CN105367581A - 一种连翘脂素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种连翘脂素的制备方法，连翘脂素的制备方法包括对药材连翘进行溶剂加热回流提取后，再采用石油醚对提取物进行超声提取或回流提取，然后进行重结晶处理或柱层析分离纯化。本发明方法中连翘脂素的提取效率高，提取效果显著，分离纯化方法简便可控、重复性好，最终连翘脂素的得率显著提高，而且产物的纯度高；制备工艺方法操作过程简单，适用于工业化生产。

Description

一种连翘脂素的制备方法

技术领域

本发明涉及中药制作领域，尤其涉及一种连翘脂素的制备方法。

背景技术

中药连翘为木犀科(Oleaceae)连翘属植物连翘(Forsythiasuspensa(Thunb.)vahl)的干燥果实。该属原植物现己知有十几种，分布于世界各地。中国历届版药典规定作为连翘可入药品种均为Forsythiasuspensa(Thunb.)vahl。连翘主产于我国山西、河南、陕西、山东等地。药用分“青翘”、“老翘”两种。青翘在九月上旬，果皮呈青色尚未成熟时采下，置沸水中稍煮片刻或放蒸笼内蒸约半小时，取出晒干。老翘在十月上旬果实熟透变黄、果壳裂开时采收、晒干。筛去种子及杂质。连翘作为中药应用，已有两千年历史。

连翘作为中药应用，已有两千年历史，始见于《神农本草经》。在宋代以前，连翘药用记载较为混乱，金丝桃科、金丝桃属植物亦记做连翘。《尔雅》云:“连，异翘”；《神农本草经》上载:“主寒热，痈肿恶疮，结热，鼠瘘瘰疬。”；陶弘景曰:“连翘处处有，今用茎连花实也。”《唐本草》日:“连翘有两种，大翘、小翘。大翘叶狭长，如水苏，花黄可爱，生下湿地，著子似椿实之未开者，作房翘出众草。其小翘生岗原之上，叶花实皆似大翘而小细，山南人并用之。今京下惟用大翘子，不用茎花也。”，最先应用的是全草或果实，但据考证，应为草本金丝桃科植物。因为连翘是灌木，药用全草似乎难以讲得通，而金丝桃科金丝桃属植物多为草本，所以这两处的记载可能为金丝桃属植物。

宋代苏颂的《本草图经》所记:“连翘，今近京及河中、江宁府，泽、润、淄、衮、鼎、岳、利州，南康军皆有之。有大翘、小翘二种。(大翘)生下湿地或山岗上。叶青黄而狭长，如榆叶、水苏辈。茎赤色，高三、四尺许。花黄可爱，秋结实似莲，作房翘出众草，以此得名。根黄如篙根，八月采房阴干。其小翘生岗原之上，叶、花、实皆似大翘而细。南方生者，叶狭而小，茎短，才高一、二尺。花亦黄，实房黄黑，内含黑子如粟粒，亦名早连草，南人用花叶。考证其所附药图(鼎州连翘)及其性状描述，尤其是关于其花和种子的描述“花亦黄，实房黄黑，内含黑子如粟粒”也可以判断此鼎州连翘应该是金丝桃属植物。

自宋代开始往后连翘的记载逐渐清晰，而主流药用品种也逐渐成为今天所用的正品连翘一木犀科连翘属植物，在苏颂的《本草图经》中关于“泽州连翘”、“兖州连翘”作为连翘的新兴品种而逐渐应用，泽州位于今天的山西省境内，连翘至今以山西省为道地药材产区。另外宋代寇宗爽《本草衍义》:“连翘，亦不翘出众草，太山山谷间甚多，今止用其子，片片相比如翘，因以此得名尔，治心经客热最胜，尤益小儿。”的记述，应该指的是木犀科连翘CForsythiasuspensa)。而明代刘文泰所著《本草品汇精要》中，则明确指出山西泽州连翘为道地药材，与现今药典记述和民间使用一致。在中医临床应用中，《备急千金要方》中的连翘五香汤及《外台密要》中的治痈疽肿毒方中的连翘，均属木犀科连翘；《证治准绳》中的连翘败毒散及连翘散，《温病条辨》中治温病初起的银翘散，《疡病大全》中的连翘解毒汤，《医宗金鉴》中的连翘消毒饮及清宫方中的连翘以及现代应用的中成药银翘解毒丸和银翘解毒片所用的连翘皆属木犀科植物连翘的果实。

Murakami首次从连翘果实中得到齐墩果酸以来，连翘及其同属植物中已有六十余种成分见诸报道、其主要含萜类、苯乙醇及其甙类、木脂素类、黄酮类和一些醇、酯、醚和酮等类化合物，其中木质素类化合物含量最为丰富，我国药典也规定连翘药材中连翘苷含量不少于0.15％，是其最主要的质量控制指标。

