CN103585224B - 一种阿尔泰狗娃花提取物在制备治疗白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种阿尔泰狗娃花提取物在制备治疗白血病药物中的应用，属于医药领域。阿尔泰狗娃花提取物的制备方法是以阿尔泰狗娃花为原料，提取挥发油后，再用不同浓度乙醇提取，通过大孔吸附树脂纯化得到，包括阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C。该阿尔泰狗娃花提取物，可与药学上可接受的载体或其他适宜赋形剂相结合，按照常规方法制成口服给药的剂型。本发明的阿尔泰狗娃花提取物可用于制备治疗白血病药物。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种中药材提取物在制备治疗白血病药物中的应用，具体是涉及一种阿尔泰狗娃花提取物在制备治疗白血病药物中的应用。
背景技术
白血病是起源造血系统的、以骨髓或其他造血组织中产生和积聚大量幼稚和异常白细胞为特点的恶性疾病。从形式看白血病细胞大多数是未成熟和形态异常的白细胞；在功能上，白血病细胞有着与肿瘤细胞相同的特点：白血病细胞呈肿瘤性增值，无法控制，常导致骨髓造血功能的抑制和衰竭，致病人出现贫血、中性粒细胞和血小板减少，白血病细胞可浸润全身各种组织与脏器，使各个脏器的功能受损，如脾、肝、淋巴结、脑膜、皮肤等，产生肝、脾、淋巴结肿大、头痛、颈强直等临床症状和体征；也可表现为局部的肿瘤，例如浸润骨膜下时，可聚集成淡绿色肿块，俗称绿色瘤，如乳突绿色瘤、硬脑膜绿色瘤、脊椎绿色瘤、骨盆绿色瘤等，并可早于白血病前出现于临床。由于白血病细胞源于血液系统，又具有肿瘤细胞的特点，所以人们习惯上称他为血癌。白血病的分布是世界性的，占癌症总发病率的5%左右，发病以儿童和青年居多。我国白血病患者约为3-4人/10万人口，男性多于女性。在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中白血病占第6位（男性）和第8位（女性），在儿童及35岁以下的人群中则占第1位。白血病按白细胞发育成熟的程度区分，可分为急性、慢性两种；按白细胞的不同类型来区分，可分为淋巴细胞型、粒细胞型、单核细胞型、浆细胞型、巨核细胞型白血病，有时也可由两种细胞混合而成，如粒一单细胞性白血病。
目前白血病的治疗主要依靠化疗，治疗白血病的药物也比较多，中药西药均有，常见的西药有甲氨蝶呤、环磷酰胺、长春新碱、三尖杉酯碱、干扰素等，中成药有珍香胶囊、复方斑蝥胶囊等，这些药物通过不同的机制对白血病进行治疗，其中有细胞毒性药物、诱导分化药物等。细胞毒性药物虽然可以杀伤大量的白血病细胞，减少体内的白血病负荷，但副作用较多，如杀伤、抑制正常造血细胞，导致贫血、出血；抑制正常免疫功能，机体免疫力下降，容易合并感染；损伤胃肠道粘膜，导致厌食恶心、呕吐；还会影响心肝肾功能，而且还可使第二肿瘤发生率增加。此外，这些药物剂量再大，也不可能完全杀灭体内的白血病细胞，而残留的白血病细胞是疾病复发的根源。诱导分化治疗是指应用能够促进白血病细胞分化成熟或能够调节白血病细胞表型以增强其对药物敏感性的诱导分化剂。目前应用最有效的是全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病，全反式维甲酸已成为急性早幼粒细胞白血病诱导缓解的首选药物。
干扰素是一种单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。分为α、β、γ3种。自80年代以来，许多研究显示，干扰素（尤其是α-干扰素及γ-干扰素）除具有抗病毒、免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增值作用。目前干扰素已被用于治疗多种白血病。干扰素的治疗主要显示对慢粒（慢性期）、毛细胞白血病，慢淋等慢性白血病是有帮助的。由于干扰素治疗费用昂贵、大剂量是副作用多（如行动能力降低、治理减退等），目前国内应用尚不普遍。
上述药物有的具有较强的毒性，在治疗白血病的同时对正常细胞液有杀伤作用，有的效果不明显，有的效果虽然好但价格昂贵。中药在白脉病治疗上已表现出一定的效果，并且由于中药毒性低，副作用少而越来越受到关注。
阿尔泰狗娃花为菊科植物阿尔泰狗娃花（Heteropappus altaicus (Willd) Novopokr.）的干燥头状花序。夏、秋二季花开时采收，阴干。收载于1998年《中华人民共和国卫生部药品标准 蒙药分册》，其味甘、苦，性凉、淡、涩轻，功能为杀“粘”，清热，解毒，用于瘟疫、麻疹、猩红热、血热、毒热，“宝日”热。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关阿尔泰狗娃花的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究关于阿尔泰狗娃花的化学成分及药理作用鲜有报道。
国内专利检索，未见阿尔泰狗娃花相关专利报道。
上述文献及专利等，尚未见阿尔泰狗娃花或阿尔泰狗娃花提取物用于制备治疗白血病药物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阿尔泰狗娃花提取物在制备治疗白血病药物中的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明所用阿尔泰狗娃花为菊科植物阿尔泰狗娃花（Heteropappus altaicus (Willd) Novopokr.）的干燥头状花序。
本发明一种阿尔泰狗娃花提取物在制备治疗白血病药物中的应用；所述阿尔泰狗娃花提取物的制备方法为：
（1）阿尔泰狗娃花，加水浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，加水量为阿尔泰狗娃花重量的8-15倍，收集挥发油，即得阿尔泰狗娃花提取物A；将阿尔泰狗娃花水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A；
（2）将步骤（1）得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为阿尔泰狗娃花重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物B；
