CN105311148A - 一种中药提取物及其在制备治疗白血病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药提取物及其在制备治疗白血病中的应用，该中药提取物由花楸果、猫屎瓜、黑树莓和金沸草经处理、水蒸气蒸馏、醇提、大孔树脂吸附制备而成，该中药提取物作为活性成分在制药学上接受附加剂的药物组合物在制备治疗白血病中的应用。本发明蒸馏、醇提以及大孔吸附树脂纯化技术对中药组合物进行处理，并进行治疗白血病提取物制备研究，分离得到了具有治疗白血病活性的提取物，制备提取物用于治疗白血病。本发明的中药提取物能够抑制白血病细胞(HL-60细胞)增殖和诱导白血病细胞(HL-60细胞)凋亡，因此，可以用来对白血病进行治疗。

Description

一种中药提取物及其在制备治疗白血病中的应用

技术领域

本发明涉及中药制备技术领域，具体是一种中药提取物及其在制备治疗白血病中的应用。

背景技术

白血病是起源造血系统的、以骨髓或其他造血组织中产生和积聚大量幼稚和异常白细胞为特点的恶性疾病。从形式看白血病细胞大多数是未成熟和形态异常的白细胞；在功能上，白血病细胞有着与肿瘤细胞相同的特点：白血病细胞呈肿瘤性增值，无法控制，常导致骨髓造血功能的抑制和衰竭，致病人出现贫血、中性粒细胞和血小板减少，白血病细胞可浸润全身各种组织与脏器，使各个脏器的功能受损，如脾、肝、淋巴结、脑膜、皮肤等，产生肝、脾、淋巴结肿大、头痛、颈强直等临床症状和体征；也可表现为局部的肿瘤，例如浸润骨膜下时，可聚集成淡绿色肿块，俗称绿色瘤，如乳突绿色瘤、硬脑膜绿色瘤、脊椎绿色瘤、骨盆绿色瘤等，并可早于白血病前出现于临床。由于白血病细胞源于血液系统，又具有肿瘤细胞的特点，所以人们习惯上称他为血癌。白血病的分布是世界性的，占癌症总发病率的5％左右，发病以儿童和青年居多。我国白血病患者约为3-4人/10万人口，男性多于女性。在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中自血病占第6位(男性)和第8位(女性)，在儿童及35岁以下的人群中则占第1位。白血病按白细胞发育成熟的程度区分，可分为急性、慢性两种；按白细胞的不同类型来区分，可分为淋巴细胞型、粒细胞型、单核细胞型、浆细胞型、巨核细胞型白血病，有时也可由两种细胞混合而成，如粒一单细胞性白血病。

目前白血病的治疗主要依靠化疗，治疗白血病的药物也比较多，中药西药均有，常见的西药有甲氨蝶呤、环磷酞胺、长春新碱、三尖杉酯碱、干扰素等，中成药有珍香胶囊、复方斑鳌胶囊等，这些药物通过不同的机制对白血病进行治疗，其中有细胞毒性药物、诱导分化药物等。细胞毒性药物虽然可以杀伤大量的白血病细胞，减少体内的白血病负荷，但副作用较多，如杀伤、抑制正常造血细胞，导致贫血、出血；抑制正常免疫功能，机体免疫力下降，容易合并感染；损伤胃肠道粘膜，导致厌食恶心、呕吐；还会影响心肝肾功能，而且还可使第二肿瘤发生率增加。此外，这些药物剂量再大，也不可能完全杀灭体内的白血病细胞，而残留的白血病细胞是疾病复发的根源。诱导分化治疗是指应用能够促进白血病细胞分化成熟或能够调节白血病细胞表型以增强其对药物敏感性的诱导分化剂。目前应用最有效的是全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病，全反式维甲酸己成为急性早幼粒细胞白血病诱导缓解的首选药物。

干扰素是一种单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。分为α、β、γ3种。自80年代以来，许多研究显示，干扰素(尤其是a-干扰素及γ-干扰素)除具有抗病毒、免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增值作用。目前干扰素己被用于治疗多种白血病。干扰素的治疗主要显示对慢粒(慢性期)、毛细胞白血病，慢淋等慢性白血病是有帮助的。由于干扰素治疗费用昂贵、大剂量是副作用多(如行动能力降低、治理减退等)，目前国内应用尚不普遍。

上述药物有的具有较强的毒性，在治疗白血病的同时对正常细胞液有杀伤作用，有的效果不明显，有的效果虽然好但价格昂贵。中药在白血病治疗上以表现出一定的效果，并且由于中药毒性低，副作用少而越来越受到关注。因此研究出治疗白血病的中药具有很大的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中药提取物及其在制备治疗白血病中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种中药提取物，由以下重量份的原料制备而成：花楸果15～20份，猫屎瓜6～8份，黑树莓12～16份，金沸草14～18份。

一种中药提取物的制备方法，具体制备步骤如下：

(1)将各原料分别进行清洗，并于自然环境下晾干，使得各原料的含水量保持在10～12％，按照配比分别进行称取，分别用粉碎机粉碎成30～60目的药材，然后混合均匀；

(2)在上述混合的药材中加入原料10～12倍的水浸泡6～8h，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间3～4h，提取次数3～4次，收集挥发油，得提取物A；