连翘属中的木脂素成分主要为木脂内酷和双环氧木脂素。1978年，Nishibe等从连翘中分得了arctigenin，mataresinol，arctiin和matairesinoside。1985年，Tsukamoto等从连翘果实中分得了phillygenin，(+)-pinoresinol，phillyrin，(+)-pinoresnol-β-D-glucoside和(+)-epinoresinol-4-O-glucoside。1997年，刘冬雷等又从连翘果实中分得了(+)松脂素单甲基醚-β-D-葡萄糖营(pinoresinolmonomethylether-β-D-gluco-side)。近来生合成研究表明，连翘属中木脂素前体是松伯醇，已知连翘属中木脂素及其苷的3，3’位全是甲氧基取代，4，4’位可以是羟基，甲氧基取代或与糖成苷。

研究表明，在连翘提取物中，连翘脂素占有一定的比例，通常连翘脂素的比例可达10％－30％，连翘脂素是否具有药理活性尚不清楚，是否具有毒性也未见报导，因而分离连翘脂素的单体，制备高含量连翘脂素并建立其分析方法，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种连翘脂素的制备方法，本发明方法操作工艺过程简单，生产周期短。运用本发明方法，可以充分提取连翘中的连翘脂素，提取效果显著；分离纯化处理获得高纯度连翘脂素单体，显著地降低了生产成本，适宜批量制备和工业化生产。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种连翘脂素的制备的方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶或连翘果实与提取溶剂混匀后，加热，进行回流提取，收集提取液，并回收溶剂，获得连翘提取物；

2)向连翘提取物中加入石油醚混匀后，进行超声处理或进行石油醚回流提取处理，收集石油醚提取液并回收石油醚，获得连翘石油醚提取物；

3)对连翘石油醚提取物采用甲醇或乙醇进行重结晶处理，获得连翘脂素。

其中，步骤1)中所述溶剂选择质量百分比浓度为50-100％的甲醇或质量百分比浓度为50-100％的乙醇，优选为无水甲醇或无水乙醇。

特别是，步骤1)中所述溶剂与连翘叶或连翘果实的重量份配比为5-20：1，优选为8-10：1。

特别是，步骤1)中所述溶剂加热提取的次数为1-3次，优选为2-3次；所述溶剂加热提取的时间为2-3h/次。

其中，步骤2)中所述石油醚的体积与所述连翘提取物的重量之比为1-100:1，即如果连翘提取物重量为1g时，石油醚的体积为1-100ml；如果连翘提取物重量为1kg时，石油醚的体积为1-100L，优选为10-50：1，进一步优选为10-20：1。

特别是，步骤2)中所述石油醚超声处理或回流提取处理的次数为2-3次，每次超声处理或回流提取处理的时间为0.5-4h。

本发明另一方面提供一种连翘脂素的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶或连翘果实与提取溶剂混匀后，加热，进行回流提取，收集提取液，并回收溶剂，获得连翘提取物；

2)向连翘提取物中加入酸溶液进行酸水解处理，然后向水解产物中加入碱性溶液，进行中和反应至pH为7.0，放置析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂，析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂至干，所得产物经水洗、干燥，获得连翘酸水解物；

3)对连翘酸水解物进行硅胶柱层析处理，分段收集洗脱液，洗脱液分别干燥后，得到连翘脂素。

其中，步骤1)中所述溶剂选择质量百分比浓度为50-100％的甲醇或质量百分比浓度为50-100％的乙醇。

特别是，步骤1)中所述溶剂与连翘叶或连翘果实的重量份配比为5-20：1，优选为8-10：1。

特别是，步骤1)中所述溶剂加热提取的次数为1-3次，优选为2-3次；所述溶剂加热提取的时间为2-3h/次。

其中，步骤2)中所述酸溶液选择稀硫酸或稀盐酸水溶液或醇溶液，优选为稀硫酸甲醇溶液、稀硫酸乙醇溶液、稀盐酸甲醇溶液、稀盐酸乙醇溶液。

特别是，所述酸溶液选择质量百分比浓度为1％～10％的稀硫酸或稀盐酸水溶液或醇溶液，优选为质量百分比浓度为1％～10％的稀硫酸甲醇溶液、稀硫酸乙醇溶液、稀盐酸甲醇溶液、稀盐酸乙醇溶液。

特别是，所述酸水解处理的温度为30～80℃；酸水解处理时间为0.1～5h。

尤其是，所述酸溶液的体积与连翘提取物重量之比为2-7：1，优选为4-5：1。

其中，步骤2)中所述碱性溶液选择质量百分比浓度为0.01-100％的氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液。

其中，步骤3)中所述硅胶柱层析处理过程中的洗脱溶剂选择氯仿与甲醇的混合溶液。

特别是，所述洗脱溶剂氯仿与甲醇的体积之比为10：1～1：1，优选为5：1～1：1。

特别是，步骤3)中所述硅胶柱层析处理过程中的吸附剂硅胶与连翘酸水解物的重量之比为120-170：1，优选为130-160：1；所述硅胶为硅胶H、硅胶G；优选为薄层层析用硅胶H。

尤其是，硅胶柱层析处理过程中硅胶柱的柱直径与柱内硅胶高之比(即径高比)为1:5-10，优选为1：6-8。

尤其是，硅胶柱层析处理过程中洗脱流速为100-300ml/h；洗脱溶剂的用量为3-12倍柱体积。

特别是，还包括步骤4)：对步骤3)经过硅胶柱层析处理后获得连翘脂素采用甲醇或乙醇进行重结晶处理，获得连翘脂素单体。

特别是，还包括步骤4)：对步骤3)经过硅胶柱层析处理后获得连翘脂素进行高效液相或超高压液相色谱分离，获得连翘脂素单体。

其中，在进行高效液相或超高压液相色谱分离过程中，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(50mm×300mm，20μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)，流速为50.0ml/min；进样量为10ml，柱温：30℃；检测波长为278nm。

