CN106282032A - 桔青霉lb及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用 - Google Patents

桔青霉lb及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106282032A
CN106282032A CN201610659139.6A CN201610659139A CN106282032A CN 106282032 A CN106282032 A CN 106282032A CN 201610659139 A CN201610659139 A CN 201610659139A CN 106282032 A CN106282032 A CN 106282032A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phillygenol
fermentation
phillyrin
medium
constant temperature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610659139.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106282032B (zh
Inventor
梅建凤
董志红
应国清
易喻
陈建澍
张彦璐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN201610659139.6A priority Critical patent/CN106282032B/zh
Publication of CN106282032A publication Critical patent/CN106282032A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106282032B publication Critical patent/CN106282032B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/80—Penicillium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种桔青霉LB及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用，所述的应用是将桔青霉LB经发酵培养后获得的湿菌体为生物催化剂，以连翘苷为底物，以甲醇为助溶剂，以含湿菌体的发酵液或将湿菌体悬浮于缓冲液中构成转化体系，于30～35℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得连翘脂素。在底物投料浓度为2g/L时，连翘脂素的转化得率为90.5％。桔青霉LB营养要求低、发酵时间短、抗污染能力强；生长快；转化反应专一性好，转化效率高，副产物少。

Description

桔青霉LB及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物化工技术领域，是关于一种以连翘苷为原料生物转化制备连翘脂素的方法。
(二)背景技术
连翘脂素(phillygenin)，又名连翘苷元(CAS号为487-39-8，分子式为C21H24O6，分子量为372.41)，属于双环氧木脂素类物质。连翘脂素具有多种生物活性，包括良好的抗氧化性，表现出非常强的DPPH、ABTS、FRAP自由基清除能力及降血脂活性；连翘脂素对人肝癌细胞(SMMC27721)、人宫颈癌细胞(Hela)、中国仓鼠肺成纤维细胞(V79)及小鼠黑色素肉瘤细胞(B16)具有体外抗肿瘤活性，也能降低高血脂症小鼠的血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，且可通过氧化途径来降低血脂水平；研究表明连翘脂素能预防或治疗由过氧化物引起的相关疾病，如类风湿关节炎，癌症，动脉粥样硬化和神经退行性疾病。
连翘脂素以游离状态存在于一些木犀科植物中，如连翘、流苏树和桂花等，因此可以从这些植物中分离获得，但其含量相对较低，如从产于河南的连翘叶提取连翘脂素的收率仅为0.162％(崔燕岩，冯少勇，赵光，等.连翘有效成分的HPLC法测定[J].药学学报，1992(8):603-608)。在上述植物中，连翘脂素更多的与葡萄糖结合成苷，即连翘苷(phillyrin，CAS号为487-41-2，分子式为C27H34O11，分子量为534.56)，含量相对较高。如从产于河南的连翘叶提取连翘苷的收率可达3.14％，是连翘脂素含量的19.4倍。虽然连翘苷也具有多种生物活性，如清热解毒、排脓化瘀、抗氧化、抗病毒等药理作用，但是其口服吸收效果较差，对一些肿瘤细胞没有抑制活性。有研究报道，连翘苷在体内转化为连翘脂素后才能发挥效用。
可以看出，连翘脂素具有更好的药理活性，如将连翘苷转化为连翘脂素，对连翘资源的深度开发具有重要意义。目前，已有酶法转化的研究报道，如采用纤维素酶转化连翘苷，转化48h，转化率可达93.6％(中国发明专利CN 105331653 A)，但该方法的纤维素酶用量较大，是底物质量的1～10倍，酶的成本无疑较高；如果采用酸水解法，存在的问题则是副产物较多，构型容易转变，生成的同分异构体难以分离。
为了提高连翘脂素的生产效率，克服现有连翘脂素生产方法的不足，本发明采用微生物法转化连翘苷为连翘脂素(反应式见图1)，筛选获得了一株转化能力高、专一性好的微生物菌株，培养获得菌体，以菌体为生物催化剂，将连翘苷转化为连翘脂素，在底物浓度为2g/L时，转化得率可达90％以上。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株产糖苷酶的微生物菌株—桔青霉(Penicilliumcitrinum)LB，及其在转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。较好地克服现有酶解法中酶消耗量大的不足，本工艺具有成本低、流程简单、转化得率高和副产物少等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株—桔青霉(Penicillium citrinum)LB，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60050，保藏日期2016年6月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