(3)将步骤(2)得到的提取物A用体积浓度为80～95％的乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为2～3h，每次溶剂用量为原料总重量的6～8倍，滤过，得提取物B；

(4)将步骤(3)得到的提取物B浓缩至相对密度d＝1.10～1.20，滤过，药液通过大孔吸附树脂，再用浓度60～75％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，得本发明中药提取物。

作为本发明进一步的方案：所述大孔吸附树脂为LSA-21大孔吸附树脂、DM130大孔吸附树脂或LSA-40大孔吸附树脂。

一种所述的中药提取物作为活性成分在制药学上接受附加剂的药物组合物在制备治疗白血病中的应用。

作为本发明进一步的方案：所述治疗白血病药物制成固体制剂或液体制剂，所述固体制剂为颗粒剂、片剂、滴丸剂、粉针剂或胶囊，液体制剂为口服液。

作为本发明再进一步的方案：所述固体制剂中该中药提取物的质量含量为30～36％，液体制剂中中药提取物的质量含量为15～25％。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用蒸馏、醇提以及大孔吸附树脂纯化技术对中药组合物进行处理，并进行治疗白血病提取物制备研究，分离得到了具有治疗白血病活性的提取物，制备提取物用于治疗白血病。本发明的中药提取物能够有效抑制白血病细胞(HL-60细胞)增殖和诱导白血病细胞(HL-60细胞)凋亡，因此可以用来对白血病进行治疗。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

中药提取物，由以下重量的原料制备而成：花楸果15kg，猫屎瓜8kg，黑树莓12kg，金沸草18kg。

上述中药提取物的制备方法，具体制备步骤如下：

(1)将各原料分别进行清洗，并于自然环境下晾干，使得各原料的含水量保持在10～12％，按照配比分别进行称取，分别用粉碎机粉碎成50目的药材，然后混合均匀；

(2)在上述混合的药材中加入原料10倍的水浸泡6h，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间3h，提取次数4次，收集挥发油，得提取物A；

(3)将步骤(2)得到的提取物A用体积浓度为95％的乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为3h，每次溶剂用量为原料总重量的6倍，滤过，得提取物B；

(4)将步骤(3)得到的提取物B浓缩至相对密度d＝1.10～1.20，滤过，药液通过LSA-21大孔吸附树脂，再用浓度60％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，得本发明中药提取物。

实施例2

中药提取物，由以下重量的原料制备而成：花楸果17.5kg，猫屎瓜7kg，黑树莓14kg，金沸草16kg。

上述中药提取物的制备方法，具体制备步骤如下：

(1)将各原料分别进行清洗，并于自然环境下晾干，使得各原料的含水量保持在10～12％，按照配比分别进行称取，分别用粉碎机粉碎成50目的药材，然后混合均匀；

(2)在上述混合的药材中加入原料11倍的水浸泡7h，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间3.5h，提取次数4次，收集挥发油，得提取物A；

(3)将步骤(2)得到的提取物A用体积浓度为95％的乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为3次，每次提取时间为2.5h，每次溶剂用量为原料总重量的7倍，滤过，得提取物B；

(4)将步骤(3)得到的提取物B浓缩至相对密度d＝1.10～1.20，滤过，药液通过DM130大孔吸附树脂，再用浓度60％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，得本发明中药提取物。

实施例3

中药提取物，由以下重量的原料制备而成：花楸果20kg，猫屎瓜6kg，黑树莓16kg，金沸草14kg。

上述中药提取物的制备方法，具体制备步骤如下：

(1)将各原料分别进行清洗，并于自然环境下晾干，使得各原料的含水量保持在10～12％，按照配比分别进行称取，分别用粉碎机粉碎成50目的药材，然后混合均匀；

(2)在上述混合的药材中加入原料12倍的水浸泡8h，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间4h，提取次数4次，收集挥发油，得提取物A；

(3)将步骤(2)得到的提取物A用体积浓度为95％的乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为3h，每次溶剂用量为原料总重量的8倍，滤过，得提取物B；

(4)将步骤(3)得到的提取物B浓缩至相对密度d＝1.10～1.20，滤过，药液通过LSA-40大孔吸附树脂，再用浓度60％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，得本发明中药提取物。

实施例4

中药提取物片剂的制备，取实施例1中药提取物300g，加入淀粉120g，混匀，制粒，干燥，过筛，加微晶纤维素30g，硬脂酸镁3.5g，混匀，压制成1000片，即得中药提取物片剂。

