钾的含量。根据农业部NY/882-2004关于硅酸盐细菌菌种技术指标要求，在含有钾长石的培养液中，速效钾增加量与未接种相比增加20％以上的要求，HG-15菌株培养液中速效钾含量相比对照增加98.71％，达到微生物肥料生产中硅酸盐菌株质量要求。

实施例7

HG-15菌株双抗生素标记菌株的获得

(1)HG-15菌株双抗生素突变菌株的筛选及稳定性检测

刮取2环活化的HG-15菌株菌苔于不含利福平的LB液体培养基中，32℃温度下培养至对数生长期，将种子液以2％(体积比)的接种量接种到利福平浓度为0.5μg/mL的LB液体培养基中，培养8-24h，将该培养液以2％(体积比)的接种量接种到利福平浓度为1μg/mL的LB液体培养基中，培养24h，依次转接入利福平浓度为2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL、300μg/mL的LB中。将得到的抗利福平菌株接种到含300μg/mL利福平和5μg/mL壮观霉素(Spe)的LB液体培养基中，对同时抗利福平和壮观霉素的双抗菌株进行筛选，筛选过程中，LB液体培养基中利福平的浓度为300μg/mL，抗壮观霉素菌株与抗利福平菌株抗生素浓度的递加及筛选方法相同，重复在不含利福平与壮观霉素的平板上活化3代，再分别回接到含利福平300μg/mL和壮观霉素300μg/mL的LB液体培养基中进行培养，最终获得能够稳定遗传并且同时抗利福平和壮观霉素的双抗标记菌株。

(2)HG-15菌株在小麦、玉米、辣椒、苹果、杨树根际的定殖能力测定

将上述试验得到的HG-15双抗生素突变菌株接种至含利福平和壮观霉素均为300μg/mL的LB液体培养基中，32℃，200r/min振荡培养24h，得到HG-15发酵液；选用的花盆内径为22cm，小麦每盆种植5棵，玉米每盆种植4棵，辣椒每盆种植3棵，苹果每盆种植2棵，杨树每盆1棵，每种作物6个重复。去除植株根部表土，分别接种培养好的HG-15双抗生素标记菌株菌液，每盆接种菌液5mL，灌根，将表土覆盖好。60天后取对照组及试验组的小麦、玉米、辣椒、苹果、杨树根际土壤进行菌株回收试验，检测HG-15菌株在作物根际土壤的定殖情况，结果见表7。试验结果表明，HG-15菌株在土壤中定殖60d后在小麦、玉米、辣椒、苹果、杨树根际菌体数量虽有一定程度的下降，但每克干土菌体数量均稳定在1.55×10⁵cfu/g以上，说明HG-15菌株能够在小麦、玉米、辣椒、苹果、杨树根际中稳定定殖，

表7HG-15菌株在小麦、玉米、辣椒、苹果和杨树根际的定殖结果

实施例7中涉及的液体LB培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，水1.0L。

实施例7中涉及的固体LB培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，水1.0L。

实施例8

1、HG-15菌株产芽孢发酵培养基组分及发酵条件优化

(1)种龄的确定

将种子液均以2％(体积比)的接种量等量接入12瓶同批次配置的无菌LB种子液培养基中，32℃、200r/min条件下震荡培养。从初始接种时间开始于600nm波长处测定种子液OD值，每隔1小时测定一次，连续测定12h，每次3个重复。根据分光光度计在600nm波长处测量的种子液在各时段的OD值，以算数平均值绘制菌株的生长曲线图(附图5c)。由图可知，HG-15菌株的对数生长期为3～9h，10h后为稳定期，确定种子液发酵时间为9h。

(2)基础发酵培养基的筛选

将查阅文献获得的13个枯草芽孢杆菌芽孢发酵组分作为HG-15菌株的基础试供培养基，在芽孢率达到90％以上时以梯度稀释涂布法对各发酵培养基进行菌落计数，发酵性状最好的组分为13号组分，发酵时间36h，芽孢率90％以上，菌体数量为125.0×10⁸cfu/mL。试验结果见表8。

