CN103585220B - 毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用，属于医药领域。毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用；毛莲菜提取物在制备通过提高NCK、IL-2、IL-6、IFN-γ活性治疗白血病药物中的应用。所述毛莲菜提取物是按如下方法制备的：以毛莲菜为原料，用30%-80%乙醇提取，通过高速逆流色谱法、聚酰胺色谱纯化得到。

Description

毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种中药材提取物在制备治疗白血病药物中的应用，具体是涉及毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用。

背景技术

白血病是起源造血系统的、以骨髓或其他造血组织中产生和积聚大量幼稚和异常白细胞为特点的恶性疾病。从形式看白血病细胞大多数是未成熟和形态异常的白细胞；在功能上，白血病细胞有着与肿瘤细胞相同的特点：白血病细胞呈肿瘤性增值，无法控制，常导致骨髓造血功能的抑制和衰竭，致病人出现贫血、中性粒细胞和血小板减少，白血病细胞可浸润全身各种组织与脏器，使各个脏器的功能受损，如脾、肝、淋巴结、脑膜、皮肤等，产生肝、脾、淋巴结肿大、头痛、颈强直等临床症状和体征；也可表现为局部的肿瘤，例如浸润骨膜下时，可聚集成淡绿色肿块，俗称绿色瘤，如乳突绿色瘤、硬脑膜绿色瘤、脊椎绿色瘤、骨盆绿色瘤等，并可早于白血病前出现于临床。由于白血病细胞源于血液系统，又具有肿瘤细胞的特点，所以人们习惯上称他为血癌。白血病的分布是世界性的，占癌症总发病率的5%左右，发病以儿童和青年居多。我国白血病患者约为3-4人/10万人口，男性多于女性。在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中白血病占第6位（男性）和第8位（女性），在儿童及35岁以下的人群中则占第1位。白血病按白细胞发育成熟的程度区分，可分为急性、慢性两种；按白细胞的不同类型来区分，可分为淋巴细胞型、粒细胞型、单核细胞型、浆细胞型、巨核细胞型白血病，有时也可由两种细胞混合而成，如粒一单细胞性白血病。

目前白血病的治疗主要依靠化疗，治疗白血病的药物也比较多，中药西药均有，常见的西药有甲氨蝶呤、环磷酰胺、长春新碱、三尖杉酯碱、干扰素等，中成药有珍香胶囊、复方斑蝥胶囊等，这些药物通过不同的机制对白血病进行治疗，其中有细胞毒性药物、诱导分化药物等。细胞毒性药物虽然可以杀伤大量的白血病细胞，减少体内的白血病负荷，但副作用较多，如杀伤、抑制正常造血细胞，导致贫血、出血；抑制正常免疫功能，机体免疫力下降，容易合并感染；损伤胃肠道粘膜，导致厌食恶心、呕吐；还会影响心肝肾功能，而且还可使第二肿瘤发生率增加。此外，这些药物剂量再大，也不可能完全杀灭体内的白血病细胞，而残留的白血病细胞是疾病复发的根源。诱导分化治疗是指应用能够促进白血病细胞分化成熟或能够调节白血病细胞表型以增强其对药物敏感性的诱导分化剂。目前应用最有效的是全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病，全反式维甲酸已成为急性早幼粒细胞白血病诱导缓解的首选药物。

干扰素是一种单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。分为α、β、γ3种。自80年代以来，许多研究显示，干扰素（尤其是α-干扰素及γ-干扰素）除具有抗病毒、免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增值作用。目前干扰素已被用于治疗多种白血病。干扰素的治疗主要显示对慢粒（慢性期）、毛细胞白血病，慢淋等慢性白血病是有帮助的。由于干扰素治疗费用昂贵、大剂量是副作用多（如行动能力降低、治理减退等），目前国内应用尚不普遍。