本发明所述桔青霉LB，是从土壤中分离，经过筛选得到的优良菌株。所述桔青霉LB的形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28℃条件下培养2天，即长出菌落。菌落初期为白色细绒毛状，之后表面逐渐呈灰绿色，产生大量绿色分生孢子，背面呈黄色。在显微镜下观察到菌丝有横隔，孢子梗顶端产生成串的青色分生孢子，分生孢子穗呈青霉属菌种特有的帚状。
所述桔青霉LB的18s rDNA部分核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种所述桔青霉LB在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。
所述的应用是将桔青霉LB经发酵培养后获得的湿菌体为生物催化剂，以连翘苷为底物，以甲醇为助溶剂，以含湿菌体的发酵液或将湿菌体悬浮于缓冲液中构成转化体系，于30～35℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得连翘脂素。
进一步，所述的转化体系是由含菌体的发酵液、连翘苷和甲醇构成；或将发酵液过滤，取湿菌体悬浮于等同发酵液体积、pH 6的磷酸缓冲液中，再加入连翘苷和甲醇构成转化体系。所述转化体系中生物催化剂用量以湿菌体干重计为1.51～1.64g/L。
进一步，转化体系中所述底物连翘苷的终浓度为1～2g/L，所述助溶剂甲醇的体积终浓度为1％～5％(优先选用甲醇溶解连翘苷，然后再加入转化体系)。
进一步，所述的转化反应条件为：在30～35℃、150～250r/min恒温振荡条件下转化18～24h。
进一步，所述生物催化剂按如下方法制备：将桔青霉LB接种至发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，获得发酵液，发酵液经过滤，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖6～10g/L，(NH4)2SO4 4～7g/L，NaCl 5g/L，KH2PO45g/L，MgSO4 1g/L，MnSO4 0.5g/L，溶剂为水，pH 5～7。
所述桔青霉LB菌株在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养，再经过种子培养基扩大培养，然后用种子液接入发酵培养基进行培养。
所述生物催化剂制备方法为：(1)活化培养：将桔青霉LB菌种孢子接种于平板培养基，于28～30℃恒温培养2～3天，获得平板孢子，所述的平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，其终浓度组成为：马铃薯200g/L(马铃薯洗净去皮，切成小块，加5倍质量水煮沸20-30min，4层纱布过滤去渣留汁)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然；(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后桔青霉LB孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，得种子液，所述种子培养基，除不含琼脂外，其终浓度组成和配制方法同平板培养基；(3)菌体发酵：将种子液以体积浓度5％～10％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，获得发酵液。所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖6～10g/L，(NH4)2SO4 4～7g/L，NaCl 5g/L，KH2PO45g/L，MgSO4 1g/L，MnSO4 0.5g/L，溶剂为水，pH 5～7。
进一步，优选所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖7g/L，(NH4)2SO4 5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4 1g/L，MnSO4 0.5g/L，溶剂为水，pH 6。
本发明所述的连翘脂素分离纯化的方法为：在生物转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入原转化体系体积1/4的甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，于45℃下减压干燥，(优选滤液转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后)，即得连翘脂素。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种利用桔青霉LB发酵获得生物催化剂，以连翘苷为底物制备连翘脂素的方法，在底物投料浓度为2g/L时，连翘脂素的转化得率为90.5％。相比于现有技术，采用本发明的技术优势有：桔青霉LB营养要求低、发酵时间短、抗污染能力强；生长快；转化反应专一性好，转化效率高，副产物少；本发明把活性低的连翘苷转化活性更好的连翘脂素，可大规模工业化应用，生产工艺具有周期短，转化率高，环境污染小等优点。
(四)附图说明
图1连翘苷转化为连翘脂素的化学反应式；
图2 HPLC法分析连翘脂素浓度的标准曲线；
图3转化样品的HPLC分析图谱，A为标准品连翘苷和连翘脂素的HPLC图谱；B为连翘苷转化0h的HPLC图谱；C为连翘苷经生物转化20h的HPLC图谱(实施例6样品)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1转化菌种的分离与筛选
采集花坛肥沃土壤，用无菌水稀释1×106倍后涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养4天，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，置于28℃恒温培养3天，得孢子丰富的菌株12株(菌株编号见表1)，保存于4℃冰箱中备用。
