CN103421697B - 一株降解金霉素的米曲霉lj366 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株能够降解金霉素的米曲霉（Aspergillus oryzae）LJ366，属于微生物技术领域。该菌株已于2013年8月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8078。本发明所述的金霉素降解菌株LJ366的ITS基因序列由593个碱基组成。该菌株具有降解金霉素的作用,可应用于处理固体废弃物和液体中残留的金霉素。
Description
技术领域
本发明涉及一株能降解金霉素的米曲霉（Aspergillus oryzae）LJ366，属于微生物技术领域。
背景技术
金霉素(Chlortetracycline，CTC)属于四环素类抗生素，具有抗菌谱广、低浓度下促生长和成本低等优点，被广泛用于畜禽与水产养殖等行业。金霉素进入动物体后，大部分不能完全被机体吸收,而是以原形或代谢物形式经由粪便排出体外,对生态环境安全构成威胁。同时，在金霉素发酵生产过程中，会产生大量含有金霉素残留的废渣与废水，若残留的金霉素处理不当而排入环境，将会对非靶向微生物的数量和种群结构产生影响，有可能诱导出耐药性细菌及抗性基因。目前，已经在水体和土壤中检测到了四环素类抗生素残留引起的抗性基因tetL、tetA、tetB、tetM、tetQ、tetO、tetW等。因此，金霉素等抗生素引起的环境污染已成为国内外普遍关注的热点问题之一，也成为金霉素生产企业和利用部门亟待解决的棘手问题。
利用生物方法降解环境中抗生素残留是一种具有广阔前景的方法。目前，在金霉素降解菌株筛选方面，已有少量研究报导。2005年，何瑜筛选得到的一株能够降解金霉素的红曲霉B3菌株，可用于处理金霉素生产废水。2012年，李艳菊等筛选得到2株能够降解金霉素的菌株，分别为哈茨木霉(Hypocrea lixii)LJ245和小刺青霉（Penicillium Spinulosum）LJ220,可用于处理含金霉素的废水和固体废弃物。而有关米曲霉降解金霉素方面的研究，国内外尚未见报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能降解金霉素的菌株LJ366及其基因。
本发明所述的金霉素降解菌株LJ366，根据对其形态特征观察和18SrDNA-ITS序列分析，确定该菌株为米曲霉（Aspergillus oryzae），命名为米曲霉LJ366（Aspergillus oryzae LJ366）。该菌株于2013年8月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.8078。保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的金霉素降解菌株LJ366的ITS基因序列如下：
上述序列由593碱基（bp）组成。
菌株LJ366在马丁氏平板培养基上生长较快，菌落中央现白色絮状，菌丝为白色柔毛状，培养2d左右菌落产生颜色，初期为淡黄绿色，随着生长渐变为绿褐色，菌落常排列成同心轮纹状，菌落质地较厚，菌落反面呈乳黄色。将孢子涂布于马丁氏平板上，在28℃-30℃培养，2d左右孢子萌发，4d菌落直径3.0cm-3.5cm，9d菌落直径7.5cm-8.0cm，11d后菌落铺满整个平板，菌落上常有无色渗出液，呈稀疏小滴。在显微镜下观察，该菌株菌丝发达，透明，有隔膜。菌丝顶端产生顶囊，顶囊近烧瓶状，分生孢子呈球状串生。
本发明中所提供的菌株LJ366可在以金霉素为唯一碳源且浓度为0.01g/L-10.00g/L的无机盐固体培养基中生长，尤其在金霉素浓度为0.01g/L-5.00g/L的无机盐平板培养基中生长较好。
将本发明所述的菌株LJ366，接种于以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度分别为0.5g/L和1.5g/L的无机盐液体培养基中，在30℃,170r/min震荡培养15d，金霉素降解率分别可达91.59%和80.98%。
本发明所述的菌株LJ366对菌渣中金霉素具有较好的降解作用，经菌株LJ366发酵15d，未灭菌菌渣与灭菌菌渣中金霉素的降解率分别达到为90.56%和98.11%。
菌株LJ366可以耐受强酸性环境，在初始pH值为2.2-2.5的金霉素菌渣中，该菌株能较好生长，通过该菌株代谢作用，可使菌渣的pH值升至中性到微碱性。
本发明的有益效果：