上述药物有的具有较强的毒性，在治疗白血病的同时对正常细胞液有杀伤作用，有的效果不明显，有的效果虽然好但价格昂贵。中药在白脉病治疗上已表现出一定的效果，并且由于中药毒性低，副作用少而越来越受到关注。

毛莲菜：为菊科植物毛莲菜（PicrisjaponicaThunb.）的干燥地上部分。夏、秋二季花开时采收，除去杂质，晒干。收载于1998年《中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册》。性凉、糙，味苦。杀“粘”，止痛，清热，消肿，解毒。用于瘟疫，结喉，乳腺炎，胸刺痛，腮腺炎，阵刺痛。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关毛莲菜的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究表明，毛莲菜含有毛连菜苷（picriside）A、B、C，山莴苣素（lactucin），11β-13-二氢山莴苣素（11β-13-dihydrolactucin），假还阳参甙（caepidiaside）A及苦荬菜内酯（ixerin）F等，还含有多糖和黄酮类化合物，其他化学成分不详；药理作用研究表明，毛莲菜水提取，过D101大孔树脂，水洗脱部分具有降血糖，调节血脂作用。详见文献：席啸虎，葛睿，高建平。日本毛连菜水洗部位降血糖、调血脂作用研究，中国医药导报，2011,8（13）:34-36。其他药理作用未见报道。

国内专利检索结果，未见毛莲菜相关专利。

上述文献及专利等，尚未见毛莲菜或毛莲菜提取物用于制备治疗白血病药物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明所用毛莲菜为菊科植物毛莲菜（PicrisjaponicaThunb.）的干燥地上部分。

毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用，所述毛莲菜提取物是按如下方法制备得到:

（1）毛莲菜，用浓度30%-80%乙醇作为溶剂，在10℃-35℃温浸提取，提取次数为1-5次，每次提取时间为12-48小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的21-25倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；

（2）将步骤（1）得到的提取物A加5-20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：2：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，得毛莲菜提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度10%-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，得毛莲菜提取物C；

（4）上述毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C，其中一种或两种按一定比例混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。

毛莲菜提取物是按如下方法制备得到:

（1）毛莲菜，用浓度30%-80%乙醇作为溶剂，在10℃-35℃温浸提取，提取次数为1-5次，每次提取时间为12-48小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的21-25倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；

（2）将步骤（1）得到的提取物A加5-20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：2：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，得毛莲菜提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度10%-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，得毛莲菜提取物C；

（4）上述毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。

毛莲菜提取物是按如下方法制备得到:

（1）毛莲菜，用浓度75%乙醇作为溶剂，在25℃温浸提取，提取次数为3次，每次提取时间为24小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的23倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；

（2）将步骤（1）得到的毛莲菜提取物A加15倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：2：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，得毛莲菜提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度60%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集60%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，得毛莲菜提取物C；

（4）将上述毛莲菜提取物B和毛莲菜提取物C混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。

本发明的毛莲菜提取物中，毛莲菜提取物B主要含有：中美菊素C（ZaluzaninC）；9α-羟基-11β,13-二氢中美菊素C3-O-β-吡喃别苷（9α-Hydroxy-11β,13-dihydrozaluzaninC3-O-β-allopyranoside）；10β,14-Dihydroxy-10（14）,10β(13)-tetrahydro-8,9-didehydro-3-deoxyzaluzaninC10-O-β-glucopyranoside；毛连菜苷A（picrisideA)；毛连菜苷B（picrisideB)；毛连菜苷C（picrisideC)；山莴苣素（lactucin)；11β-13-二氢山莴苣素（11β-13-dihydrolactucin)；共8个成分。

本发明的毛莲菜提取物中，毛莲菜提取物C主要含有：木犀草素（luteolin），木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，金丝桃素（hypericin），金丝桃苷（hyperoside）；共4个黄酮类成分。