（3）将步骤（1）得到的药液A，浓缩至相对密度d=1.10-1.20，滤过，药液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度30%-95%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物C；
（4）上述阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C，其中一种或两种或三种按一定比例混匀，即得本发明的阿尔泰狗娃花提取物。
阿尔泰狗娃花提取物的制备方法为:
（1）阿尔泰狗娃花，加水浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，加水量为阿尔泰狗娃花重量的8-15倍，收集挥发油，即得阿尔泰狗娃花提取物A；将阿尔泰狗娃花水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A；
（2）将步骤（1）得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为阿尔泰狗娃花重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物B；
（3）将步骤（1）得到的药液A，浓缩至相对密度d=1.10-1.20，滤过，药液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度30%-95%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物C；
（4）上述阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C混匀，即得本发明的阿尔泰狗娃花提取物。
优选的阿尔泰狗娃花提取物的制备方法为:
（1）阿尔泰狗娃花，加水浸泡6小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间2小时，提取次数2次，加水量为阿尔泰狗娃花重量的14倍，收集挥发油，即得阿尔泰狗娃花提取物A；将阿尔泰狗娃花水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A；
（2）将步骤（1）得到药渣A用浓度70%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为阿尔泰狗娃花重量的12倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物B；
（3）将步骤（1）得到的药液A，浓缩至相对密度d=1.12，滤过，药液通过DM130大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度70%、95%的乙醇溶液依次洗脱，收集70%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物C；
（4）上述阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C混匀，即得本发明的阿尔泰狗娃花提取物。
本发明的阿尔泰狗娃花提取物的制备方法，其特征在于：所采用的大孔吸附树脂为LSA-21大孔吸附树脂、DM130大孔吸附树脂、LSA-40大孔吸附树脂。
本发明的的阿尔泰狗娃花提取物与化学药或中药或天然药物组成治疗白血病药物。
本发明的阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C，在制备治疗白血病药物中的应用。
本发明的阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C与化学药或中药或天然药物组成治疗白血病药物。
本发明的阿尔泰狗娃花提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。
本发明首次以菊科植物阿尔泰狗娃花（Picris japonica T hunb.）的干燥地上部分为原料，制备提取物用于治疗白血病。本发明的阿尔泰狗娃花提取物可以显著抑制K562白血病细胞增殖；阿尔泰狗娃花提取物可以显著抑制K562白血病细胞集落形成。
具体实施方式
下面通过具体实验例和实施例对一种阿尔泰狗娃花提取物在制备治疗白血病药物中的应用做进一步说明，但不限于本发明。
实施例1：阿尔泰狗娃花提取物的制备
（1）阿尔泰狗娃花22kg，加水浸泡6小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间2小时，提取次数2次，加水量为阿尔泰狗娃花重量的14倍，收集挥发油，即得阿尔泰狗娃花提取物A；将阿尔泰狗娃花水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A；
（2）将步骤（1）得到药渣A用浓度70%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为阿尔泰狗娃花重量的12倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物B；
（3）将步骤（1）得到的药液A，浓缩至相对密度d=1.12，滤过，药液通过DM130大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度70%、95%的乙醇溶液依次洗脱，收集70%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物C；
（4）上述阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C混匀，即得本发明的阿尔泰狗娃花提取物。
实施例2：阿尔泰狗娃花提取物的制备
（1）阿尔泰狗娃花18.5kg，加水浸泡4小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1小时，提取次数3次，加水量为阿尔泰狗娃花重量的8倍，收集挥发油，即得阿尔泰狗娃花提取物A；将阿尔泰狗娃花水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A；