理论板数按连翘苷元峰计算应不低于3000，主峰及各杂质峰分离度不得低于1.5。接取连翘脂素组分，并以甲醇或乙醇进行重结晶。

特别是，在进行高效液相或超高压液相色谱分离过程中，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(50mm×300mm，20μm)，甲醇(A)-水(B)为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：[0min(15％A)→5min(18％A)→15min(24％A)→30min(24％A)→60min(31％A)→70min(45％A)→85min(45％A)→90min(15％A)→105min(15％A)，流速为50.0ml/min；进样量为10ml，柱温：30℃；检测波长为278nm。

理论板数按连翘苷元峰计算应不低于3000，主峰及各杂质峰分离度不得低于1.5。接取连翘脂素组分，并以甲醇或乙醇进行重结晶。

特别是，还包括步骤4)：对步骤3)经过硅胶柱层析处理后获得连翘脂素采用甲醇与活性炭或乙醇与活性炭的混合物进行重结晶处理，获得连翘脂素单体。

其中，所述经过硅胶柱层析处理后获得连翘脂素的重量与甲醇或乙醇的体积之比为1：90-190，优选1：93-188。

特别是，所述活性炭重量与甲醇或乙醇的体积之比为0.01-5：100，优选为0.05-2.5:100。

其中，所述活性炭为药用活性炭，优选为针剂活性炭。

特别是，所述活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g。

本发明又一方面提供一种连翘脂素的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶或连翘果实与提取溶剂混匀后，加热，进行回流提取，收集提取液，并回收溶剂，获得连翘提取物；

2)向连翘提取物中加入酸溶液进行酸水解处理，然后向水解产物中加入碱性溶液，进行中和反应至pH为7.0，放置析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂，析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂至干，所得产物经水洗、干燥，获得连翘酸水解物；

3)将连翘酸水解物采用甲醇与活性炭或乙醇与活性炭的混合物进行重结晶处理，获得连翘脂素单体。

其中，步骤1)中所述溶剂选择质量百分比浓度为50-100％的甲醇或质量百分比浓度为50-100％的乙醇。

特别是，步骤1)中所述溶剂与连翘叶或连翘果实的重量份配比为5-20：1，优选为8-10：1。

特别是，步骤1)中所述溶剂加热提取的次数为1-3次，优选为2-3次；所述溶剂加热提取的时间为2-3h/次。

其中，步骤2)中所述酸溶液选择稀硫酸或稀盐酸水溶液或醇溶液，优选为稀硫酸甲醇溶液、稀硫酸乙醇溶液、稀盐酸甲醇溶液、稀盐酸乙醇溶液。

特别是，所述酸溶液选择质量百分比浓度为1％～10％的稀硫酸或稀盐酸水溶液或醇溶液，优选为质量百分比浓度为1％～10％的稀硫酸甲醇溶液、稀硫酸乙醇溶液、稀盐酸甲醇溶液、稀盐酸乙醇溶液。

特别是，所述酸水解处理的温度为30～80℃；酸水解处理时间为0.1～5h。

尤其是，所述酸溶液的体积与连翘提取物重量之比为2-7：1，优选为4-5：1。

其中，步骤2)中所述碱性溶液选择质量百分比浓度为0.01-100％的氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液。

其中，步骤3)中所述连翘水解物的重量与甲醇或乙醇的体积之比为1：20-60，优选1：30-50，进一步优选为1：22-45。

特别是，所述活性炭重量与甲醇或乙醇的体积之比为0.01-5：100，优选为0.05-2.5:100。

其中，所述活性炭为药用活性炭，优选为针剂活性炭。

特别是，所述活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g。

本发明再一方面提供一种连翘脂素的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶或连翘果实与提取溶剂混匀后，加热，进行回流提取，收集提取液，并回收溶剂，获得连翘提取物；

2)向连翘提取物中加入酸溶液进行酸水解处理，然后向水解产物中加入碱性溶液，进行中和反应至pH为7.0，放置析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂，析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂至干，所得产物经水洗、干燥，获得连翘酸水解物；

3)将连翘酸水解物进行高效液相或超高压液相色谱分离，获得连翘脂素单体。

其中，步骤3)所述进行高效液相或超高压液相色谱分离过程中，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(50mm×300mm，20μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)，流速为50.0ml/min；进样量为10ml，柱温：30℃；检测波长为278nm。

理论板数按连翘苷元峰计算应不低于3000，主峰及各杂质峰分离度不得低于1.5。接取连翘脂素组分，并以甲醇或乙醇进行重结晶。

特别是，在进行高效液相或超高压液相色谱分离过程中，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(50mm×300mm，20μm)，甲醇(A)-水(B)为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：[0min(15％A)→5min(18％A)→15min(24％A)→30min(24％A)→60min(31％A)→70min(45％A)→85min(45％A)→90min(15％A)→105min(15％A)，流速为50.0ml/min；进样量为10ml，柱温：30℃；检测波长为278nm。