13个基础培养基(各组分含量为与组分需要的水质量的比值)：

1号培养基：黄豆饼粉1.50％，麸皮1.00％，葡萄糖0.35％，氯化钠0.09％，硫酸锰0.02％，碳酸钙0.35％，安琪酵母浸粉0.40％。

2号培养基：麸皮1.50％，淀粉1.20％，蛋白胨1.00％，氯化钙0.10％，NaCl0.05％，硫酸锰0.02％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸铵0.10％。

3号培养基：葡萄糖3.00％，玉米粉1.20％，黄豆饼粉1.20％，玉米浆0.20％，氯化钠0.20％，硫酸锰0.01％。

4号培养基：麸皮1.50％，黄豆饼粉1.50％，葡萄糖0.30％，安琪酵母浸粉0.50％，氯化钠0.09％，硫酸锰0.02％，碳酸钙0.35％。

5号培养基：麸皮3.00％，硫酸铵0.15％，氯化钠0.50％，氯化钙0.10％。

6号培养基：葡萄糖0.50％，黄豆饼粉0.20％，玉米粉4.00％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸铵0.05％，碳酸钙0.05％。

7号培养基：黄豆饼粉1.50％，麸皮1.20％，葡萄糖0.30％，安琪酵母浸粉0.50％，氯化钠0.05％，硫酸锰0.02％，碳酸钙0.35％。

8号培养基：麸皮1.50％，淀粉1.00％，安琪酵母浸粉0.25％，葡萄糖0.30％，蛋白胨0.50％，氯化钙0.10％，氯化钠0.05％，硫酸锰0.02％，磷酸二氢钾0.03％，硫酸铵0.10％。

9号培养基：黄豆饼粉1.50％，麸皮1％，葡萄糖0.35％，安琪酵母浸粉0.50％，氯化钠0.05％，硫酸锰0.02％，碳酸钙0.35％。

10号培养基：葡萄糖0.500％，玉米粉1.298％，黄豆饼粉2.011％，碳酸钙0.690％，硫酸铵0.100％，七水硫酸镁0.020％，硫酸锰0.020％。

11号培养基：葡萄糖3.0％，玉米粉1.20％，黄豆饼粉1.20％，玉米浆0.20％，氯化钠0.20％，氯化锰0.01％。

12号培养基：可溶性淀粉0.50％，蛋白胨2.00％，磷酸二氢钾0.10％，硫酸铵0.05％。

13号培养基：黄豆饼粉1.50％，玉米粉1.00％，葡萄糖0.35％，氯化钠0.09％，硫酸锰0.02％，碳酸钙0.35％，硫酸镁0.02％，安琪酵母浸粉0.40％。

表8培养基初筛结果

(3)发酵培养基组分优化正交试验

对基础培养基进行筛选后，采用L₁₈(3⁷)对发酵性状较好的13号组分进行正交设计试验，设置7因素3水平的正交试验，共有18次试验，每个试验设置3次重复，正交试验各因素水平设置如表9。

表9HG-15菌株发酵培养基组分正交试验的因素与水平设计

HG-15菌株发酵培养基的正交试验结果见表10，结果表明，6号组分发酵性状最好：黄豆饼粉10.00g，玉米粉12.00g，葡萄糖4.50g，氯化钠0.45g，碳酸钙1.50g，硫酸镁0.20g，安琪酵母浸粉3.00g，硫酸锰0.20g，水1.00L。发酵液菌体数量达到268.26×10⁸cfu/mL，经过SPSS统计分析，该值在0.01水平上有明显差异。

表10HG-15菌株发酵培养基的正交试验结果

对各因素进行SPSS分析，黄豆饼粉达到了显著水平；其他因素对发酵液菌体数量的影响未达到显著水平。综合各个因素及其水平对菌株数量的影响结果，得到最佳的发酵培养基组分为(g/L)：黄豆饼粉10.00g，玉米粉12.00g，葡萄糖4.50g，氯化钠0.45g，碳酸钙1.50g，硫酸镁0.20g，安琪酵母浸粉3.00g，硫酸锰0.20g，水1.00L。