本发明的毛莲菜提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。

本发明首次对毛莲菜采用高速逆流色谱、聚酰胺色谱技术进行降糖提取物制备研究，分离得到了具有提高NCK、IL-2、IL-6、IFN-γ活性，治疗白血病的提取物，包括毛莲菜提取物B和毛莲菜提取物C，二者按一定比例混合即得本发明的毛莲菜提取物。制备工艺操作简便，生产成本低，适于工业化大生产。

本发明首次以菊科植物毛莲菜（PicrisjaponicaThunb.）的干燥地上部分为原料，制备提取物用于治疗白血病。本发明首次探索研究并分离得到了毛莲菜具有治疗白血病作用的提取物。所得毛莲菜提取物可通过调节T细胞亚群比例及促进这些细胞因子的分泌发挥其免疫调节作用，恢复自身受抑的免疫功能来杀伤残留的白血病细胞，从而证实毛莲菜提取物具有诱生IL-2，IL-6和IFN-γ的作用，对白血病的治疗机免疫功能重建有一定的作用。我们的实验结果还表明，毛莲菜提取物具有增强IL-2和NCK活性作用，说明毛莲菜提取物对化疗后P388白血病小鼠的免疫抑制有一定的保护作用。推测其作用机理可能与增强红细胞免疫粘附功能，促使红细胞释放NCK激活因子，调节NCK-IFN-IL-2免疫网络有关。

本发明的毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C在制备治疗白血病药物中的应用。

本发明的毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用，尤其是在制备通过提高NCK、IL-2、IL-6、IFN-γ活性治疗白血病药物中的应用。

本发明的毛莲菜提取物与化学药或中药或天然药物组成的治疗白血病药物。

具体实施方式

下面通过具体实验例和实施例对毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用做进一步说明，但不限于本发明。

实施例1：毛莲菜提取物及单体化合物制备

（1）毛莲菜20kg，用浓度75%乙醇作为溶剂，在25℃温浸提取，提取次数为3次，每次提取时间为24小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的23倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；

（2）将步骤（1）得到的毛莲菜提取物A加15倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：2：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到毛莲菜提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度60%的乙醇溶液进行洗脱，收集60%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得毛莲菜提取物C；

（4）将上述毛莲菜提取物B和毛莲菜提取物C混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。

如上所述方法制备毛莲菜提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:0.5-5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，丙酮-乙烷（1:2）重结晶，分别得到中美菊素C（ZaluzaninC）；9α-羟基-11β,13-二氢中美菊素C3-O-β-吡喃别苷（9α-Hydroxy-11β,13-dihydrozaluzaninC3-O-β-allopyranoside）；10β,14-Dihydroxy-10（14）,10β(13)-tetrahydro-8,9-didehydro-3-deoxyzaluzaninC10-O-β-glucopyranoside；毛连菜苷A（picrisideA)；毛连菜苷B（picrisideB)；毛连菜苷C（picrisideC)；山莴苣素（lactucin)；11β-13-二氢山莴苣素（11β-13-dihydrolactucin)等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98.5%。

如上所述方法制备毛莲菜提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱（100:1-2.5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到木犀草素（luteolin），木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，金丝桃素（hypericin），金丝桃苷（hyperoside）等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。

实施例2：毛莲菜提取物及单体化合物制备

（1）毛莲菜10kg，用浓度30%乙醇作为溶剂，在35℃温浸提取，提取次数为1次，提取时间为48小时，溶剂用量为毛莲菜重量的25倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；

（2）将步骤（1）得到的毛莲菜提取物A加5倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：2：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到毛莲菜提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度10%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集10%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得毛莲菜提取物C；

（4）上述毛莲菜提取物B和毛莲菜提取物C按一定比例混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。

如上所述方法制备毛莲菜提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:0.5-5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，丙酮-乙烷（1:2）重结晶，分别得到中美菊素C（ZaluzaninC）；9α-羟基-11β,13-二氢中美菊素C3-O-β-吡喃别苷（9α-Hydroxy-11β,13-dihydrozaluzaninC3-O-β-allopyranoside）；10β,14-Dihydroxy-10（14）,10β(13)-tetrahydro-8,9-didehydro-3-deoxyzaluzaninC10-O-β-glucopyranoside；毛连菜苷A（picrisideA)；毛连菜苷B（picrisideB)；毛连菜苷C（picrisideC)；山莴苣素（lactucin)；11β-13-二氢山莴苣素（11β-13-dihydrolactucin)等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98.5%。