理论板数按连翘苷元峰计算应不低于3000，主峰及各杂质峰分离度不得低于1.5。接取连翘脂素组分，并以甲醇或乙醇进行重结晶。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明发掘和创建对手性化合物连翘脂素的制备方法。

2、本发明提供分离、纯化连翘脂素的方法，本发明方法获得产物纯度高、得率好。

3、本发明的制备工艺方法简单，精制效率高，耗能低，环保，操作工艺条件容易控制，质量可控性强。

4、本发明制备工艺在分离纯化上具有鲜明的创造性，即发明了柱层析分离纯化与重结晶纯化以最佳分离纯化条件相结合，可同时获得高含量天然连翘脂素和连翘苷，它们的含量均可达到80-99％。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述连翘脂素的制备方法，这些实施例包括了本发明的连翘脂素的柱层析分离方法，液相色谱制备方法，高纯度连翘脂素的精制方法，连翘脂素的分析方法。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的制备思路、用途范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、第一溶剂提取处理

1-1)连翘果实粉碎并过20目筛，得连翘果实粉，接着向连翘果实粉(1kg)中加入无水甲醇(质量百分比浓度100％，5kg)，混合均匀后加热，进行第一次回流提取，提取溶剂与连翘果实的重量之比为5：1，回流提取3h后进行过滤，获得第一提取液，第一药渣；

1-2)向第一药渣中加入无水甲醇(5kg)，加热，进行第二次回流提取，提取溶剂与连翘果实的重量之比为5：1，回流提取时间3h后进行过滤，获得第二提取液，第二药渣；

1-3)向第二药渣中加入无水甲醇(5kg)，加热，进行第三次回流提取，提取溶剂与连翘果实的重量之比为5：1，回流提取时间3h后进行过滤，获得第三提取液，第二药渣(弃去)；

1-4)合并第一、第二、第三提取液，接着对合并后的提取液进行减压浓缩处理，回收溶剂，然后进行干燥，得无醇连翘提取物(干膏重130g)，备用。

为了提高连翘果实中个化学物质的浸提效率，加速连翘中有效成分的浸出，将连翘粉碎，增加了连翘的表面积，促进连翘中的化学成分与提取溶剂甲醇的接触，加速连翘中的化学成分在溶剂中的溶解，节省能源、提高了回流提取的效率。

第一溶剂提取步骤中每次回流提取过程中提取溶剂与连翘果实或连翘叶的重量之比除了选择5:1之外，每次回流提取过程中提取溶剂与连翘果实或连翘叶的重量之比还可以是20:1、8:1、10:1。

2、石油醚提取处理

向连翘提取物中加入石油醚，混合均匀后进行回流提取3次，即向连翘提取物中反复加入石油醚3次，回流提取3次，每次加入的石油醚的体积与连翘提取物的重量之比为10：1，即每次回流提取时向130g连翘提取物中加入1300ml的石油醚；每次提取或回流0.5h后，进行过滤，收集相应的石油醚提取液，并合并3次石油醚提取液；

对合并后的石油醚提取液进行减压浓缩处理，回收溶剂，然后干燥，获得石油醚提取物(2.3g)。

本实施例中石油醚回流提取时间选择0.5h/次为例进行说明，为了能提高回流提取效率，即提高石油醚的提取效率和提取物含量，石油醚回流提取时间可以相应延长，例如0.5-4h，本发明方法中采用石油醚进行回流提取的时间0.5-4h/次均适用于本发明。

3、重结晶处理

向石油醚提取物中加入无水甲醇，溶解，进行重结晶处理，静置结晶，获得连翘脂素(0.42g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为97.4％。

HPLC检测条件为：仪器：岛津SPD20AT泵，SPD20A检测器；连翘脂素的测定方法：其特征在于对照品溶液的制备：精密称取连翘脂素对照品适量，加25％乙腈制成每1毫升含0.05毫克的溶液，即得；供试品溶液的制备：精密称取供试品适量，加25％乙腈制成每1毫升含0.05毫克的溶液，即得；色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×150mm，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)，流速为1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长为278nm。

理论板数按连翘苷元峰计算应不低于3000，主峰及各杂质峰分离度不得低于1.5。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

实施例2

第一溶剂提取处理步骤除了提前次数为2次，每次提取过程中提取溶剂甲醇与连翘果实的重量之比为10：1，回流提取2h，获得连翘提取物139g之外，其余与实施例1相同；

石油醚提取处理步骤除了每次加入的石油醚的体积与连翘提取物的重量之比为20：1；每次提取时间为4h；获得石油醚提取物2.5g之外，其余与实施例1相同；

重结晶处理步骤除了向石油醚提取物中加入无水乙醇，采用无水乙醇进行重结晶之外，其余与实施例1相同，获得含量为98.8％的连翘脂素(0.45g)。

实施例3

1、第一溶剂提取处理

1-1)连翘叶粉碎并过20目筛，得连翘叶粉，接着向连翘叶(1kg)中加入无水乙醇(质量百分比浓度100％，20kg)，混合均匀后加热，进行第一次回流提取，提取溶剂与连翘叶的重量之比为20：1，回流提取2h后进行过滤，获得第一提取液，第一药渣；

