CN103289904A - 一株降解金霉素的桔青霉lj318 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株能够降解金霉素的桔青霉（Penicillium citrinum）LJ318，属于微生物技术领域。该菌株已于2012年3月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5850。本发明的金霉素降解菌株LJ318的rDNA-ITS基因序列由544个碱基组成。菌株LJ318耐受金霉素范围宽，对液体与固体废弃物中残留的金霉素均具有较好的降解作用。
Description
技术领域
本发明涉及一株能够降解金霉素的桔青霉（Penicillium citrinum）LJ318，属于微生物技术领域。
背景技术
金霉素(Chlortetracycline，CTC)，又名氯四环素，是一种广谱性抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、螺旋体、立克次氏体和大型病毒等有抑制作用，可以预防多种动物疾病，被广泛应用于畜禽疾病防治中。
作为兽药的金霉素在动物体内代谢后，大部分以原形排出，在环境中不易发生生物降解，形成环境蓄积与残留。金霉素生产企业在发酵生产金霉素过程中，会产生大量废弃物，若这些废弃物处理不完善进入环境,也会对生态环境和生物产生毒性和抑制作用，进而对人类健康造成潜在危害。因此，金霉素残留的去除已成为金霉素生产企业和使用部门面临的亟待解决的重要问题。随着生物降解处理污染物技术的不断发展与完善，人们已经意识到用微生物技术来处理日益增加的环境污染物是一种较为安全、高效和低耗的手段，也是一种具有发展前途的降解环境污染物方法。目前，生物处理技术已在的许多污染物处理方面得到应用。
然而，对金霉素降解菌株的筛选以及利用高效菌株降解金霉素方面的研究，国内外研究报导极少。而有关桔青霉降解金霉素方面的研究，国内外尚无研究报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一株金霉素降解菌株LJ318及其基因。
本发明所提供的金霉素降解菌株LJ318，为桔青霉（Penicillium citrinum）。该菌株已于2012年3月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCCNo.5850，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
本发明的金霉素降解菌株LJ318的基因，为菌株LJ318的rDNA-ITS基因，通过基因组DNA提取、rDNA-ITS序列扩增、rDNA-ITS全序列测定和分析而获得。该菌株的rDNA-ITS全序列如下：
CCGTAGGTGA ACCTGCGGAA GGATCATTAC CGAGTGCGGG CCCCTCGGGG CCCAACCTCC 60
CACCCGTGTT GCCCGAACCT ATGTTGCCTC GGCGGGCCCC GCGCCCGCCG ACGGCCCCCC 120
TGAACGCTGT CTGAAGTTGC AGTCTGAGAC CTATAACGAA ATTAGTTAAA ACTTTCAACA 180
ACGGATCTCT TGGTTCCGGC ATCGATGAAG AACGCAGCGA AATGCGATAA CTAATGTGAA 240
TTGCAGAATT CAGTGAATCA TCGAGTCTTT GAACGCACAT TGCGCCCTCT GGTATTCCGG 300
AGGGCATGCC TGTCCGAGCG TCATTGCTGC CCTCAAGCCC GGCTTGTGTG TTGGGCCCCG 360
TCCCCCCCGC CGGGGGGACG GGCCCGAAAG GCAGCGGCGG CACCGCGTCC GGTCCTCGAG 420
CGTATGGGGC TTCGTCACCC GCTCTAGTAG GCCCGGCCGG CGCCAGCCGA CCCCCAACCT 480
TTAATTATCT CAGGTTGACC TCGGATCAGG TAGGGATACC CGCTGAACTT AAGCATATCA 540
ATAA 544
上述rDNA-ITS序列由544个碱基（bp）组成。
菌株LJ318可以在马丁氏培养基、麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上生长。菌株LJ318的菌丝呈白色，致密，短绒毛状，在PDA固体培养基上生长4天，菌落大小为4-9mm，随着生长菌落颜色变为铜绿色至深绿色，衰老后颜色逐渐变暗，菌落背部呈黄绿色。在麦芽汁固体培养基上生长3天，菌落大小为3-7mm，中部颜色为深绿色。显微镜下观察菌丝透明，具横隔，分生孢子梗从菌丝上生出，顶端生有扫帚状的分枝结构，分生孢子圆形。
本发明所提供的金霉素降解菌株LJ318，通过对其形态特征观察和rDNA-ITS序列分析，确定该菌株为桔青霉，命名为桔青霉LJ318（Penicillium citrinum LJ318）。