（2）将步骤（1）得到药渣A用浓度50%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为阿尔泰狗娃花重量的15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物B；
（3）将步骤（1）得到的药液A，浓缩至相对密度d=1.10，滤过，药液通过LSA-21大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度30%的乙醇溶液洗脱，收集30%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物C；
（4）上述阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C混匀，即得本发明的阿尔泰狗娃花提取物。
实施例3：阿尔泰狗娃花提取物的制备
（1）阿尔泰狗娃花19kg，加水浸泡12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间4小时，提取次数1次，加水量为阿尔泰狗娃花重量的15倍，收集挥发油，即得阿尔泰狗娃花提取物A；将阿尔泰狗娃花水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A；
（2）将步骤（1）得到药渣A用浓度95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为3次，每次提取时间为1小时，每次溶剂用量为阿尔泰狗娃花重量的8倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物B；
（3）将步骤（1）得到的药液A，浓缩至相对密度d=1.20，滤过，药液通过LSA-40大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度95%的乙醇溶液洗脱，收集95%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物C；
（4）上述阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C混匀，即得本发明的阿尔泰狗娃花提取物。
实施例4:阿尔泰狗娃花提取物片剂的制备
取实施例1阿尔泰狗娃花提取物225g，加入淀粉75g，混匀，制粒，干燥，过筛，加微晶纤维素15g，硬脂酸镁3.5g，混匀，压制成1000片, 即得阿尔泰狗娃花提取物片剂。
实施例5：阿尔泰狗娃花提取物颗粒剂的制备
取实施例2阿尔泰狗娃花提取物125g，加入糊精100g，混匀，制粒，干燥，整粒，即等阿尔泰狗娃花提取物颗粒剂。
实施例6：阿尔泰狗娃花提取物胶囊的制备
取实施例3阿尔泰狗娃花提取物225g，加入淀粉85g，混匀，制粒，干燥，整粒，装胶囊1000粒，即得阿尔泰狗娃花提取物胶囊。
实验例1：阿尔泰狗娃花提取物对K562白血病细胞的增殖抑制作用。
药物：阿尔泰狗娃花提取物、阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C (按本发明实施例1方法制备得到，批号分别为：20110101、20110102、20110103、20110104)，XTT(美国Sigma公司)。
仪器：ELX-800酶标仪(美国Bio-Tek公司)。
细胞：K562白血病细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心)。
实验分组：(1)空白对照组；(2)10-5mo1/L羟基脲对照组；(3)100mg/ml阿尔泰狗娃花提取物组；(4) 100mg/ml阿尔泰狗娃花提取物A组；(5) 100mg/ml阿尔泰狗娃花提取物B组；(6) 100mg/ml阿尔泰狗娃花提取物C组。
统计学方法：采用SPSS13.0软件，细胞计数多组间比较采用重复测量方差分析，多均数间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果:阿尔泰狗娃花提取物可以显著抑制K562白血病细胞增殖，与空白对照组相比，具有显著性差异(P<0. 05)；与10-5mo1/L羟基脲对照组相比，无显著性差异((P > 0. 05)。
表1阿尔泰狗娃花提取物对K562白血病细胞XTT的影响
注:与空白对照组比较，*p<0.05；与10-5mo1/L轻基脉对照组比较，#p<0.05。
实验例2: 阿尔泰狗娃花提取物对K562白血病细胞的增殖抑制作用。
药物：阿尔泰狗娃花提取物、阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C (按本发明实施例1方法制备得到，批号分别为：20110101、20110102、20110103、20110104)。
细胞：K562白血病细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心)。
实验分组：(1)空白对照组；(2)10-5mo1/L羟基脲对照组；(3)100mg/ml阿尔泰狗娃花提取物组；(4) 100mg/ml阿尔泰狗娃花提取物A组；(5) 100mg/ml阿尔泰狗娃花提取物B组；(6) 100mg/ml阿尔泰狗娃花提取物C组。
实验内容:集落形成抑制试验。
统计学方法:同实验例1。
结果:阿尔泰狗娃花提取物可以显著抑制K562白血病细胞集落形成，与空白对照组相比，具有显著性差异，与10-5mo1/L羟基脲对照组相比，无显著性差异。
表2阿尔泰狗娃花提取物对K562白血病细胞集落产生率的影响
注:与空白对照组比较，*p<0.05；与10-5mol /L羟基脲对照组比较，#p<0.05。
实验例3：阿尔泰狗娃花提取物对K562白血病细胞形态学的影响。
药物：同实验例2。
细胞：同实验例1。
实验分组：同实验例1。
实验内容：光镜观察K562白血病细胞Wright-Giemsa染色形态。
结果：空白对照组的K562白血病细胞胞浆深蓝色，核大，呈圆形或椭圆形，染色质疏松细致，可见1-3个核仁，核浆比例大；K562白血病细胞经阿尔泰狗娃花提取物处理后细胞体积变大，核浆比例减少，有核切迹，核染色质浓集、变粗，部分细胞核仁比较明显，胞质增多、浅染，核周胞质出现淡染区，表现一定程度的分化。
实验例4：阿尔泰狗娃花提取物对K562白血病细胞周期的影响。
药物：同实验例2。
细胞：同实验例1。
仪器：FACScaliber流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)。
实验分组：同实验例1。
实验内容：细胞周期检测。
统计学方法：同实验例1。
结果：阿尔泰狗娃花提取物组分布于S期的细胞与空白对照组比较明显增加((P<0.05)，与羟基脲对照组相比，无显著性差异（P>0.05)，而分布在G1期和G2期的细胞数与空白对照组比较明显减少((P<0.05)。可见，阿尔泰狗娃花提取物对K562白血病细胞的抑制作用很可能是由于将细胞周期阻滞在S期所致。
表3 阿尔泰狗娃花提取物对K562白血病细胞周期的影响
注:与空白对照组比较，*p<0. 05；与10-5mol /L羟基脲对照组比较，#p<0. 05。
Claims (8)
1.一种阿尔泰狗娃花提取物在制备治疗白血病药物中的应用，所述阿尔泰狗娃花提取物的制备方法为：
（1）阿尔泰狗娃花，加水浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，加水量为阿尔泰狗娃花重量的8-15倍，收集挥发油，即得阿尔泰狗娃花提取物A；将阿尔泰狗娃花水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A；
（2）将步骤（1）得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为阿尔泰狗娃花重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物B；
（3）将步骤（1）得到的药液A，浓缩至相对密度d=1.10-1.20，滤过，药液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度30%-95%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物C；
（4）上述阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C，其中一种或两种或三种按一定比例混匀，即得阿尔泰狗娃花提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述阿尔泰狗娃花提取物的制备方法为:
（1）阿尔泰狗娃花，加水浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，加水量为阿尔泰狗娃花重量的8-15倍，收集挥发油，即得阿尔泰狗娃花提取物A；将阿尔泰狗娃花水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A；
（2）将步骤（1）得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为阿尔泰狗娃花重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物B；
（3）将步骤（1）得到的药液A，浓缩至相对密度d=1.10-1.20，滤过，药液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度30%-95%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物C；
（4）上述阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C混匀，即得阿尔泰狗娃花提取物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述阿尔泰狗娃花提取物的制备方法为:
（1）阿尔泰狗娃花，加水浸泡6小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间2小时，提取次数2次，加水量为阿尔泰狗娃花重量的14倍，收集挥发油，即得阿尔泰狗娃花提取物A；将阿尔泰狗娃花水提取液滤过，分别得到药液A和药渣A；
（2）将步骤（1）得到药渣A用浓度70%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为阿尔泰狗娃花重量的12倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物B；
（3）将步骤（1）得到的药液A，浓缩至相对密度d=1.12，滤过，药液通过DM130大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度70%、95%的乙醇溶液依次洗脱，收集70%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得阿尔泰狗娃花提取物C；
（4）上述阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C混匀，即得阿尔泰狗娃花提取物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所采用的大孔吸附树脂为LSA-21大孔吸附树脂、DM130大孔吸附树脂、LSA-40大孔吸附树脂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的阿尔泰狗娃花提取物与化学药或中药组成的治疗白血病药物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C在制备治疗白血病药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的阿尔泰狗娃花提取物A、阿尔泰狗娃花提取物B、阿尔泰狗娃花提取物C与化学药或中药组成的治疗白血病药物。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的阿尔泰狗娃花提取物通过加入药剂学允许的各种辅料制成药剂学上口服的片剂、颗粒剂、胶囊。
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