1-2)向第一药渣中加入无水乙醇(20kg)，加热，进行第二次回流提取，提取溶剂与连翘叶的重量之比为20：1，回流提取时间2h后进行过滤，获得第二提取液，第二药渣；

1-3)向第二药渣中加入无水乙醇(20kg)，加热，进行第三次回流提取，提取溶剂与连翘叶的重量之比为20：1，回流提取时间2h后进行过滤，获得第三提取液，第二药渣(弃去)；

1-4)合并第一、第二、第三提取液，接着对合并后的提取液进行减压浓缩处理，回收溶剂，然后进行干燥处理，获得无醇连翘提取物(干膏重146g)，备用。

2、石油醚超声处理

将连翘提取物和石油醚加入到超声提取仪中，开启电源，进行石油醚超声波提取处理，共提取3次，即向连翘提取物中反复加入石油醚3次，超声提取3次，每次提取4h，每次超声提取过程中石油醚体积与连翘提取物的重量比为10:1，即每次超声提取时向146g连翘提取物中加入1460ml的石油醚；每次超声提取后进行过滤，收集相应的石油醚提取液，并合并3次石油醚提取液；

对合并后的石油醚提取液进行减压浓缩处理，回收溶剂，然后干燥，获得石油醚提取物(2.5g)。

本实施例中石油醚超声提取时间选择4h/次为例进行说明，为了能提高回流提取效率，即提高石油醚的提取效率和提取物含量，石油醚超声提取时间可以相应延长或缩短，例如0.5-4h，本发明方法中采用石油醚进行超声提取的时间0.5-4h/次均适用于本发明。

3、重结晶处理

向石油醚提取物中加入无水乙醇，溶解，进行重结晶处理，静置结晶，获得连翘脂素(0.49g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为96.8％。

实施例4

第一溶剂提取处理步骤除了提前次数为3次，每次提取过程中提取溶剂甲醇与连翘果实的重量之比为8：1，回流提取3h，获得连翘提取物143g之外，其余与实施例3相同；

除了石油醚超声处理步骤中每次加入的石油醚体积与连翘提取物的重量之比为：20：1；每次提取时间为0.5h；获得石油醚提取物2.6g之外，其余与实施例3相同；

重结晶处理步骤除了向石油醚提取物中加入无水甲醇，采用无水甲醇进行重结晶之外，其余与实施例3相同，获得含量为96.7％的连翘脂素(0.54g)。

实施例5

1、第一溶剂提取处理

1-1)连翘果实粉碎并过20目筛，得连翘果实粉，接着向连翘果实粉(1kg)中加入质量百分比浓度为50％甲醇溶液(10kg)，混合均匀后加热，进行第一次回流提取，提取溶剂与连翘果实的重量之比为10：1，回流提取3h后进行过滤，获得第一提取液，第一药渣；

1-2)向第一药渣中加入质量百分比浓度为50％甲醇溶液(10kg)，加热，进行第二次回流提取，提取溶剂与连翘果实的重量之比为10：1，回流提取时间3h后进行过滤，获得第二提取液，第二药渣；

1-3)向第二药渣中加入质量百分比浓度为50％甲醇溶液(10kg)，加热，进行第三次回流提取，提取溶剂与连翘果实的重量之比为10：1，回流提取时间3h后进行过滤，获得第三提取液，第二药渣(弃去)；

1-4)合并第一、第二、第三提取液，接着对合并后的提取液进行减压浓缩处理，回收溶剂，然后进行干燥、粉碎处理，获得连翘提取物(干重112g)，备用。

2、酸水解处理

向连翘提取物(112g)中加入质量百分比浓度为1％的稀盐酸甲醇溶液(560ml)，混合均匀后置于回流提取装置中，在温度保持为80℃下进行水解处理，其中稀盐酸甲醇溶液的体积与连翘提取物的重量之比为5：1，水解处理0.1h后，向水解混合物溶液中加入质量百分比浓度为10％的氢氧化钠的甲醇溶液，进行中和处理，调节混合溶液的pH为7.0，然后将中和处理后的混合溶液进行浓缩处理(即采用旋转蒸发仪，在减压状态下回收溶剂)，浓缩至无醇、室温下(15-30℃)静置放置(12-24h)析出沉淀、过滤、沉淀用3-5倍量的水洗3-5次、干燥处理，获得连翘水解物(67g，干重)。

本发明酸水解处理时所用酸性甲醇溶液，也可以是酸性乙醇溶液，或不限比例的含水甲醇溶液、或不限比例的含水乙醇溶液，或水溶液。

本发明酸水解处理后的混合溶液进行中和反应，调节溶液pH的碱性溶液，除了本实施例中所述的氢氧化钠溶液之外，其他碱性溶液均适用于本发明，例如氢氧化钾、碳酸钠等。

本发明水解中和后处理，可采取浓缩至无醇后放置析出、或浓缩至干，两种方式。其所得产物以3-5倍量水洗3-5次，干燥。

3、硅胶柱层析处理

3-1)将连翘水解物(6.7g)置于硅胶柱顶部，以氯仿与甲醇的混合溶液为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析处理，即将连翘水解物上样硅胶柱内硅胶顶部，将连翘水解物粉末6.7g置于硅胶柱内的硅胶上端，其中硅胶柱内的吸附剂硅胶为薄层层析用硅胶H(青岛海洋化工有限公司)，硅胶柱的柱直径与柱内硅胶高之比1：6；硅胶柱的柱体积为0.95L，吸附剂硅胶与连翘水解物的重量之比为130：1，洗脱溶剂中氯仿与甲醇的体积之比为1:1，洗脱剂用量3L，洗脱流速为300ml/h，每50mL洗脱液收集一流份，共收集15个流份；