如上所述方法制备毛莲菜提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱（100:1-2.5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到木犀草素（luteolin），木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，金丝桃素（hypericin），金丝桃苷（hyperoside）等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。

实施例3：毛莲菜提取物及单体化合物制备

（1）毛莲菜10kg，用浓度80%乙醇作为溶剂，在10℃温浸提取，提取次数为5次，每次提取时间为12小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的21倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；

（2）将步骤（1）得到的毛莲菜提取物A加20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：2：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到毛莲菜提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集70%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得毛莲菜提取物C；

（4）上述毛莲菜提取物B和毛莲菜提取物C混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。

如上所述方法制备毛莲菜提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:0.5-5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，丙酮-乙烷（1:2）重结晶，分别得到中美菊素C（ZaluzaninC）；9α-羟基-11β,13-二氢中美菊素C3-O-β-吡喃别苷（9α-Hydroxy-11β,13-dihydrozaluzaninC3-O-β-allopyranoside）；10β,14-Dihydroxy-10（14）,10β(13)-tetrahydro-8,9-didehydro-3-deoxyzaluzaninC10-O-β-glucopyranoside；毛连菜苷A（picrisideA)；毛连菜苷B（picrisideB)；毛连菜苷C（picrisideC)；山莴苣素（lactucin)；11β-13-二氢山莴苣素（11β-13-dihydrolactucin)等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98.5%。

如上所述方法制备毛莲菜提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱（100:1-2.5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到木犀草素（luteolin），木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，金丝桃素（hypericin），金丝桃苷（hyperoside）等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。

实施例4:毛莲菜提取物片剂的制备

取实施例1毛莲菜提取物115g，加入淀粉40g，混匀，制粒，干燥，过筛，加微晶纤维素15g，硬脂酸镁0.5g，混匀，压片,即得毛莲菜提取物片剂。

实施例5：毛莲菜提取物颗粒的制备

取实施例2毛莲菜提取物105g，加入糊精100g，制粒，干燥，整粒，即得毛莲菜提取物颗粒。

实施例6:毛莲菜提取物胶囊的制备

取实施例3毛莲菜提取物115g，加入淀粉30g，混匀，制粒，干燥，过筛，加硬脂酸镁1g，混匀，装胶囊,即得毛莲菜提取物胶囊。

实验例1：毛莲菜提取物对L₆₁₅白血病小鼠的药效试验。

1.造模方法：在无菌条件下取L₆₁₅白血病小鼠脾制成25%生理盐水细胞悬液，给成年L₆₁₅小鼠皮下接种，结果均发生白血病，用发病小鼠脾瘤细胞在同系小鼠连续移植，建立稳定的L₆₁₅白血病模型。

L₆₁₅白血病细胞株的建立，去L₆₁₅白血病小鼠的脾，在Hanks液内将脾剪碎，使白血病细胞游离出来，通过离心收集游离细胞，然后用RPMI1640培养液（含10%小牛血清）稀释成8*10⁶/ml的细胞液，在37℃下培养。培养20d发现培养物中有贴壁的棱形细胞，其周围有增殖的圆形细胞小岛。将两种形态不同的细胞分开培养时，梭形细胞可以正常贴壁生长，而悬浮细胞生长缓慢；再将两种细胞重新混合培养，两种细胞生长旺盛，45d后，将悬浮生长的圆形细胞再次单独培养，一直传到12代，细胞生长良好，从而建立此细胞株。