表11发酵培养基中各因素对HG-15菌株发酵液菌体数量影响的分析

实施例9

HG-15菌剂的制备

(1)菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌HG-15划线接种于LB固体培养基平板上，32℃培养24h-36h；挑取单菌落再次划线转接于LB固体培养基平板上，32℃培养24-30h。

固体LB培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，水1.0L。

(2)一级种子液制备：刮取两环步骤(1)活化好的HG-15菌株菌苔，接种于LB液体培养基中，32℃，180-220r/min，摇瓶培养14-18h，得到一级种子液。

所述一级种子液培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，水1.0L。

(3)二级种子液制备：将一级种子液按照1％-2％(体积比)的比例接种到装有二级种子培养基的发酵罐中发酵培养；转速160-180r/min，温度32℃，通气量为1:0.8-1:1.2，灌压0.04-0.06MPa，培养14-18h，得到二级种子液。

二级种子培养基：黄豆饼粉10.00g，玉米粉12.00g，葡萄糖4.50g，氯化钠0.45g，碳酸钙1.50g，硫酸镁0.20g，安琪酵母浸粉3.00g，硫酸锰0.20g，水1.00L。

(4)发酵液培养：将二级种子液按照10％(体积比)的比例接入装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养；转速140r/min，温度为32℃，通气为量1:0.8-1:1.2，灌压0.04-0.06MPa，培养时间为20h-30h，得到HG-15菌株液体菌剂。

发酵培养基：黄豆饼粉10.00g，玉米粉12.00g，葡萄糖4.50g，氯化钠0.45g，碳酸钙1.50g，硫酸镁0.20g，安琪酵母浸粉3.00g，硫酸锰0.20g，水1.00L。

(5)固体菌剂制备：将步骤(4)获得的HG-15菌株液体菌剂，6500～8500r/min离心20～30min，去除离心上清液，向沉淀物中缓慢加入硅藻土或玉米粉作为载体基质，加入硅藻土或玉米粉的量为HG-15菌株液体菌剂重量的5％～8％，搅拌均匀后喷雾干燥，通过雾化器(65℃左右)的分散和高温空气(180℃)迅速蒸干，料液中的固体物质经旋风分离器收集，得到HG-15菌株固体菌剂。

(6)菌剂的使用方法：将所述HG-15菌株液体菌剂按照1～2L/亩的用量，使用时与水按照1:200(体积比)混合均匀，灌根使用；固体菌剂的使用按照0.5～1.0kg/亩的用量，拌种或加适量水稀释后灌根施用；两种菌剂能够与有机肥、复合肥、水溶肥、控释肥等肥料复合为微生物水溶肥、微生物有机肥、复合微生物肥料等肥料。

实施例10

盆栽试验：HG-15菌剂的促生试验

小麦种子先后经过清水冲洗2次，75％乙醇浸泡10min，30％次氯酸钠浸泡40-60s，无菌水冲洗4-6次、晾干备用。挑选大小均匀、形状一致的小麦种子播种到内径50cm的塑料盆中，设置处理组和对照组：施加HG-15微生物菌剂的作为处理组，同时设置不加HG-15微生物菌剂作为空白对照组：20粒/盆，每个处理设3个重复；待小麦幼苗长至10cm，每盆保留长势一致的小麦幼苗10棵，小麦幼苗生长30天时，将处理组和对照组的小麦幼苗整盆取出，分别随机选取20棵小麦幼苗，轻轻抖掉附着在小麦根际的土样并收集，用自来水将小麦根际冲洗干净，晾干后测定干鲜重等生长量指标。

试验结果表明，处理组小麦幼苗的株高、根长、鲜重、干重和根冠比5个生长量和对照组指标存在显著差异，施加了HG-15菌株制备的菌剂的处理组中小麦的生长量均高于对照组，相比对照组，处理组的小麦幼苗的株高、根长、鲜重、干重和根冠比较对照组分别增长16.35％、31.27％、15.56％、16.80％、13.99％，结果见表12。