菌株LJ366具有降解金霉素的功能,可以在以金霉素为唯一碳源且浓度在0.01g/L-10.00g/L的培养基中生长。该菌株使用方便，对液体和固体废弃物中残留的金霉素具有较好的降解作用，可应用于处理金霉素生产企业废弃物和畜禽粪便中残留的金霉素，同时，可望应用于金霉素污染环境的生物修复。
附图说明
图1为菌株LJ366的基因组DNA凝胶电泳图(1：基因组DNA,M：Marker)。
图2为菌株LJ366的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图(1：PCR扩增产物，M：
Marker）。
图3为菌株LJ366的菌落形态图。
图4为菌株LJ366的分生孢子穗显微图。
图5为菌株LJ366的ITS序列系统发育树。
图6为菌株LJ366对摇瓶培养中的金霉素的降解率。
具体实施方式
实施例1
一、金霉素降解菌株LJ366的筛选与鉴定
1、材料准备
菌样品来源：金霉素生产企业的金霉素菌渣。
马丁氏液体培养基：KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，溶于1000mL自来水中，121℃湿热灭菌15min。按13%-18%的比例加入琼脂，得到马丁氏固体培养基。
无机盐液体培养基：(NH4)2SO42.0g，K2HPO40.5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.2g，CaCl20.1g，FeSO4·7H2O0.01g，EDTA0.015g，溶于1000mL自来水中，121℃湿热灭菌20min。
在无机盐液体培养基中，按13%-18%的比例加入琼脂，得到无机盐固体培养基。
2、实验仪器与设备
岛津LC-20A高效液相色谱仪，UNICO UV-2600A紫外可见光分光光度计，Mettler Toledo ML204分析天平、Mettler Toledo pH计、YT-CJ-IND超净工作台、HZQ-F160全温振荡培养箱、TG16-W高速离心机、YX-280D手提式压力蒸汽锅、NiconEcolipase80i荧光显微镜、DNA Engine PCR仪、DcodeTM变性梯度凝胶电泳仪、DHP-9082电热恒温培养箱、BOSCH冰箱、Champ Gel-3200凝胶成像系统等。
3、菌株筛选
（1）菌株的分离与纯化
采用平板划线法分析与纯化菌株。选用金霉素菌渣多份，用接种环挑取少量的菌渣，在添加金霉素浓度为1.0g/L的马丁氏固体培养基上划线，置于室温条件下避光培养2-7d，得到不同菌落。然后，挑起单菌落，在上述的培养基上继续划线进行分离与纯化。此步骤重复3-5次，直至得到单一菌落。
（2）筛选
将步骤（1）分离纯化得到的但单菌落，分别接种至马丁氏培养基中进行活化培养，将活化后菌株按3%-5%的接种量接入以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度为0.5g/L的无机盐液体培养中，30℃,170r/min暗培养，在第3d和第6d，分别取样，用高效液相色谱方法，分别测定并计算各菌株对金霉素的降解率，获得了降解率高的菌株LJ366。
金霉素测定方法：取1.0mL培养液，用22μm的滤膜过滤，然后用高效液相色谱仪测定金霉素含量。HPLC条件：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，柱温35℃，进样量为10μL，检测波长375nm，流动相为乙二酸溶液(0.01mol/L):乙腈:甲醇体积比为10:3:2，流速为1.0mL/min。
二、菌落形态特征观察
菌株LJ366在马丁氏平板培养基上生长较快，中央现白色絮状，菌丝为白色柔毛状，培养2d左右菌落产生颜色，初期为淡黄绿色，随着生长渐变为绿褐色，菌落常排列成同心轮纹状，菌落质地较厚，菌落反面呈乳黄色。将孢子涂布于马丁氏平板上，在28℃-30℃培养，2d左右孢子萌发，4d菌落直径3.0cm-3.5cm，9d菌落直径7.5cm-8.0cm，11d后菌落铺满整个平板，菌落上常有无色渗出液，呈稀疏小滴。在显微镜下观察，该菌株菌丝发达，透明，有隔膜，菌丝分枝多且不规则，整体像树枝。菌丝顶端产生顶囊，顶囊近烧瓶状，分生孢子呈球状串生。菌株LJ366的菌落形态和显微形态分别见图3和图4。
三、菌株LJ366的分子生物学鉴定
1、DNA提取
DNA的提取包括菌株活化培养、细胞破壁、DNA释放、DNA分离和纯化，DNA的浓缩、沉淀与洗涤等基本步骤。
（1）菌株活化培养：配制马丁氏培养基，分装后采用121℃,15min高压灭菌，接种LJ366菌株，30℃,170r/min培养2-3d。然后转接至新培养基中在相同条件下，继续培养2d。如此活化培养2-4代。