本发明硅胶除了使用硅胶H之外，还可以使用硅胶G。

3-2)采用薄层色谱法(TLC法)检测硅胶柱洗脱流份中连翘脂素的含有情况，将洗脱液合并为2个部分：第一部分为只含有连翘脂素单一成分(即连翘脂素流份)、第二部分为含连翘脂素的混合部分，其中，TLC法使用的薄层板为硅胶G板，展开剂为氯仿、甲醇的混合液，氯仿与甲醇的体积比为8.5:1.5，上行展开后，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热10分钟后显色清晰；

3-3)将合并后连翘脂素流份、采用旋转蒸发仪在减压状态下蒸干(即浓缩处理)，获得连翘脂素粗品(1.6g)；

4、重结晶处理

向连翘脂素粗品(1.6g)中缓慢加入无水甲醇，并搅拌，使得连翘脂素粗品完全溶于无水甲醇(100ml)中，然后于室温下静置析晶，即进行重结晶处理，获得连翘脂素纯品(1.2g)。

重结晶溶剂除了无水甲醇之外，还可以采用无水乙醇。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为98.0％。

实施例6

1、第一溶剂提取处理

1-1)连翘叶粉碎并过20目筛，得连翘叶粉，接着向连翘叶粉(1kg)中加入质量百分比浓度为50％乙醇溶液(8kg)，混合均匀后加热，进行第一次回流提取，提取溶剂与连翘果实的重量之比为8：1，回流提取2h后进行过滤，获得第一提取液，第一药渣；

1-2)向第一药渣中加入质量百分比浓度为50％乙醇溶液(8kg)，加热，进行第二次回流提取，提取溶剂与连翘果实的重量之比为8：1，回流提取2h后进行过滤，获得第二提取液，第二药渣；

1-3)向第二药渣中加入质量百分比浓度为50％乙醇溶液(8kg)，加热，进行第三次回流提取，提取溶剂与连翘果实的重量之比为8：1，回流提取2h后进行过滤，获得第三提取液，第二药渣(弃去)；

1-4)合并第一、第二、第三提取液，接着对合并后的提取液进行减压浓缩处理，回收溶剂，然后进行干燥处理，获得无醇连翘提取物(干重206g)，备用。

2、酸水解处理

向连翘提取物(206g)中加入质量百分比浓度为10％的稀盐酸水溶液(824ml)，混合均匀后置于恒温水浴锅内，加热，搅拌，在温度保持为30℃下进行水解处理，其中稀盐酸溶液的体积与连翘提取物的重量之比为4：1，水解处理5h后，向水解混合物溶液中加入50％氢氧化钠水溶液，进行中和处理，直至混合溶液的pH为7.0，然后将中和处理后的混合溶液室温下(15-30℃)静置放置(12-24h)析出沉淀、过滤、沉淀用3-5倍量的水洗3-5次、干燥处理，获得连翘水解物(81g，干重)。

3、硅胶柱层析处理

3-1)将连翘水解物(8.1g)置于硅胶柱顶部，以氯仿与甲醇的混合溶液未洗脱溶剂，进行硅胶柱层析处理，即将连翘水解物上样硅胶柱内硅胶顶部，即将连翘水解物(8.1g)粉末置于硅胶柱内的硅胶上端，其中硅胶柱内的吸附剂硅胶为薄层层析用硅胶H(青岛海洋化工有限公司)，硅胶柱的柱直径与柱内硅胶高之比(径高比)1：8；硅胶柱的柱体积为1.25L，吸附剂硅胶与连翘水解物的重量之比为143:1，洗脱溶剂中氯仿与甲醇的体积之比为5:1，洗脱剂用量15L，洗脱流速为300ml/h，每50mL洗脱液收集一流份，共收集70个流份；

3-2)采用薄层色谱法(TLC法)检测硅胶柱洗脱流份中连翘脂素的含有情况，将洗脱液合并为2个部分：第一部分为只含有连翘脂素单一成分(即连翘脂素流份)、第二部分为含连翘脂素的混合部分，其中，TLC法使用的薄层板为硅胶G板，展开剂为氯仿、甲醇的混合液，氯仿与甲醇的体积比为8.5:1.5，上行展开后，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热10分钟后显色；