表12HG-15菌剂对小麦幼苗生长量的影响

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差。同行中数据后缀字母不同表示不同处理组之间存在显著差异(p<0.05)，字母相同则表示不同处理组之间差异不显著。

实施例11

HG-15菌剂对土壤理化性质的影响

小麦种子的处理与播种同盆栽试验1。设1组处理：在小麦播种时接种HG-15液体菌剂，20mL/盆，6个重复；1组对照：在小麦播种时接种灭活的HG-15液体菌剂，20mL/盆，6个重复。小麦幼苗长至30d时，测定土壤理化指标：pH值[m(土)∶V(水)＝1∶2.5)、有机质、速效P、速效K。

(1)菌剂对土壤有效磷含量的影响

土壤浸提：用百分之一天平称取过1mm筛孔的风干土5g，置于250mL塑料浸提瓶中，准确加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液100mL，再加入一勺无磷活性炭，加盖后在振荡器上振荡30分钟，然后用干燥无磷滤纸过滤，滤液承接于100mL容量的干燥三角瓶中。

待测液中磷的测定：吸取滤液10mL于50mL容量瓶中，然后沿容量瓶壁慢慢加入硫酸钼锑抗混合显色剂5mL，充分摇匀，排出二氧化碳后，加水至刻度，再充分摇匀(最后的酸浓度为0.65mol/L 1/2H₂SO₄)。放置30分钟后在分光光度计上以波长660nm光和1cm光经比色杯进行比色测定。比色测定时做空白试验(即用0.5mol/L碳酸氢钠试剂代替试液，其他步骤与上相同)。从测得的吸光度值，对照标准曲线查出待测液中磷的含量，然后计算出土壤中速效磷的含量。

分别吸取5mg/L磷标准溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于50mL的容量瓶中，逐个加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液10mL。沿容量瓶壁慢慢加入硫酸钼锑抗混合显色剂5mL，充分摇匀，排出CO₂后，加水定容至刻度，充分摇匀；配制成磷的浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L的标准溶液。静置30分钟，然后同待测液一样进行比色。以溶液浓度为横坐标，光密度的读数为纵坐标制作磷标准曲线。

结果计算：从标准曲线上查得待测液的浓度，按下式计算土壤速效磷含量。

式中：mg/L—从标准曲线上查得磷的mg/L数；

50—显色液的总体积，mL；

10—待测液吸取量，mL；

100—提取液总体积，mL；

m—风干土的质量，g。

(2)菌剂对土壤速效钾含量的影响

样品的测定：用百分之一天平称取＜1mm风干土5g，放入150mL塑料浸提瓶中，加入50mL1mol/L中性NH₄OAc溶液，盖好瓶盖后于振荡器上振荡30分钟，取出并过滤，滤液盛于一小三角瓶中，同钾标准系列一起在火焰光度计上测定，记录检流计读数，在标准曲线上查出相应的浓度，计算土壤速效钾含量。

标准曲线的绘制：用100mg/L K标准溶液分别在100mL容量瓶中配成5、10、20、30、50mg/L K标准系列溶液，均用1mol/L中性醋酸铵溶液定容。用50mg/L K标准溶液供火焰光度计喷雾燃烧，调节光栅，使检流计的标尺上有最大读数，然后依次测定各级标准溶液。记下检流计读数，以浓度为横坐标，检流计读数为纵坐标，绘制标准曲线。

结果计算：从标准曲线上查得值(Kmg/L)按下式计算土壤速效钾含量。

式中：Kmg/L—在标准曲线上查得的值；

V—加入浸提液的体积，m1；

m—样品的质量，g。

(3)菌剂对土壤有机质含量的影响

准确称取通过100目筛的风干土样0.1000—1.000g，放入一干燥的硬质试器中，用滴定管准确加入0.4mol/L 1/6K₂Cr₂O₇硫酸溶液10mL，使土壤分散,在试管口加一小漏斗，以冷凝蒸出之水汽。