本发明中的桔青霉菌株LJ318，可以在以金霉素为唯一碳源、且浓度为25mg/L-10000mg/L培养基中生长。该菌株耐受和利用金霉素浓度范围宽，对环境中从微量到高浓度残留金霉素均具有较好的降解作用。
本发明中的菌株LJ318在以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度为500mg/L的液体培养基中进行培养，该菌株对金霉素的降解率可达88.01%。
本发明中的金霉素降解菌株LJ318，能在酸性较强的新鲜的金霉素菌渣中快速生长，对菌渣中残留的金霉素具有较好的降解作用，7天对金霉素的降解率可达91.80%。该菌株可应用于金霉素生产企业废弃物的处理，并可望应用于周边金霉素污染环境的生物修复。
本发明的有益效果：
本发明中的菌株LJ318对金霉素耐受和利用浓度范围宽，可以在以金霉素为唯一碳源且浓度为25mg/L-10000mg/L培养基中生长，同时能够在酸性较强的新鲜菌渣中较好生长，对液体和废渣中残留的金霉素具有较好的降解作用。该菌株使用方便，可应用于金霉素生产企业废弃物降解处理，也可望应用于环境中金霉素污染的生物修复。同时，菌株LJ318还可作为金霉素降解菌剂的制备原料。
附图说明
图1为菌株LJ318的rDNA-ITS片段PCR产物凝胶电泳图（从左向右第一泳道为Marker，第二泳道为LJ318的ITS序列的PCR产物）；
图2为菌株LJ318的菌落形态图。
具体实施方式
实施例1
1．一株降解金霉素的桔青霉LJ318的筛选方法
1.1材料准备
菌样品来源：采自金霉素生产企业废弃物。
无机盐固体培养基：(NH4)2SO4 2.00g，K2HPO4 0.50g，KH2PO4 0.50g，MgSO4·7H2O 0.50g，NaCl 0.20g，CaCl2 0.1g，FeSO4 0.01g，EDTA 0.015g，琼脂13.00g，葡萄糖2.00g/L，溶于1000ml蒸馏水中。115℃灭菌20min后，在超净工作台中添加2.00g/L金霉素。
马丁氏培养基：蛋白胨6.0g，葡萄糖10.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，溶于1000ml蒸馏水中。115℃灭菌20min。
选择培养基：(NH4)2SO4 2.00，K2HPO4 0.50，KH2PO4 0.50，MgSO4·7H2O 0.50，NaCl 0.20，CaCl2 0.10，FeSO4 0.01g，EDTA 0.015g，溶于1000ml蒸馏水中。115℃灭菌20min，待冷却后，分别添加25mg/L、50mg/L、100mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L、10000mg/L金霉素。
1.2实验仪器与设备
岛津LC-20A高效液相色谱仪、HZQ-F160全温振荡培养箱、TG16-W高速离心机、LDZX-30KBS高压灭菌锅、Mettler Toledo ML204分析天平、YT-CJ-1ND超净工作台、Mettler Toledo pH计、SB3200DT超声波清洗机、DHP-9082电热恒温培养箱、Nicon Eclipse 80i荧光显微镜、DNA Engine PCR仪、DcodeTM变性梯度凝胶电泳仪、BOSCH冰箱、ChampGel-3200凝胶成像系统等。
1.3菌株筛选
操作步骤如下：
1）菌株分离与纯化
采集金霉素菌渣与金霉素废水多份，分别吸取200μl菌渣浸出液与废水200μl，依次涂布于无机盐固体培养基上遮光培养2-7天，挑选单菌落，在无机盐固体培养基上划线分离纯化。此步骤重复2-3次，直至得到单一菌落。
2）高效降解金霉素菌株的筛选
将步骤1）中得到的单菌落挑起依次接入马丁氏培养基中，置于摇床中培养2-3天，然后按2%的接种量转接到选择培养基中暗培养，在第3天和第6天取样，用高效液相色谱法测定各个单一菌落对金霉素的降解率，从中筛选出降解率高的菌株LJ318。
2.对金霉素降解菌株LJ318的分子生物学鉴定
鉴定步骤如下：
2.1基因组DNA的提取
1）菌株活化培养：配制马丁氏培养基，分装后灭菌。按1%的接种量将菌株LJ318的种子液接种到马丁氏培养基中，28℃，170r/min培养24h-48h，如此活化培养2-3次，收集菌体。
2）将步骤1）培养得到的菌体放入研钵中用液氮充分研磨，将研磨后的粉末转入新的1.5ml的EP管中，加入600μl 65℃的CTAB和蛋白酶K2μl，于水浴锅中65℃保温30min。
3）向EP管中加入600μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液，使之充分混匀，4℃，10000r/min，离心10min，吸取上清液，转至新的EP管中。加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），充分混匀，4℃，10000r/min，离心10min，吸取上清液，转至新的EP管中。
4）向步骤3）得到的上清液中加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃，10000r/min离心10min，弃上清，得到DNA。
5）用70%冰乙醇500μl洗涤DNA2-3次,倒掉液体,倒置EP管晾干，然后加入100μl 1×TE溶解。