（2）将步骤（1）培养的菌球无菌过滤，用无菌滤纸吸干菌球内的培养液，将吸干的菌球放入研钵中用液氮充分研磨，将研磨后的粉末转入新的1.5mL EP管中，加入600μL65℃预热的SDS裂解液，65℃保温30min，期间不断摇匀。
（3）冰中冷却至室温后向EP管中加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液（25：24：1），充分混匀，4℃，10000r/min，离心10min，取上清液至新的EP管中。
（4）向新的EP管中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液（24：1），充分混匀，4℃，10000r/min，离心10min，取上清液至新的EP管中。
（5）向上清中加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃，10000r/min，离心10min，弃上清。
（6）70%冰乙醇500μL洗涤DNA2-3次，倒置晾干，加入适量TE溶解。-20℃保存提取的DNA。
（7）1%琼脂糖凝胶电泳检测：取（6）步骤中的DNA5μL，加1μL的loadingbuffer上样。
（8）凝胶成像系统观测并照相。图1为菌株LJ366基因组DNA的凝胶电泳图。
2、PCR扩增
采用通用引物ITS1和ITS4，对菌株LJ366的18S rDNA基因的ITS片段进行PCR扩增。PCR扩增序列采用50μL反应体系：10XPCR Buffer5μL、引物IST1 10mmol/L 1μL,引物ITS4 10mmol/L 1μL、模板（约25mmol/L）1μL、rTaq DNA聚合酶（2U/μL）0.5μL、dNTP(10μM) 1μM、ddH2O 40.5μL。
PCR反应条件为：94℃预热5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min。
3、PCR产物检测
采用通过1%的琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物，并用凝胶成像系统照相，图2为菌株LJ366的rDNA-ITS片段PCR产物凝胶电泳图。
4、测序及系统发育树构建
将扩增的ITS序列送北京诺赛基因组研究中心测序，得到菌株LJ366的18S rDNA-ITS基因序列如下：
将测序结果与NCBI数据库Blast比对，得到菌株LJ366与米曲霉（Aspergillus oryzae）和黄曲霉（Aspergillus flavus）中的一些菌株的ITS序列的同源性为100%。在Gnenbank里查找相关曲霉菌株序列,用Clustalx软件进行序列比对，再用MEGA5.05软件进行分析，用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树（见图5），结果显示，菌株LJ366与菌株Aspergillus oryzaeNRRL35191聚于同一分支，系统发育关系最为密切。
四、菌株LJ366鉴定为一种新功能菌株
根据菌株LJ366菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，将菌株LJ366鉴定为米曲霉（Aspergillus oryzae），并命名为米曲霉LJ366（Aspergillus oryzaeLJ366）。该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCC NO.8078，保藏日期为2013年8月27日。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
目前，国内外尚无文献报道米曲霉(Aspergillus oryzae)具有降解金霉素的功能。因此，米曲霉LJ366为一株具有降解金霉素功能的新菌株。
实施例2
菌株LJ366在金霉素为唯一碳源培养基中生长与降解实验
1、在不同浓度霉素培养基上生长实验
配制以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度分别为0.01g/L、0.05g/L、0.10g/L、0.50g/L、5.00g/L、10.00g/L、15.00g/L的无机盐固体培养基。挑取LJ366菌落少许，在无机盐固体培养基平板上划线，于室温下避光培养。经观察得知，在培养第3d，在金霉素浓度为0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L和5.0g/L的平板上长出菌丝，且生长良好。在培养的第15d，在金霉素浓度为10.00g/L的平板上长出菌丝，说明菌株LJ366能耐受浓度为10.00g/L的金霉素。