接种环分别挑取上述各个菌株的平板培养基上的孢子2环，接种到装有100mL初始发酵培养基中(250mL三角瓶装)，于30℃、200r/min振荡培养3天(不同菌株发酵液的干菌体浓度在1.42g/L～4.37g/L之间不等)，1mg的连翘苷溶于1mL甲醇后加入发酵液，使转化体系中连翘苷的浓度为10mg/L。三角瓶于30℃、200r/min恒温振荡转化18h。转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用3mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。
HPLC分析来自不同菌株发酵液转化样品中的连翘脂素浓度，计算连翘脂素的转化得率，由此比较不同菌株产酶转化连翘苷为连翘脂素的能力高低。12个菌株中，编号为LB的霉菌转化生成连翘脂素得率最高，转化液中连翘脂素的浓度为5.11mg/L，转化得率达到73.3％。
表1不同菌株转化连翘苷生成连翘脂素的浓度和得率
所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入葡萄糖20g、琼脂20g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入无菌培养皿，每皿25～30mL。
所述的初始发酵培养基按如下组成和方法配制：葡萄糖4g/L，蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4 1g/L，MnSO4 0.5g/L，pH 7，溶剂为水，250mL的三角瓶装100mL初始发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述HPLC分析方法为：LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温为室温；流动相为乙腈和水梯度洗脱(0～30min，乙腈体积分数变化为10％～100％，水体积分数变化为90％～0％；30～40min，100％乙腈)；流速0.8mL/min，检测波长277nm，进样量20μL。由相同分析条件下的标准品连翘脂素浓度-峰面积标准曲线(图2)，计算出转化样品中的连翘脂素的浓度。
所述的连翘脂素转化得率按以下公式计算：
式中，372.41为连翘脂素的分子量，534.56为连翘苷的分子量。
实施例2：菌株LB转化稳定性验证
以菌株LB为转化菌种，在100mL摇瓶发酵规模下，增加了种子扩大培养步骤，用含菌体的发酵液转化连翘苷，验证菌种的转化稳定性，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的菌株LB平板菌种接种于新鲜平板培养基，平板于28℃恒温培养2天，所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环取步骤(1)活化培养后菌株LB孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为1.83g/L的种子液。所述种子培养基，除不含琼脂外，其终浓度组成和配制方法同平板培养基，250mL的三角瓶装50mL，经高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度5％(即5mL)的接种量接种至100mL初始发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天(干菌体浓度为2.76g/L)后，加入1mg的连翘苷(溶于1mL甲醇)，使转化体系中连翘苷的浓度为10mg/L。三角瓶于30℃、200r/min恒温振荡转化18h。所述的初始发酵培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用3mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，菌株LB发酵液转化连翘苷，重复3批次实验，转化样品中连翘脂素平均浓度为4.96mg/L，转化得率平均为71.2％，3批次实验结果无显著性差异，表明菌株LB发酵转化连翘苷为连翘脂素的转化性能稳定。
实施例3：菌株LB的分类鉴定
将菌株LB接种在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28℃条件下培养2天，即可长出菌落。菌落初期为白色细绒毛状，之后表面逐渐呈灰绿色，产生大量绿色分生孢子，背面呈黄色。在显微镜下观察到菌丝有横隔，孢子梗顶端产生成串的青色分生孢子，分生孢子穗呈青霉属菌种特有的帚状。
将菌株LB交由生工生物工程(上海)有限公司进行18S rDNA测序，测得序列大小为1282bp，具体序列(SEQ ID NO:1所示)如下：
GCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTACAAACCCCGACTTCAGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTCGGGTCTCGTAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGGCCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGGATTCTATGATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATCTTTTGGATGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGCATCTGCGGGCCGCTGGCTTC。
将该序列在GenBank上进行BLAST比对，与超过100株青霉属菌株有99％以上的同源性，与6株桔青霉菌株的18S rDNA序列有100％的同源性。依据18S rDNA序列，绘制的该菌株与青霉属不同种的系统发育树显示，该菌株与桔青霉亲缘关系较近，与青霉属其他种的亲缘关系相对较远，综合菌株LB的形态特征和18S rDNA的序列分析，可以确定菌株LB为一株桔青霉(Penicillium citrinum)，定名为桔青霉LB，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60050，保藏日期2016年6月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