2.毛莲菜提取物治疗白血病药效试验

材料：昆明种小鼠（山东省实验动物中心）。毛莲菜提取物、毛莲菜提取物A、毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C(实施例1方法制备，批号分别为：20120304、20120305、20120306、20120307)，环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司），标准重组人白介素-2（北京双鹭药业股份有限公司），Yackl及IL-2依赖细胞株CTLL（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心），RPMII640细胞培养液及胎牛血清（华美生物工程公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT），十二烷基磺酸钠及刀豆球蛋白，二甲基甲酰胺为(Sigma公司产品)；加样器，CO2培养箱，ELX-800酶标仪（美国Bio-Tek公司）；96孔平底细胞培养板，Epics流式细胞仪（美国Beckman公司）。

方法:按上述方法造模。实验分组第一组为正常对照组，20只615系小鼠，常规饲养1w后，腹腔注射生理盐水0.2ml/d，生理盐水灌肠0.3ml,上、下午各1次。第2组为模型组，常规饲养1w后，接种L₆₁₅白血病细胞，接种后处理同正常对照组。第3组为西药组，20只常规饲养一周后，接种L₆₁₅白血病细胞，接种后第3天开始ip环磷酰胺，200mg/kg，1次/d。第4组-第7组分别为毛莲菜提取物组，毛莲菜提取物A组、毛莲菜提取物B组、毛莲菜提取物C组，分别取20只常规饲养1d后，接种L₆₁₅白血病细胞，接种后第3天分别给予毛莲菜提取物，毛莲菜提取物A、毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C灌胃，0.3ml，上、下午各1次。以上各组动物每组取10只于第5天处死，取脾脏进行相关免疫指标检测，余下各动物进行生存期观察。

观察指标：①生存期观察。②T细胞亚群测定。③IL-2，IL-6，IFN-γ活性测定。

统计学方法：数据以x±s表示，采用Mi-crosoftExcel进行t检验。

结果:

生存期:毛莲菜提取物各组生存期较模型组和西药组明显延长，统计学有显著差异P<0.01，见表1.

表1各实验组生存期比较

注：与模型组相比^*P<0.01，与西药组相比^△P<0.01。

T细胞亚群：毛莲菜提取物组CD4⁺细胞较模型组和西药组高。CD8⁺细胞减少，CD4/CD8比值恢复正常。见表2。

表2各组T细胞亚群变化

注：与正常对照组相比^*P<0.01，与模型组相比^△P<0.01，与西药组相比^▲P<0.01。

IL-2，IL-6，IFN-γ活性：西药组白血病小鼠化疗后，其分泌IL-2，IL-6，IFN-γ的水平显著下降，而毛莲菜提取物组IL-2，IL-6，IFN-γ的分泌水平明显增加，两者对比有显著性差异（P<0.01），见表3。

表3各组IL-2，IL-6，IFN-γ活性变化

注：与正常对照组相比^*P<0.01，与模型组相比^△P<0.01，与西药组相比^▲P<0.01。

免疫功能的正常与否是肿瘤发生发展的重要因素之一，而免疫功能是通过免疫细胞所分泌的细胞因子所执行的，T细胞亚群的比例在稳定调节免疫功能方面亦起着重要的作用。白血病小鼠化疗后T细胞亚群比例失调，IL-2，IL-6，IFN-γ等细胞因子分泌水平下降，提示此时机体的免疫功能处于抑制状态。而通过使用毛莲菜提取物治疗后，T细胞亚群比例恢复正常，IL-2，IL-6，IFN-γ等细胞因子分泌水平回升，说明毛莲菜提取物可通过调节T细胞亚群比例及促进这些细胞因子的分泌发挥其免疫调节作用，恢复自身受抑的免疫功能来杀伤残留的白血病细胞，从而证实毛莲菜提取物具有诱生IL-2，IL-6和IFN-γ的作用，对白血病的治疗机免疫功能重建有一定的作用。