将8～10个上述装有土样处理的试管放入铁丝笼中(每笼中应均有1-2个空白试管)，当石腊油浴锅中的温度升为185～190℃时，将铁丝笼放入，放入后油浴锅的温度下降并维持在至170-180℃。待试管内液体沸腾发生气泡时开始计时，煮沸5分钟立即取出试管，稍冷。

冷却后，将试管内容物分别倒入250mL三角瓶中，用水洗净试管内部及小漏斗，使三角瓶内溶液总体积在60-70mL，保持混合液中1/2H₂SO₄浓度为2-3mol/L，然后加2-羧基代二苯胺指示剂12-15滴，此时溶液呈棕红色，用标准的0.2mol/L硫酸亚铁溶液滴定。滴定过程中不断摇动，直至溶液的颜色由棕红色经紫色变为暗绿(灰蓝绿色)色即为滴定终点。每个土壤样品设置3个空白实验，用灼烧过的土壤代替土样，其他试剂和操作与试验组完全相同。

结果计算：

式中：V₀—滴定空白试验时所用去FeSO₄毫升数

V—滴定土样时所用去的FeSO₄毫升数；

c—FeSO₄标准溶液的浓度mol/L；

0.003—1/4碳原子的毫摩尔质量，g；

1.1—氧化校正系数。

土壤有机质(％)＝土壤有机碳(％)×1.724

1.724—有机碳换算成有机质的系数

以实施例10中添加HG-15菌剂的小麦土壤为实验组，以未添加HG-15菌剂的处理的小麦土壤为对照组。经过试验测定，对照组土壤测得土壤有机质含量为9.823g/kg，显著低于加入菌剂的处理组12.012g/kg；对照组土壤测得土壤有效磷含量为0.503mg/kg，显著低于加入菌剂的处理组0.563mg/kg；对照组土壤测得土壤速效钾含量为0.342mg/kg，显著低于加入菌剂的处理组0.397mg/kg。结果表明，施加HG-15菌剂可以提高土壤有效磷、速效钾、有机质的含量。试验结果见表13。

表13HG-15菌剂对土壤理化指标

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一株具有耐盐防病促生的枯草芽孢杆菌HG-15及其菌剂制备和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gccatggggc gtgctataca tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct tccctgatgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc 180

ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420

gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540

cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260

atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg 1440

aagtgacaga gg 1452

<210> 2

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

tcggttgatg tatctgctgc ggatacgggc tttctcaggt tgaagtcttc cccaatacct 60

gtgccgagcg ctgtgatcat agagcgaact tcgttgttag aaaggatttt atccagtctg 120

gccttttcaa cgtttaggat tttacctcta agcggcaaaa tggcttggaa atgtctgtcg 180

cgtccttgtt tagcagatcc tccggcagag tcaccctcta cgatatataa ctcggagatg 240

ctcggatctt ttgaagagca gtccgctaac ttaccgggca ggtttgaaat ttccaaagca 300

ctcttacgac gtgttagttc acgggctttt ttcgcagcca ttcttgctct tgccgccatt 360

aagcctttat cgacaatttt tttggctgca tctggatttt ccagcataaa tgtttccatc 420

gccgtagaaa ataacgtatc ggtgatcgtc cgtgcttctg agttgcccag ctttgttttc 480

gtttggccct caaactgcgg atcagggtgt ttgattgaaa taatcgctgt cagcccttcc 540

cttacgtcat ctccgcttag gtttggatca ttttctttaa taagcccttt ttttctggcg 600

taatcgttga taacacgagt caggcccgtt ttgaagccag cttcatgggt accgccttcg 660

tacgtgttaa tgttgtttgt aaacgagtaa atgttgcttg tgtagctgtc attgtattgc 720

aaagccactt caaccgtaat gccgtccttt tcgccttcaa tgtaaatcgg ctcttcatgg 780

acaacctctt tagagcggtt taaatactct acataacttt taattccgcc ttcgtaatgg 840

tattcatttt tgcgctcttg tccttcacgt ttatcctcaa tcgtgatgtt tacgcccttt 900

gttaaaaagg ctaattcacg tacgcggttg gcaagcagat cataatcata ctcggttgtt 960

tctgagaaaa tttcagggtc cgggacaaaa tgtgtcgtcg ttcctgtatg atccgtttcg 1020

ccaatgattt caaggtctgt aaccggaact ccgcgtttat aagtttggcg gtgaatttta 1080

ccgtcacggt gaaccgtcac atcaagctct gttgatagtg cgtttacgac agacgcacct 1140

acaccgtgta atcctccgga tactatagcc gctcccgtg 1179

<210> 3

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

agaagcccgg ggacac 16

<210> 4

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

aagaaggacg ggggagcg 18

<210> 5

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

cacggcaagg cgacgcgacg 20

Claims (7)

1.一种耐盐防病促生的菌株，其特征在于：所述的菌株是保藏编号为CGMCC NO.15773、保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis） HG-15。

2.一种HG-15微生物菌剂，其特征在于：所述HG-15微生物菌剂是由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HG-15发酵得到的菌剂。

3.HG-15微生物菌剂在抑制禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、假禾谷镰刀菌（Fusarium pseudograminearum）、胶胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)中的应用，所述HG-15微生物菌剂是由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis） HG-15发酵得到的菌剂。

4.如权利要求2或3所述的HG-15微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤如下：

1）菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）HG-15划线接种于LB固体培养基平板上，32℃培养24h-36h；挑取单菌落再次划线转接于LB固体培养基平板上，32℃培养24-30h；

2）一级种子液制备：刮取两环步骤1）活化好的HG-15菌株菌苔，接种于LB液体培养基中，32℃，180-220r/min，摇瓶培养14-18h，得到一级种子液；

3）二级种子液制备：将一级种子液按照体积比1%-2%接种到装有二级种子培养基的发酵罐中发酵培养；转速160-180r/min，温度32℃，通气量为1:0.8-1:1.2，灌压0.04-0.06MPa，培养14-18h，得到二级种子液；

4）发酵液培养：将二级种子液按照体积比10%接入装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养；转速140 r/min，温度为32℃，通气为量1:0.8-1:1.2，灌压0.04-0.06MPa，培养时间为20h-30h，得到HG-15菌株液体菌剂；

5）固体菌剂制备：将步骤4）获得的HG-15菌株液体菌剂，6500～8500r/min离心20～30min，去除离心上清液，向沉淀物中缓慢加入硅藻土或玉米粉作为载体基质，加入硅藻土或玉米粉的量为HG-15菌株液体菌剂重量的5%～8%，搅拌均匀后喷雾干燥，65℃通过雾化器的分散和180℃高温空气迅速蒸干，料液中的固体物质经旋风分离器收集，得到HG-15菌株固体菌剂。

5.如权利要求4所述的HG-15微生物菌剂的制备方法，其特征在于：

所述LB固体培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，水1.0L；

所述LB液体培养基组分：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，水1.0L；

所述二级种子培养基组分：黄豆饼粉10.00g，玉米粉12.00g，葡萄糖4.50g，氯化钠0.45g，碳酸钙1.50g，硫酸镁0.20g，安琪酵母浸粉3.00g，硫酸锰0.20g，水1.00L；

所述发酵培养基组分：黄豆饼粉10.00g，玉米粉12.00g，葡萄糖4.50g，氯化钠0.45g，碳酸钙1.50g，硫酸镁0.20g，安琪酵母浸粉3.00g，硫酸锰0.20g，水1.00L。

6.如权利要求2所述的HG-15微生物菌剂的使用方法，其特征在于：液体菌剂按照1～2L/亩的用量，使用时与水按照体积比1:200混合均匀，灌根使用；固体菌剂的使用按照0.5～1.0kg/亩的用量，拌种或加适量水稀释后灌根施用。

7.如权利要求2所述的HG-15微生物菌剂在制备生物有机肥或复合微生物肥料中的应用。

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