实施例4：桔青霉LB转化条件的优化
以桔青霉LB为转化菌种，在实施例2的基础上，优化了发酵培养基组成，提高的底物浓度，延长了转化时间，转化得率有显著提高，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的桔青霉LB平板菌种接种于新鲜平板培养基，平板于28℃恒温培养2天，所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环取步骤(1)活化培养后桔青霉LB孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为1.78g/L的种子液。所述种子培养基组成和制备方法同实施例2。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即10mL)的接种量接种至100mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2天(干菌体浓度为1.54g/L)后，加入0.2g的连翘苷溶于5mL甲醇的溶液，使转化体系中连翘脂素的浓度为2g/L(转化体系体积按100mL计)。三角瓶于35℃、250r/min恒温振荡转化18h。所述的发酵培养基终浓度组成为：蔗糖7g/L，(NH3)2SO4 5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4 1g/L，MnSO4 0.5g/L，溶剂为水，pH 6。250mL的三角瓶装100mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，用甲醇稀释120倍后用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，用桔青霉LB菌株发酵液转化连翘苷，转化样品中连翘脂素浓度为1.26g/L，转化得率为90.5％。
实施例5：菌体缓冲液体系转化
以桔青霉LB为转化菌种，在实施例4的基础上，发酵液经过滤后收获菌体，悬浮于缓冲液中转化连翘苷，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的桔青霉LB平板菌种接种于新鲜平板培养基，平板于30℃恒温培养2天，所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环取步骤(1)活化培养后桔青霉LB孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为1.86g/L的种子液。所述种子培养基组成和制备方法同实施例2。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即10mL)的接种量接种至100mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2天(干菌体浓度为1.51g/L)后，发酵液经布氏漏斗过滤，用pH 6的磷酸缓冲液100mL重新悬浮菌体于一只250mL三角瓶中，加入0.2g的连翘苷溶于5mL甲醇的溶液，使转化体系中连翘脂素的浓度为2g/L(转化体系体积按100mL计)。三角瓶于35℃、250r/min恒温振荡转化20h。所述的发酵培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，用甲醇稀释120倍后用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，用桔青霉LB菌株发酵液转化连翘苷，转化样品中连翘脂素浓度为1.24g/L，转化得率为89.0％。相比于实施例4方法，虽然转化得率略有下降，但因菌体重悬于缓冲液中，体系中杂质较少，有利于后续产物的分离。
所述的pH 6的磷酸缓冲液配制方法为：称取Na2HPO4·H2O 7.16g，用去离子水定容至100mL(A液)；称取NaH2PO4·2H2O 3.12g，用去离子水定容至100mL(B液)；取87.7mL的A液和12.3mL的B液混合，即得到100mL pH 6的磷酸缓冲液。
实施例6：生物转化法制备连翘脂素
在实施例5的基础上，发酵体系放大到400mL，制备菌体用于连翘苷的生物转化，转化体系放大到400mL，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的桔青霉LB平板菌种接种于新鲜平板培养基，平板于30℃恒温培养2天，所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环取步骤(1)活化培养后桔青霉LB孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为1.75g/L的种子液。所述种子培养基组成和制备方法同实施例2。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即40mL)的接种量接种至400mL发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天(干菌体浓度为1.64g/L)后，发酵液经布氏漏斗过滤，用400mL、pH 6的磷酸缓冲液重新悬浮菌体于一只1L三角瓶中，加入0.8g的连翘苷溶于20mL甲醇的溶液，使转化体系中连翘脂素的浓度为2g/L(转化体系体积按400mL计)。三角瓶于35℃、250r/min恒温振荡转化24h。所述的发酵培养基终浓度组成同实施例4，1L的三角瓶装400mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌25min。
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用400mL乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入100mL甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加10mL甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后得0.597g连翘脂素。