实验例2：毛莲菜提取对P388白血病小鼠的药效学试验。

1.造模方法：取腹水型P₃₈₈白血病小鼠，脱颈椎处死，腹部消毒，抽吸腹水，加入生理盐水混匀，显微镜下调整细胞浓度为（1-1.5）*10⁷个/ml，每鼠0.2ml（昆明种小鼠的接种浓度和剂量）进行腹腔注射。

2.毛莲菜提取物对P₃₈₈白血病小鼠化疗后自然杀伤细胞（NCK）、白介素-2(IL-2)活性的影响。

材料：昆明种一级小鼠（山东省实验动物中心），50只，雌雄各半，体重18-22g。实施例1制备的毛莲菜提取物，环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司），标准重组人白介素-2（北京双鹭药业股份有限公司），Yackl及IL-2依赖细胞株CTLL（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心），RPMII640细胞培养液及胎牛血清（华美生物工程公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT），十二烷基磺酸钠及刀豆球蛋白，二甲基甲酰胺为(Sigma公司产品)；加样器，CO2培养箱，ELX-800酶标仪（美国Bio-Tek公司）；96孔平底细胞培养板，Epics流式细胞仪（美国Beckman公司）。

造模与分组方法：取40只小鼠，接种P₃₈₈淋巴细胞白血病瘤株（接种方法：取腹水型P388白血病小鼠，脱颈椎处死，腹部消毒，抽吸腹水，加入生理盐水混匀，显微镜下调整细胞浓度为1.5*107个/ml，每只小鼠右腋下注射0.2ml），随机分为4组。另10只为正常空白组。

处理方法：①正常空白组：以0.4ml/20g生理盐水ig；②P₃₈₈白血病模型组：以0.4ml/20g生理盐水ig；③单纯化疗组：以0.4ml/20g生理盐水ig；④化疗加毛莲菜提取物低剂量组：分别以50mg提取物于0.4ml生理盐水ig；⑤化疗加毛莲菜提取物高剂量组：以100mg提取物溶于0.4ml生理盐水ig。以上各组连续ig14d，同时给予③、④、⑤组ip环磷酰胺35mg/kg/d，连用6d。于第15天脱颈椎处死，在无菌条件下取脾脏NCK、IL-2活性。

检测方法：NCK活性检测参照蒋中华法，IL-2活性检测方法参照钱玉坤法。

统计学方法：采用多组均数比较，即先作方差分析，再作q检验。

结果：结果表明，毛莲菜提取物能提高NCK及IL-2活性，见表4。

表4各组NCK及IL-2活性比较

注：与正常组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与化疗组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

NCK是三大类淋巴细胞之一，是机体早期抗肿瘤免疫监督功能的重要组成成分，是一群广谱抗肿瘤细胞，其杀伤活性不需要抗原事先致敏，不依赖抗体和胸腺，也不受主要组织相容性抗原（MHC）的限制。NCK在体内针对病毒感染细胞和肿瘤细胞不需要特异抗原刺激，免疫复合物和靶细胞表面结构均可直接诱发NCK的免疫反应，迅速分泌大量细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、粒单细胞集落刺激因子（GMCSF）、IL-2等，调节吞噬细胞及T、B细胞功能。同时IL-2、IFN又可增加NCK的活性，故有学者认为机体存在NCK-IFN-IL-2免疫网络。IL-2主要是由T细胞产生的15KD的糖蛋白，并作用于T细胞，促使T细胞增殖。IL-2是机体内最主要、最强有力的T细胞生长因子。IL-2可诱导或促进多种细胞毒性细胞的活性，如NCK、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）等，这些细胞在机体的免疫监视和抗肿瘤免疫方面至关重要。我们的实验结果表明，P388白血病小鼠自身及化疗后免疫功能受到抑制，NCK及IL-2活性均有不同程度的降低，化疗后P388白血病小鼠明显低于正常组及模型组。这是由于化疗药对免疫系统的影响，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤或抑制了LAK细胞所致。近年来研究发现，荷瘤机体的NCK活性降低，可能与机体荷瘤时，其免疫细胞的细胞因子网络抗肿瘤作用失常有关，如血清中免疫抑制因子存在且活性增强，免疫促进因子活性下降。在此基础上给予化疗药后可能通过抑制IFN的生成从而使NCK活性进一步受到抑制。在正常机体，IL-2具有自身正向免疫调节作用，但在大多数荷瘤机体，IL-2系统存在明显抑制或紊乱。多数研究者认为，肿瘤患者产生IL-2的能力和对IL-2反应性皆有不同程度降低，可能与IL-2分解代谢亢进或宿主体内抑制性巨噬细胞和抑制性T细胞功能增强有关。给予化疗药后IL-2的诱生进一步受到抑制，从而加重荷瘤机体免疫力的下降。给予毛莲菜提取物治疗后，高剂量组NCK及IL-2均有明显升高。我们的实验结果表明，毛莲菜提取物具有增强IL-2和NCK活性作用，说明毛莲菜提取物对化疗后P388白血病小鼠的免疫抑制有一定的保护作用。推测其作用机理可能与增强红细胞免疫粘附功能，促使红细胞释放NCK激活因子，调节NCK-IFN-IL-2免疫网络有关。毛莲菜提取物的上述作用，对于防治肿瘤化疗所致的免疫抑制，有效保证化疗的完成，具有积极的意义。