3-3)将合并后连翘脂素流份、采用旋转蒸发仪在减压状态下蒸干(即浓缩处理)，获得连翘脂素粗品(3.4g)；

4、高压液相色谱制备

4-1)将连翘脂素粗品(1.0mg)溶于10ml质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液中，注入制备型高效液相色谱仪中，以乙腈(A)-水(B)为流动相进行梯度洗脱，收集含有连翘脂素的流份，合并后干燥，获得含量为99.3％的连翘脂素纯品(325mg)，其中高压液相色谱分离的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(50mm×300mm，20μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)，流速为50.0ml/min；进样量为10ml，柱温：30℃；检测波长为282nm；处理量：12g/d；。

理论板数按连翘苷元峰计算应不低于3000，主峰及各杂质峰分离度不得低于1.5。进样10ml，注入液相色谱仪，测定。

实施例7

第一溶剂提取处理步骤除了提取原料为1kg的连翘果实，提取溶剂选择无水甲醇，提取次数为2次，每次提取时间为2h，每次提取过程中无水甲醇的重量为15kg(即提取溶剂与连翘果实的重量之比为15：1)，连翘提取物(干膏重225g)之外，其余与实施例6相同；

酸水解处理步骤除了酸溶液选择质量百分比浓度为1％的稀硫酸溶液，稀硫酸溶液的体积为1125ml，稀硫酸溶液的体积与连翘提取物的重量之比为5：1，酸水解温度为60℃，酸水解时间为3h，获得连翘水解物(87g，干重)之外，其余与实施例6相同；

硅胶柱层析处理步骤除了将连翘水解物(8.7g)置于硅胶柱顶部，硅胶柱的柱直径与柱内硅胶高之比1：6；硅胶柱的柱体积为1.56L，吸附剂硅胶与连翘水解物的重量之比为160:1，洗脱溶剂中氯仿与甲醇的体积之比为3:1，洗脱剂用量10L，洗脱流速为300ml/h，每50mL洗脱液收集一流份，共收集41个流份；获得连翘脂素粗品3.6g之外，其余与实施例6相同。

高压液相色谱制备步骤除了将连翘脂素粗品(1.0g)溶于10ml质量百分比浓度为25％的甲醇水溶液中，以甲醇(A)与水(B)的混合溶液为流动相(洗脱溶剂)进行梯度洗脱，洗脱梯度为：[0min(15％A)→5min(18％A)→15min(24％A)→30min(24％A)→60min(31％A)→70min(45％A)→85min(45％A)→90min(15％A)→105min(15％A)之外，其余与实例6相同。获得含量为97.8％的连翘脂素纯品(334mg)。

实施例8

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(6.7g)，向其中缓慢加入无水甲醇，并搅拌，使得连翘脂素粗品完全溶于无水甲醇(150ml)中，接着加入针剂活性炭(15mg)，活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g，孔径<20A°，活性炭与甲醇的体积之比为0.01：100，搅拌15min后，过滤，然后于室温(15-30℃)下静置析晶，即进行重结晶处理，获得连翘脂素纯品(0.9g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为98.1％。

实施例9

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(6.7g)，向其中缓慢加入无水甲醇，并搅拌，使得连翘脂素粗品完全溶于无水甲醇(300ml)中，接着加入活性炭(15g)，活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g，孔径<20A°，活性炭的重量与甲醇的体积之比为5：100，搅拌15min后，过滤，然后于室温(15-35℃)下静置析晶，即进行重结晶处理，获得连翘脂素纯品(0.8g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为97.9％。

实施例10

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(6.7g)，向其中缓慢加入无水乙醇，并搅拌，使得连翘脂素粗品完全溶于无水乙醇(150ml)中，接着加入活性炭(75mg)，活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g，孔径<20A°，活性炭的重量与乙醇的体积之比为0.05：100，搅拌15min后，过滤，然后于室温下静置析晶，即进行重结晶处理，获得连翘脂素纯品(0.55g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为98.6％。

实施例11

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(6.7g)，向其中缓慢加入无水乙醇，并搅拌，使得连翘脂素粗品完全溶于无水乙醇(300ml)中，接着加入活性炭(7.5g)，活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g，孔径<20A°，活性炭的重量与乙醇的体积之比为2.5：100，搅拌15min后，过滤，然后于室温下静置析晶，即进行重结晶处理，获得连翘脂素纯品(0.53g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为98.9％。

实施例12

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(6.7g)，并重复实施例5中的柱层析步骤，获得连翘脂素粗品(1.6g)，向其中缓慢加入无水甲醇，并搅拌，使得连翘脂素粗品完全溶于无水甲醇(150ml)中，接着加入针剂活性炭(15mg)，活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g，孔径<20A°，活性炭与甲醇的体积之比为0.01：100，搅拌15min后，过滤，然后于室温(15-30℃)下静置析晶，即进行重结晶处理，获得连翘脂素纯品(0.9g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为98.1％。

实施例13

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(6.7g)，并重复实施例5中的柱层析步骤，获得连翘脂素粗品(1.6g)，向其中缓慢加入无水甲醇，并搅拌，使得连翘脂素粗品完全溶于无水甲醇(300ml)中，接着加入活性炭(15g)，活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g，孔径<20A°，活性炭的重量与甲醇的体积之比为5：100，搅拌15min后，过滤，然后于室温(15-35℃)下静置析晶，即进行重结晶处理，获得连翘脂素纯品(0.8g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为97.9％。

实施例14

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(6.7g)，并重复实施例5中的柱层析步骤，获得连翘粗品(1.6g)，向其中缓慢加入无水乙醇，并搅拌，使得连翘脂素粗品完全溶于无水乙醇(150ml)中，接着加入活性炭(75mg)，活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g，孔径<20A°，活性炭的重量与乙醇的体积之比为0.05：100，搅拌15min后，过滤，然后于室温下静置析晶，即进行重结晶处理，获得连翘脂素纯品(0.55g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为98.6％。

实施例15

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(6.7g)，并重复实施例5中的柱层析步骤，获得连翘粗品(1.6g)，向其中缓慢加入无水乙醇，并搅拌，使得连翘脂素粗品完全溶于无水乙醇(300ml)中，接着加入活性炭(7.5g)，活性炭的亚兰脱色为≥14ml/g，孔径<20A°，活性炭的重量与乙醇的体积之比为2.5：100，搅拌15min后，过滤，然后于室温下静置析晶，即进行重结晶处理，获得连翘脂素纯品(0.53g)。

采用HPLC法检查制得的连翘脂素的含量，连翘脂素的含量为98.9％。

实施例16

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(1.0g)，溶于10ml质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液中，注入制备型高效液相色谱仪中，以乙腈(A)-水(B)为流动相进行梯度洗脱，收集含有连翘脂素的流份，合并后干燥，获得含量为99.3％的连翘脂素纯品(330mg)，其中高压液相色谱分离的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(50mm×300mm，20μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)，流速为50.0ml/min；进样量为10ml，柱温：30℃；检测波长为282nm；处理量：12g/d。

理论板数按连翘苷元峰计算应不低于3000，主峰及各杂质峰分离度不得低于1.5。进样10ml，注入液相色谱仪，测定。

实施例17

称取实施例5步骤2)获得的连翘水解物(1.0g)，高压液相色谱制备步骤除了以甲醇(A)与水(B)的混合溶液为流动相(洗脱溶剂)进行梯度洗脱，洗脱梯度为：[0min(15％A)→5min(18％A)→15min(24％A)→30min(24％A)→60min(31％A)→70min(45％A)→85min(45％A)→90min(15％A)→105min(15％A)之外，其余与实例6相同。获得含量为97.8％的连翘脂素纯品(333mg)。

尽管上述对本发明做了详细说明，但不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种连翘脂素的制备方法，其特征在于包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶或连翘果实与提取溶剂混匀后，加热，进行回流提取，收集提取液，回收溶剂，获得连翘提取物；

2)向连翘提取物中加入石油醚混匀后，进行超声处理或进行石油醚回流提取处理，收集石油醚提取液并回收石油醚，获得连翘石油醚提取物；

3)对连翘石油醚提取物采用甲醇或乙醇进行重结晶处理，获得连翘脂素。

2.一种连翘脂素的制备方法，其特征在于包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶或连翘果实与提取溶剂混匀后，加热，进行回流提取，收集提取液，并回收溶剂，获得连翘提取物；

2)向连翘提取物中加入酸溶液进行酸水解处理，然后向水解产物中加入碱性溶液，进行中和反应至pH为7.0，放置析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂，析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂至干，所得产物经水洗、干燥，获得连翘酸水解物；

3)对连翘酸水解物进行硅胶柱层析处理，分段收集洗脱液，洗脱液分别干燥后，得到连翘脂素。

3.一种连翘脂素的制备方法，其特征在于包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶或连翘果实与提取溶剂混匀后，加热，进行回流提取，收集提取液，并回收溶剂，获得连翘提取物；

2)向连翘提取物中加入酸溶液进行酸水解处理，然后向水解产物中加入碱性溶液，进行中和反应至pH为7.0，放置析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂，析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂至干，所得产物经水洗、干燥，获得连翘酸水解物；

3)将连翘酸水解物采用甲醇与活性炭或乙醇与活性炭的混合物进行重结晶处理，获得连翘脂素单体。

4.一种连翘脂素的制备方法，其特征在于包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶或连翘果实与提取溶剂混匀后，加热，进行回流提取，收集提取液，并回收溶剂，获得连翘提取物；

2)向连翘提取物中加入酸溶液进行酸水解处理，然后向水解产物中加入碱性溶液，进行中和反应至pH为7.0，放置析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂，析出沉淀并过滤，沉淀水洗后进行干燥或减压回收溶剂至干，所得产物经水洗、干燥，获得连翘酸水解物；

3)将连翘酸水解物进行高效液相或超高压液相色谱分离，获得连翘脂素单体。

5.如权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述溶剂选择质量百分比浓度为50-100％的甲醇或质量百分比浓度为50-100％的乙醇。

6.如权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述溶剂与连翘叶或连翘果实的重量份配比为5-20：1。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述石油醚超声处理或回流提取处理的次数为2-3次，每次超声处理或回流提取处理的时间为0.5-4h。

8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述酸溶液选择硫酸水溶液、硫酸醇溶液、盐酸水溶液、盐酸醇溶液。

9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述酸水解处理的温度为30～80℃；酸水解处理时间为0.1～5h。

10.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述硅胶柱层析处理过程中的洗脱溶剂选择氯仿与甲醇的混合溶液。