称取步骤(4)制备的连翘脂素1mg溶解于5mL甲醇中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。以标准品连翘苷和连翘脂素为对照，同时检测连翘苷转化0h和20h的HPLC图谱。分析结果表明，按本实施例方法，制备的连翘脂素纯度为85.1％，转化得率为91.2％。

Claims (10)

1.桔青霉(Penicillium citrinum)LB，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60050，保藏日期2016年6月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
2.一种权利要求1所述桔青霉LB在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是将桔青霉LB经发酵培养后获得的湿菌体为生物催化剂，以连翘苷为底物，以甲醇为助溶剂，以含湿菌体的发酵液或将湿菌体悬浮于缓冲液中构成转化体系，于30～35℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得连翘脂素。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述转化体系中生物催化剂用量以湿菌体干重计为1.51～1.64g/L。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述转化体系中，底物连翘苷的终浓度为1～2g/L，所述助溶剂甲醇的体积终浓度为1％～5％。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的转化反应条件为：在30～35℃、150～250r/min恒温振荡条件下转化18～24h。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述生物催化剂按如下方法制备：将桔青霉LB接种至发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，获得发酵液，发酵液离心，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖6～10g/L，(NH4)2SO4 4～7g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4 1g/L，MnSO4 0.5g/L，溶剂为水，pH 5～7。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述桔青霉LB菌株在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养，再经过种子培养基扩大培养，然后用种子液接入发酵培养基进行培养，所述生物催化剂制备方法为：(1)活化培养：将桔青霉LB菌种孢子接种于平板培养基，于28～30℃恒温培养2～3天，获得平板孢子，所述的平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然；(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后桔青霉LB孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，得种子液；所述种子培养基，除不含琼脂外，其终浓度组成同平板培养基；(3)菌体发酵：将种子液以体积浓度5％～10％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，获得发酵液，将发酵液过滤，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖6～10g/L，(NH4)2SO4 4～7g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4 1g/L，MnSO4 0.5g/L，溶剂为水，pH 5～7。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖7g/L，(NH4)2SO4 5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4 1g/L，MnSO4 0.5g/L，溶剂为水，pH 6。
10.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述转化液分离纯化的方法为：生物转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入原转化体系体积1/4的甲醇溶解残留物；用滤纸过滤后，于45℃下减压干燥，即得连翘脂素。
CN201610659139.6A 2016-08-11 2016-08-11 桔青霉lb及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用 Active CN106282032B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610659139.6A CN106282032B (zh) 2016-08-11 2016-08-11 桔青霉lb及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610659139.6A CN106282032B (zh) 2016-08-11 2016-08-11 桔青霉lb及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106282032A true CN106282032A (zh) 2017-01-04
CN106282032B CN106282032B (zh) 2019-05-28

Family

ID=57669474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610659139.6A Active CN106282032B (zh) 2016-08-11 2016-08-11 桔青霉lb及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106282032B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852672A (zh) * 2021-02-07 2021-05-28 山西大学 大肠杆菌及其在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用