Claims (9)

1.毛莲菜提取物在制备治疗白血病药物中的应用，所述毛莲菜提取物是按如下方法制备得到:

（1）毛莲菜，用浓度30%-80%乙醇作为溶剂，在10℃-35℃温浸提取，提取次数为1-5次，每次提取时间为12-48小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的21-25倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；

（2）将步骤（1）得到的提取物A加5-20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以2：2：1：1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，得毛莲菜提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱，用水洗脱，再用浓度10%-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，得毛莲菜提取物C；

（4）上述毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C，其中一种或两种按一定比例混匀，即得毛莲菜提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述毛莲菜提取物是按如下方法制备得到:

（1）毛莲菜，用浓度30%-80%乙醇作为溶剂，在10℃-35℃温浸提取，提取次数为1-5次，每次提取时间为12-48小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的21-25倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；

（2）将步骤（1）得到的提取物A加5-20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以2：2：1：1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，得毛莲菜提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱，用水洗脱，再用浓度10%-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，得毛莲菜提取物C；

（4）上述毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C混匀，即得毛莲菜提取物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述毛莲菜提取物是按如下方法制备得到:

（1）毛莲菜，用浓度75%乙醇作为溶剂，在25℃温浸提取，提取次数为3次，每次提取时间为24小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的23倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；

（2）将步骤（1）得到的毛莲菜提取物A加15倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以2：2：1：1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，得毛莲菜提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱，用水洗脱，再用浓度60%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集60%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，得毛莲菜提取物C；

（4）将上述毛莲菜提取物B和毛莲菜提取物C混匀，即得毛莲菜提取物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述毛莲菜提取物中毛莲菜提取物B主要含有：中美菊素C；9α-羟基-11β,13-二氢中美菊素C3-O-β-吡喃别苷（9α-Hydroxy-11β,13-dihydrozaluzaninC3-O-β-allopyranoside）；毛连菜苷A（picrisideA)；毛连菜苷B（picrisideB)；毛连菜苷C（picrisideC)；山莴苣素（lactucin)；11β-13-二氢山莴苣素（11β-13-dihydrolactucin)。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述毛莲菜提取物中毛莲菜提取物C主要含有：木犀草素（luteolin），木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，金丝桃素（hypericin），金丝桃苷（hyperoside）。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述毛莲菜提取物在制备通过提高NCK、IL-2、IL-6、IFN-γ活性治疗白血病药物中的应用。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的毛莲菜提取物与化学药或中药或天然药物组成的治疗白血病药物。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C在制备治疗白血病药物中的应用。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的毛莲菜提取物通过加入药剂学允许的各种辅料制成药剂学上的片剂、颗粒剂或胶囊。