6）用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。
2.2ITS序列的扩增
采用通用引物ITS1和ITS4，对菌株LJ302的rDNA基因的ITS片段进行PCR扩增。反应体系50μL：10Xbuffer 5ul,dNTP 1ul,引物ITS1 2μL，引物ITS4 2μL，Template 5μL，ddH2O 35μL。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增后的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。图1为菌株LJ318的rDNA-ITS片段PCR产物凝胶电泳图，从左向右第一泳道为Marker，第二泳道为菌株LJ318的ITS序列的PCR产物。
2.3ITS序列的鉴定
将扩增的ITS序列送北京诺赛基因组研究中心测序，得到该菌株的
rDNA-ITS序列组成：
CCGTAGGTGA ACCTGCGGAA GGATCATTAC CGAGTGCGGG CCCCTCGGGG CCCAACCTCC 60
CACCCGTGTT GCCCGAACCT ATGTTGCCTC GGCGGGCCCC GCGCCCGCCG ACGGCCCCCC 120
TGAACGCTGT CTGAAGTTGC AGTCTGAGAC CTATAACGAA ATTAGTTAAA ACTTTCAACA 180
ACGGATCTCT TGGTTCCGGC ATCGATGAAG AACGCAGCGA AATGCGATAA CTAATGTGAA 240
TTGCAGAATT CAGTGAATCA TCGAGTCTTT GAACGCACAT TGCGCCCTCT GGTATTCCGG 300
AGGGCATGCC TGTCCGAGCG TCATTGCTGC CCTCAAGCCC GGCTTGTGTG TTGGGCCCCG 360
TCCCCCCCGC CGGGGGGACG GGCCCGAAAG GCAGCGGCGG CACCGCGTCC GGTCCTCGAG 420
CGTATGGGGC TTCGTCACCC GCTCTAGTAG GCCCGGCCGG CGCCAGCCGA CCCCCAACCT 480
TTAATTATCT CAGGTTGACC TCGGATCAGG TAGGGATACC CGCTGAACTT AAGCATATCA 540
ATAA 544
上述rDNA-ITS序列由544个碱基（bp）组成。
3.菌落形态特征观察
菌株LJ318可以马丁氏培养基、麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上生长。菌株LJ318的菌丝呈白色，致密，短绒毛状，在马丁氏固体培养基上生长4天，菌落大小为4-9mm，随着生长菌落颜色变为铜绿色至深绿色，衰老后颜色逐渐变暗，菌落背部呈黄绿色。在麦芽汁固体培养基上生长3天，菌落大小为5-7mm，中部颜色为深绿色。显微镜观察菌丝透明，具横隔，分生孢子梗从菌丝上生出，顶端生有扫帚状的分枝结构，由两次分枝系统构成,分生孢子圆形。菌株LJ318的菌落形态见图2。
4.菌株LJ318鉴定为一种新功能菌株
将测序结果与NCBI中的GenBank进行Blast比对，得到LJ318与Penicillium citrinum的ITS序列的同源性为100%。根据菌株LJ318的形态特征以及rDNA-ITS序列分析结果，将该菌株鉴定为桔青霉（Penicillium citrinum），并命名为桔青霉LJ318（Penicillium citrinum LJ318）。该菌株已于2012年3月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.5850。目前，国内外尚没有文献报导桔青霉（Penicillium citrinum）具有降解金霉素的功能。因此，菌株LJ318属于一种新功能菌株。
实施例2
菌株LJ318在金霉素为唯一碳源培养基中生长与降解实验：
制备以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度分别为25mg/L、50mg/L、100mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L、10000mg/L的无机盐固体培养基。从活化的培养基中挑取LJ318菌落少许,在上述无机盐固体培养基平板上划线，28℃避光培养，经观察得知，菌株LJ318在金霉素浓度为25mg/L、50mg/L、100mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、 5000mg/L、10000mg/L的平板上均长出了菌丝。说明菌株LJ318可以在金霉素浓度为25mg/L-10000mg/L的培养基中生长。
将活化后菌株LJ318接入以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度为500mg/L的无机盐液体培养基中，放入温度为28℃，转速为170r/min的摇床中培养，定期取样测定培养液中金霉素含量。通过测定得知LJ318对唯一碳源金霉素的降解率可达88.01%。测定方法为：取1mL培养液，用0.22μm有机滤膜过滤，利用高效液相色谱仪测定滤液中金霉素含量并计算出降解率。高效液相色谱（HPLC）条件：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙二酸溶液(0.01mol/L):乙腈:甲醇体积比为10:3:2；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；进样量为10μL；检测波长375nm。
实施例3
菌株LJ318对金霉素菌渣处理实验：
用马丁氏培养基活化菌株LJ318，然后接种到新鲜的金霉素菌渣中，在30℃条件下暗培养，定期取样测定菌渣中金霉素的残留量并计算降解率。
pH值测定方法为：取1g菌渣加10ml蒸馏水，搅拌均匀后用酸度计测定。
金霉素测定方法为：准确称取菌渣2.0000g，用20mL丙酮：盐酸溶液：水=13：1：6的提取液提取，提取液在8000r/min条件下，离心5min，取上清液，用22μm的滤膜过滤，利用高效液相色谱法测定滤液中金霉素含量并计算出的降解率，HPLC条件同实施例2。
研究结果显示，菌株LJ318能够在酸性较强pH约为2.3的新鲜菌渣中较好生长，在发酵的第7天对菌渣中金霉素的降解率为91.80%。
Claims (6)
1.一株降解金霉素的桔青霉LJ318，其特征在于：通过形态特征观察，基因组DNA提取和rDNA-ITS序列扩增与比对，鉴定菌株LJ318为桔青霉（Penicillium citrinum），命名为桔青霉LJ318（Penicillium citrinum LJ318）,该菌株已于2012年3月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.5850。
2.根据权利要求1所述的一株降解金霉素的桔青霉LJ318，其特征在于：菌株LJ318可以在马丁氏培养基、麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上生长。菌株在PDA固体培养基上生长4天，菌落大小为4-9mm，随着生长菌落颜色变为铜绿色至深绿色，衰老后颜色逐渐变暗，菌落背部呈黄绿色。在麦芽汁固体培养基上生长3天，菌落大小为3-7mm，中部颜色为深绿色。显微镜观察菌丝透明，具横隔，分生孢子梗从菌丝上生出，顶端生有扫帚状的分枝结构，分生孢子圆形。
3.根据权利要求1所述的一株降解金霉素的桔青霉LJ318的基因，其特征在于，菌株的rDNA-ITS序列由544个碱基（bp）组成：
CCGTAGGTGA ACCTGCGGAA GGATCATTAC CGAGTGCGGG CCCCTCGGGG CCCAACCTCC 60
CACCCGTGTT GCCCGAACCT ATGTTGCCTC GGCGGGCCCC GCGCCCGCCG ACGGCCCCCC 120
TGAACGCTGT CTGAAGTTGC AGTCTGAGAC CTATAACGAA ATTAGTTAAA ACTTTCAACA 180
ACGGATCTCT TGGTTCCGGC ATCGATGAAG AACGCAGCGA AATGCGATAA CTAATGTGAA 240
TTGCAGAATT CAGTGAATCA TCGAGTCTTT GAACGCACAT TGCGCCCTCT GGTATTCCGG 300
AGGGCATGCC TGTCCGAGCG TCATTGCTGC CCTCAAGCCC GGCTTGTGTG TTGGGCCCCG 360
TCCCCCCCGC CGGGGGGACG GGCCCGAAAG GCAGCGGCGG CACCGCGTCC GGTCCTCGAG 420
CGTATGGGGC TTCGTCACCC GCTCTAGTAG GCCCGGCCGG CGCCAGCCGA CCCCCAACCT 480
TTAATTATCT CAGGTTGACC TCGGATCAGG TAGGGATACC CGCTGAACTT AAGCATATCA 540
ATAA 544 。
4.据权利要求1所述的一株降解金霉素的桔青霉LJ318的应用，其特征在 于：菌株LJ318用于金霉素的降解中。
5.根据权利要求4所述的一株降解金霉素的桔青霉LJ318的应用，其特征在于：菌株LJ318对金霉素耐受和利用浓度范围宽，能够在以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度为25mg/L-10000mg/L的培养基中生长，对于环境中残留的微量以及高浓度金霉素均具有较好的降解作用；将菌株LJ318接种到金霉素为唯一碳源且浓度为500mg/L的液体培养基中培养，该菌株对金霉素的降解率可达88.01％。
6.根据权利要求4述的一株降解金霉素的桔青霉LJ318的应用，其特征在于：菌株LJ318能在酸性较强的新鲜的金霉素菌渣中较好生长，并对菌渣中残留的金霉素具有较好的降解作用；将活化后的菌株LJ318接种到新鲜的金霉素菌渣中30℃暗培养7天，该菌株对菌渣中金霉素的降解率可达91.80%；该菌株可应用于金霉素生产企业废弃物的处理。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130911 |