CN113575249A (zh) * 2021-07-14 2021-11-02 运城学院 一种提升连翘果实药用价值的育苗方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103289904A (zh) * 2013-05-14 2013-09-11 北京理工大学 一株降解金霉素的桔青霉lj318
CN105367581A (zh) * 2014-08-07 2016-03-02 富力 一种连翘脂素的制备方法
CN105543108A (zh) * 2016-01-25 2016-05-04 浙江工业大学 紫变青霉ql-9204及在转化根皮苷制备根皮素中的应用
CN105838622A (zh) * 2016-04-14 2016-08-10 浙江树人大学 黑曲霉hc306及在转化柚皮苷制备柚皮素中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103289904A (zh) * 2013-05-14 2013-09-11 北京理工大学 一株降解金霉素的桔青霉lj318
CN105367581A (zh) * 2014-08-07 2016-03-02 富力 一种连翘脂素的制备方法
CN105543108A (zh) * 2016-01-25 2016-05-04 浙江工业大学 紫变青霉ql-9204及在转化根皮苷制备根皮素中的应用
CN105838622A (zh) * 2016-04-14 2016-08-10 浙江树人大学 黑曲霉hc306及在转化柚皮苷制备柚皮素中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
梅建凤 等: "微生物转化连翘苷制备连翘脂素的研究", 《工业微生物》 *
樊宏宇 等: "纤维素酶水解连翘苷制备连翘脂素的研究", 《吉林中医药》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852672A (zh) * 2021-02-07 2021-05-28 山西大学 大肠杆菌及其在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用
CN112852672B (zh) * 2021-02-07 2023-07-18 山西大学 大肠杆菌及其在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用
CN113575249A (zh) * 2021-07-14 2021-11-02 运城学院 一种提升连翘果实药用价值的育苗方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106282032B (zh) 2019-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102168022B (zh) 一株来自植物窝儿七的内生真菌斯氏青霉及其应用
CN102676392B (zh) 丹参内生真菌及其应用
CN103509741A (zh) 布劳特菌auh-jld56及其在牛蒡苷元转化中的应用
CN105838622A (zh) 黑曲霉hc306及在转化柚皮苷制备柚皮素中的应用
CN103952362A (zh) 一株对多种植物病原菌具抑菌活性的柑橘内生放线菌
CN102559828B (zh) 一种通过微生物转化黄芪总皂苷制备黄芪甲苷的方法
CN106010980B (zh) 一种内生真菌巴西类壳小圆孢菌株及其应用
CN103667070A (zh) 蛇足石杉植物内生真菌及其在制备石杉碱甲中的应用
CN106047713B (zh) 一株嗜松篮状菌菌株Li-93及其应用
US20230295675A1 (en) Endophytic bacterial strain with high camptothecin yield and use thereof
CN106085868A (zh) 一株产生抗hiv活性物质的曲霉菌及其应用
CN105255742B (zh) 一株拮抗四种镰孢属真菌的内生青霉菌及其应用
CN106086147A (zh) 利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法
CN103667072B (zh) 一种蛇足石杉内生真菌及其在制备8α,15α-环氧化石杉碱甲的应用
CN107189949A (zh) 米根霉ljh3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用
CN104726347A (zh) 一株狐粪青霉真菌菌株以及利用该菌株制备左旋7-羟基丁苯酞的方法
CN104774888A (zh) 一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法与应用
CN106282032B (zh) 桔青霉lb及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用
CN107432135A (zh) 利用真菌促进锁阳种子萌发的方法
CN101487022B (zh) 抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法
CN105543108B (zh) 紫变青霉ql-9204及在转化根皮苷制备根皮素中的应用
CN105462850B (zh) 越南槐内生真菌sdte-p在防治三七根腐病中的应用
CN108102928B (zh) 一株银杏内生真菌及其应用
CN107893033A (zh) 烟曲霉sqh4及在生物转化法制备花旗松素中的应用
CN105462854B (zh) 越南槐内生真菌sdte-p在防治三七炭疽病中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant