CN102085226B

CN102085226B - 日本毛连菜提取物及其提取方法

Info

Publication number: CN102085226B
Application number: CN2011100241786A
Authority: CN
Inventors: 高建平; 席啸虎; 葛睿; 刘恩荔
Original assignee: Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Medical University
Priority date: 2011-01-21
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2031-01-21
Also published as: CN102085226A

Abstract

本发明公开了一种日本毛连菜提取物及其提取方法，所述的提取物包括日本毛连菜的水提物水洗脱部分和总黄酮。日本毛连菜的水提物水洗脱部分的提取方法是将日本毛连菜加15-20倍量的蒸馏水提取，提取液合并、离心后取上清，浓缩至1g生药材/ml后，经树脂分离、洗脱，浓缩洗脱液即得。日本毛连菜总黄酮的提取方法是将日本毛连菜用20-30倍量30%-60%的乙醇提取，提取液离心后浓缩至无乙醇残留，用水稀释至1g生药材/ml后用3-5倍95%乙醇醇沉去多糖，取上清，浓缩蒸干，用水溶解至含黄酮20-30mg/ml，经树脂分离，分别用水、乙醇洗脱，留取乙醇洗脱部分，即得。本发明所述的日本毛连菜提取物可用于降血糖药物。

Description

日本毛连菜提取物及其提取方法

技术领域

本发明涉及一种日本毛连菜的提取物及其提取方法。

背景技术

毛连菜属植物包括日本毛连菜、毛连菜（原亚种毛连菜、单毛毛连菜）、滇苦菜、新疆毛连菜，一年生、两年生、多年生分枝草本。

日本毛连菜（Picris japoncia Thunb）为菊科植物，又名：枪刀菜。在我国主要分布于河北、山西、陕西、吉林、黑龙江等地，其中山西主要分布在太原及周边县市，交城，五台等地区。生于山坡草地、灌丛中或田边、河边，海拔650～3650米。日本及俄罗斯也有分布。全草入蒙药，具有清热、消肿及止痛作用。目前还没有关于日本毛连菜提取物的降血糖作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有降血糖作用日本毛连菜提取物，同时提供该提取物的提取方法。

为实现上述目的，本发明所述的一种日本毛连菜提取物包括日本毛连菜的水提物水洗脱部分和总黄酮。

水提取物水洗脱部位主要包括糖类化合物和黄酮类化合物，其出膏率为16g稠膏/100g生药材以上，多糖含量占30%以上，黄酮含量占5%以上，有明显的降血糖作用，对正常小鼠血糖值没影响。日本毛连菜总黄酮提取物中总黄酮含量占50%以上，有明显的降血糖作用，对正常小鼠血糖值没影响。本发明首次公开了日本毛连菜提取物的降血糖作用，毒理学实验证明其为无毒物质，并进一步筛选日本毛连菜降血糖的有效部位，最终确定为日本毛连菜水提物水洗脱组分以及日本毛连菜总黄酮2个有效部位。

日本毛连菜的水提物水洗脱部分的提取方法是：将日本毛连菜洗净，晾干，切成均匀小段，加适量的蒸馏水浸泡，加15-20倍量的蒸馏水提取2-3次，每次2-3h，提取液合并、离心后取上清，浓缩，浓缩至1g生药材/ml后，经20倍量大孔吸附树脂分离，用3-4倍柱体积蒸馏水洗脱，浓缩洗脱液即得。提取方法是回流提取、温浸提取或者超声提取。日本毛连菜生药材清洗的过程要采用活水快速冲洗，不可浸泡，以免损失水溶性的成分。

日本毛连菜总黄酮的提取方法是：将日本毛连菜洗净，切成均匀小段，用20-30倍量30%-60%的乙醇提取2-3次，每次2-3h，提取液离心后浓缩至无乙醇残留，用水稀释至1g生药材/ml后用3-5倍95%乙醇醇沉去多糖，取上清，浓缩蒸干，用水溶解至含黄酮20-30mg/ml，经大孔吸附树脂分离，分别用2-5倍柱体积水洗脱、4-6倍柱体积50%-95%乙醇洗脱，留取乙醇洗脱部分，即得。提取方法是70℃以上温浸提取或者回流提取。日本毛连菜生药材清洗的过程要采用活水快速冲洗，不可浸泡，以免损失水溶性的成分。

(1)总黄酮提取工艺的考察：通过对乙醇浓度（30%-95%）、提取时间（0.5-3h）以及次数（2-4次）、料液比（10-50倍量）、提取温度（40-90℃以及回流提取）、粒度等因素进行考察，建立正交实验，以黄酮的含量以及纯度作为评价指标，通过极差分析和方差分析，最终确定的提取工艺为：用20-40倍量醇浓度为30%-60%乙醇提取2-3次，每次2-3h，提取温度为70-100℃。乙醇浓度和提取温度对总黄酮的提取效率影响较大，是大生产中条件控制的重点，乙醇浓度在30%-60%提取得到最多的黄酮，醇浓度过大或者过小都会明显降低黄酮得率，提取温度在达到70℃时，黄酮得率基本达到最高，低于70℃，黄酮得率明显降低，高于70℃时，黄酮得率几乎不变或者略微降低，但是出膏率明显增大，为进一步的黄酮纯化带来很大的麻烦，所以不建议为了方便选择回流提取的方法。

(2)纯化工艺的考察：

1）树脂的筛选：以树脂的吸附量和解析率作为指标，检测了D₁₀₁、HPD-450、HPD-700、AB-8、聚酰胺（14-30目），最终确立为D₁₀₁大孔吸附树脂。

2）95%醇沉用量的考察：考察了2-5倍量95%乙醇醇沉去多糖，以黄酮含量和纯度作为评价指标，最终确定为3-4倍量95%乙醇醇沉去多糖，这样既可以去除尽可能完全的多糖类成分，又最大限度的减少黄酮的损失。

3）梯度洗脱中水用量的考察：以黄酮含量和纯度作为评价指标，考察了0.2-8倍柱体积的水用量，确定为2-5倍柱体积的水用量可以最大限度的弃去单糖类成分以及降低黄酮的损失。

4）梯度洗脱中乙醇浓度以及用量的考察：以黄酮含量和纯度作为评价指标，分别用10%-95%的醇浓度进行洗脱，最终确定50%-75%的乙醇洗脱5个柱体积以上，得到的黄酮含量和纯度最高，纯度可达50%以上。

日本毛连菜中多糖类及黄酮类化合物的含量测定：

日本毛连菜总黄酮含量测定，包括如下步骤：

1）芦丁对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的芦丁标准品18.60mg，用60%的乙醇(v/v) 溶解，并转移至100 ml容量瓶中定容，摇匀，制成0.186mg/ml的芦丁对照品溶液。

2）芦丁标准曲线的制备

精密吸取芦丁标准溶液0ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml分别置干燥试管中,各加60﹪乙醇至5.0ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，6 min后加10％的硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，6 min后加4％的氢氧化钠溶液4ml，摇匀，加蒸馏水定容至10ml，摇匀，放置15 min，试样空白作参比，在波长505nm处测定其吸光度。以浓度C(μg/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标得芦丁标准曲线回归方程：Y＝0.0146X-0.0062（r＝0.9991）,结果显示芦丁在9.3～93μg/ml之间线性关系良好。

3）日本毛连菜总黄酮含量测定

精密量取日本毛连菜总黄酮供试品溶液适量，按照标准曲线方法显色后测定其吸光度，代入回归方程，计算总黄酮含量。

日本毛连菜多糖含量测定，包括如下步骤：

1）葡萄糖对照品溶液的制备

精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品0.0104 g，加适量水溶解，转移至100 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得104 μg/ml的溶液。

2）葡萄糖准曲线的制备

取葡萄糖对照品溶液0.1 ml，0.2 ml，0.4 ml，0.6 ml，0.8 ml，1.0 ml各加蒸馏水至2.0 ml，然后各加苯酚1.0 ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 ml，摇匀，置沸水浴中加热15 min，然后冷却至室温。在490 nm处测定吸光度值。以一系列葡萄糖对照品溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线，并进行回归处理。

得葡萄糖标准曲线回归方程式：Y=0.0156x－0.0076 (r=0.9994)，葡萄糖在5.2 μg/ml~52 μg/ml之间线性关系良好。

3）日本毛连菜多糖含量测定

精密量取日本毛连菜总供试品溶液适量，按照标准曲线方法显色后测定其吸光度，代入回归方程，计算总黄酮含量。

日本毛连菜水提物水洗脱组分降糖作用的确立，其方法如下：

四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的建立：四氧嘧啶的注射量直接关系到小鼠的成模率、死亡率、成模后血糖值以及给药后的降糖效果，给药量大虽然可以使成模率升高，但是血糖值过高，死亡率增加，完不成整个给药过程，通过对四氧嘧啶用量的考察，最终确定为尾静脉注射四氧嘧啶40-60mg/kg，0.1ml/10g的给药量，成模率达到70%以上，成模后血糖值适宜、稳定，几乎没有死亡，能完成整个实验过程，可以充分证明药物的降糖效果。

实验分组与给药：按血糖值随机分组，（1）实验动物：动物采用清洁级昆明种小白鼠，18-22g，雌雄各半；（2）糖尿病模型的建立：采用尾静脉注射四氧嘧啶40-60mg/kg致糖尿病小鼠模型；（3）分组与给药：日本毛连菜水提物水洗脱给药组（0.8-12g生药材/kg）、格列本脲阳性药组（2-5mg/kg）、正常组、模型组，每天灌胃给药一次，连续给药7-14天；（4）血样采集及测定：最后一次给药前禁食8-10h，给药后继续禁食2-4h，眼眶后静脉丛采血，2000-3000r/min离心至血清分离，取血清按葡萄糖试剂盒法测定空腹血糖值；（5）统计方法：全部数据用t检验进行比较，采用SPSS11.0统计软件包进行统计分析，统计结果用平均值±标准差（

± s）表示。

5.日本毛连菜总黄酮降糖作用的确立，其方法如下：

实验分组与给药：按血糖值随机分成7组：格列本脲阳性对照组（2-5mg/kg）、二甲双胍阳性药组（300mg/kg）、日本毛连菜总黄酮（25-400mg/kg）、模型组、正常组。连续给药14d，于第7d和第14d分别测定各组的空腹血糖值。其余同上。

本发明获得了日本毛连菜的具有降血糖作用的2个有效部位，具有明显的降血糖效果，降糖效果与日本毛连菜水提物以及格列本脲阳性药组没有统计学的差异（表1、表2所示），2个有效部位的水溶性都非常好，总黄酮的纯度达到50%以上，纯度较高。

与正常对照组比较：##P＜0.05；与模型对照组比较：**P＜0.05；与水提物组比较：ΔP＜0.05

与正常对照组比较：##P＜0.05；与模型对照组比较：**P＜0.05

具体实施方式

实施例1：

日本毛连菜水提物的制备，包括如下步骤：将药材日本毛连菜5000g清水冲洗干净，晾干，切成均匀小段，加15倍量的蒸馏水浸泡（以全部浸泡药材为宜），回流提取2次，每次2h，去渣、合并滤液、澄清、过滤、减压浓缩至稠膏（1g生药材/ml），即得日本毛连菜水提取物；

日本毛连菜水提取物水洗脱部位的制备，包括如下步骤：日本毛连菜水提取物经20倍量D₁₀₁大孔吸附树脂柱分离，用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，浓缩洗脱液即得日本毛连菜水提物水洗脱组分，得浸膏700g以上。

实施例2：

日本毛连菜水提物的制备，包括如下步骤：将药材日本毛连菜5000g清水冲洗干净，晾干，切成均匀小段，加20倍量的蒸馏水浸泡（以全部浸泡药材为宜），温浸提取2次，每次3h，去渣、合并滤液、澄清、过滤、减压浓缩至稠膏（1g生药材/ml），即得日本毛连菜水提取物；

日本毛连菜水提取物水洗脱部位的制备，包括如下步骤：日本毛连菜水提取物经20倍量D₁₀₁大孔吸附树脂柱分离，用4倍柱体积的蒸馏水洗脱，浓缩洗脱液即得日本毛连菜水提物水洗脱组分，得浸膏700g以上。

实施例3：

日本毛连菜水提物的制备，包括如下步骤：将药材日本毛连菜5000g清水冲洗干净，晾干，切成均匀小段，加18倍量的蒸馏水浸泡（以全部浸泡药材为宜），超声提取3次，每次2h，去渣、合并滤液、澄清、过滤、减压浓缩至稠膏（1g生药材/ml），即得日本毛连菜水提取物；

日本毛连菜水提取物水洗脱部位的制备，包括如下步骤：日本毛连菜水提取物经20倍量D₁₀₁大孔吸附树脂柱分离，用5倍柱体积的蒸馏水洗脱，浓缩洗脱液即得日本毛连菜水提物水洗脱组分，得浸膏700g以上。

实施例4：

日本毛连菜总黄酮的制备，包括如下步骤：将日本毛连菜5000g洗净，切成均匀小段，用20倍量醇浓度为30%乙醇回流提取3次，每次2h，提取温度为70℃，提取液离心后浓缩至无乙醇残留，用水稀释定容至5000ml，用5倍95%乙醇醇沉去多糖，取上清，浓缩蒸干用水溶解至含黄酮20mg/ml，经20倍量D₁₀₁大孔吸附树脂，分别用5倍柱体积水洗脱、4倍柱体积50%乙醇洗脱，留取50%乙醇洗脱部分，得浸膏140g以上，得日本毛连菜总黄酮65g以上。

实施例5：

日本毛连菜总黄酮的制备，包括如下步骤：将日本毛连菜5000g洗净，切成均匀小段，用30倍量醇浓度为60%乙醇回流提取3次，每次2h，提取温度为70℃，提取液离心后浓缩至无乙醇残留，用水稀释定容至5000ml，用4倍95%乙醇醇沉去多糖，取上清，浓缩蒸干用水溶解至含黄酮2530mg/ml，经20倍量D₁₀₁大孔吸附树脂，分别用2倍柱体积水洗脱、5倍柱体积50%乙醇洗脱，留取50%乙醇洗脱部分，得浸膏140g以上，得日本毛连菜总黄酮70g以上。

实施例6：

日本毛连菜总黄酮的制备，包括如下步骤：将日本毛连菜5000g洗净，切成均匀小段，用25倍量醇浓度为45%乙醇温浸提取2次，每次2h，提取温度为70℃，提取液离心后浓缩至无乙醇残留，用水稀释定容至5000ml，用3倍95%乙醇醇沉去多糖，取上清，浓缩蒸干用水溶解至含黄酮30mg/ml，经20倍量D₁₀₁大孔吸附树脂，分别用3.5倍柱体积水洗脱、6倍柱体积50%乙醇洗脱，留取50%乙醇洗脱部分，得浸膏140g以上，得日本毛连菜总黄酮75g以上。

Claims

1.一种日本毛连菜提取物，其特征在于：所述的提取物包括日本毛连菜的水提物水洗脱部分和总黄酮；

日本毛连菜的水提物水洗脱部分的提取方法是：将日本毛连菜洗净，晾干，切成均匀小段，加适量的蒸馏水浸泡，加15-20倍量的蒸馏水提取2-3次，每次2-3h，提取液合并、离心后取上清，浓缩，浓缩至1g生药材/ml后，经20倍量大孔吸附树脂分离，用3-5倍柱体积蒸馏水洗脱，浓缩洗脱液即得;

日本毛连菜总黄酮的提取方法是：将日本毛连菜洗净，切成均匀小段，用20-30倍量30%-60%的乙醇提取2-3次，每次2-3h，提取液离心后浓缩至无乙醇残留，用水稀释至1g生药材/ml后用3-5倍95%乙醇醇沉去多糖，取上清，浓缩蒸干，用水溶解至含黄酮20-30mg/ml，经大孔吸附树脂分离，分别用2-5倍柱体积水洗脱、4-6倍柱体积50%-95%乙醇洗脱，留取乙醇洗脱部分，即得。

2.根据权利要求2所述的日本毛连菜提取物的提取方法，其特征在于：水洗脱部分提取时，提取方法是回流提取、温浸提取或者超声提取。

3.根据权利要求2所述的日本毛连菜提取物的提取方法，其特征在于：总黄酮提取时，提取方法是70℃以上温浸提取或者回流提取。

4.根据权利2或3所述的日本毛连菜提取物的提取方法，其特征在于：水洗脱部分提取时，经20倍量大孔吸附树脂分离后，用4倍柱体积蒸馏水洗脱，浓缩洗脱液即得。

5.根据权利要求2或4所述的日本毛连菜提取物的提取方法，其特征在于：总黄酮提取时，经大孔吸附树脂分离后，分别用3.5倍柱体积水洗脱、5倍柱体积50%-95%乙醇洗脱。

6.根据权利要求1所述的日本毛连菜提取物在制备降血糖药物中的应用。