2、菌株LJ366对摇瓶中金霉素的降解实验
将菌株LJ366接种至金霉素为唯一碳源且金霉素浓度分别为0.5g/L和1.5g/L的无机盐液体培养基中，30℃,170r/min摇瓶培养，在培养的第0d、3d、6d、9d、15d分别取样，用高效液相色谱仪（HPLC）测定培养液中金霉素含量。金霉素测定方法同实施例1。根据测定结果计算出金霉素的降解率。
由实验结果（见图6）得知，培养6d，菌株LJ366对浓度为0.5g/L和1.5g/L的金霉素的降解率分别为56.37%和47.55%；培养15d时，其降解率可分别达到91.59%和80.98%。
实施例3
菌株LJ366对菌渣中金霉素降解实验
1、菌株活化与菌渣预处理
菌株LJ366用马丁氏培养基活化培养。菌渣用破碎机破碎后，分成两部分，一部分采用121℃湿热灭菌20min-30min处理，另一部分不经过湿热处理。
2、接种与发酵培养
按5%-7%的接种量分别将活化后菌株LJ366分别接种到上述经过预处理的菌渣中,并分别加入一定量的碳源如麸皮、锯末或秸秆等，搅拌均匀，放入发酵容器中，在温度为30℃-35℃条件下进行固体发酵,定期搅拌并取样。
3、发酵过程中菌渣pH值测定
在发酵的第0d、3d、6d、9d、15d分别称取4.00g菌渣，加20ml蒸馏水，超声30min，用pH计测定其pH值。
由测定结果得知，菌渣pH值在发酵过程中逐渐升高，在发酵第6d，未灭菌菌渣pH值由初始的2.2左右上升至6.8左右，在发酵第9d，升至7.4左右，之后，pH值维持在中性到微碱性。灭菌处理后菌渣的pH值变为2.5左右，在发酵的第9d，灭菌菌渣pH值升至7.7左右。由此说明菌株LJ366能够在酸性较强的菌渣中较好生长。
4、菌渣发酵过程中金霉素残留量测定
在菌渣发酵的第0d、3d、6d、9d、15d分别称取菌渣1.0000g，加入EDTA-Mcllvaine缓冲液10.00mL，混匀，超声30min，1000r/min离心3min，取上清液，用22μm滤膜过滤，利用高效液相色谱仪测定滤液中金霉素含量。测定方法同实施例1。根据测定结果，计算金霉素降解率。
由实验结果得知，菌株LJ366对菌渣中金霉素具有较好的降解作用，经菌株LJ366发酵15d，未灭菌菌渣与灭菌菌渣中金霉素的降解率分别为90.56%和98.11%。
EDTA-Mcllvaine缓冲液配制：称取28.41g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL，配成0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液；称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL，配成0.1mol/L的柠檬酸溶液。将1000mL的柠檬酸溶液与625mL磷酸氢二钠溶液混合调至pH=4，配成Mcllvaine缓冲溶液。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mL的Mcllvaine缓冲溶液，溶解，摇匀，备用。
Claims (3)
1.一株降解金霉素的米曲霉LJ366，其特征在于：通过形态特征观察，基因组DNA提取、18S rDNA-ITS序列扩增与比对以及构建系统发育树，鉴定菌株LJ366为米曲霉(Aspergillus oryzae)，命名为米曲霉LJ366(Aspergillus oryzae LJ366),该菌株已于2013年8月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.8078，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的一株降解金霉素的米曲霉LJ366的应用，其特征在于：菌株LJ366用于金霉素的降解中。
3.根据权利要求2所述的一株降解金霉素的米曲霉LJ366的应用，其特征在于：菌株LJ366对液体和固体废弃物中残留的金霉素具有较好的降解作用；菌株LJ366可在以金霉素为唯一碳源且浓度为0.01g/L-10.00g/L的无机盐固体培养基中生长；菌株LJ366接种在以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度为0.5g/L和1.5g/L的无机盐液体培养基中，30℃,170r/min培养15d，对金霉素降解率分别可达91.59％和80.98％。
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