实施例5

中药提取物颗粒剂的制备，取实施例2中药提取物310g，加入糊精100g，混匀，制粒，干燥，整粒，即得中药提取物颗粒剂。

实施例6

中药提取物胶囊的制备，取实施例3白花油麻藤提取物295g，加入淀粉85g，混匀，制粒，干燥，整粒，装胶囊1000粒，即得中药提取物胶囊。

对比例1

原料为实施例2中的三种：花楸果17.5kg，猫屎瓜7kg，黑树莓14kg，并按照实施例2的制备方法制备中药提取物。

对比例2

原料为实施例2中的三种：花楸果17.5kg，猫屎瓜7kg，金沸草16kg，并按照实施例2的制备方法制备中药提取物。

对比例3

原料为实施例2中的三种：花楸果17.5kg，黑树莓14kg，金沸草16kg，并按照实施例2的制备方法制备中药提取物。

对比例4

原料为实施例2中的三种：猫屎瓜7kg，黑树莓14kg，金沸草16kg，并按照实施例2的制备方法制备中药提取物。

对比例5

原料为实施例2中的两种：花楸果17.5kg，黑树莓14kg，并按照实施例2的制备方法制备中药提取物。

对比例6

原料为实施例2中的两种：猫屎瓜7kg，金沸草16kg，并按照实施例2的制备方法制备中药提取物。

实验例1：中药提取物抑制HL-60细胞增殖和诱导HL-60细胞凋亡试验

1、材料和方法

1.1材料

RPM工1640培养基购于Gibco公司；四甲基偶氮哩盐(MTT)、罗丹明123为Sigma公司产品；Caspase-3，9分光光度法检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2细胞培养

人早幼粒细胞性白血病细胞株HL-60购于中科院上海细胞生物研究所，培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，青霉素100kU/L，链霉素100mg/L，37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3人外周血单个核细胞(PBMC)的分离

无菌采集健康供者静脉血，肝素抗凝(每毫升全血加0.1ml的200U/ml肝素钠溶液)，PBS等倍稀释血液，1∶4加入人淋巴细胞分离液，2000rpm离心20min，收集乳白层后用无血清RPMI-1640培养基1500rpm10min离心洗涤2次，获得单个核细胞，台盼蓝拒染率大于95％，重悬于10％FCS的RPMI-1640培养基中备用。

1.4中药各提取物对HL-60细胞和人PBMC生长的影响

接种HL-60细胞和人PBMC与96孔板，每孔2×10⁴个细胞((100ul)。37℃，5％CO₂条件下培养24h后，实验组依次加50ug/mL的中药提取物，中药提取物分别为实施例1-6和对比例1-6，继续分别培养24、48、72h后，终止培养，设只加培养液的对照组，每个剂量组设4个复孔。实验结束前4h，每孔加入20ulMTT溶液(5g/L)，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150uLDMSO，震荡10min，选择570nm波长，在自动酶联检测仪上测定各孔吸光度((A)值，重复实验3次，并计算其生长抑制率(CI)。

CI＝(阴性对照组A值-实验组A值)/阴性对照组A值×100％。

1.5流式细胞术测定细胞凋亡率

收集50ug/mL实施例1-6和对比例1-6中药提取物处理48h的各组细胞，PBS洗涤2次，加入预冷的70％乙醇于-20℃固定24h，离心洗涤后加入200uLPI染液，50ulRNA酶，4℃避光放置20min，1500rpm离心5min。调整细胞浓度为1×10⁵个/ml-1×10⁶个/ml，上流式细胞仪分析，激发光源为氢离子激光，激发波长为488nm。

1.6统计学分析本实验结果应用统计分析

软件SPSS13.0处理，组间比较采用单因素方差分析。

2、结果

2.1各中药提取物对HL-60细胞及PBMC生长的影响

对照组HL-60细胞生长活跃，经50ug/mL的实施例1-6和对比例1-6中药提取物处理24、48、72h后，HL-60细胞生长均不同程度的减慢，并呈时间、浓度依赖性。在相同浓度下，培养72h各中药提取物对人PBMC几乎无抑制作用，与HL-60细胞比较有显著性差异(P＜0.05)(见表1)。

表1各中药提取物对HL-60细胞增殖的影响(n＝4)

注：与24h比较*p＜0.05**p＜0.01；与48h比较△p＜0.05△△p＜0.01；与72h比较▲p＜0.05▲▲p＜0.01。

2.2流式细胞术检测HL-60细胞凋亡

HL-60细胞与各中药提取物作用48h后，经流式细胞仪分析，结果显示G，期峰前均出现了代表细胞凋亡的亚二倍体峰，其中50.0ug/mL各中药提取物作用48h凋亡率达到(36.47士4.66)表2)。

表2各中药提取物作用48h后对HL-60细胞凋亡率的影响(n＝3)

组别	剂量(μg/mL)	凋亡率/％
			实施例1	50	45.26±1.56
实施例2	50	50.86±3.84
			实施例3	50	48.20±1.25
实施例4	50	47.96±5.46
			实施例5	50	48.63±3.45
实施例6	50	47.65±4.21
			对比例1	50	20.26±2.12
对比例2	50	21.36±1.28
			对比例3	50	20.21±0.15
对比例4	50	19.96±5.42
			对比例5	50	6.85±1.26
对比例6	50	5.23±1.32
			对照组	50	0.21±0.02
阴性对照	0	0.12±0.03

注：与阴性对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01

结论：实施例1-6的中药提取物能够抑制白血病细胞(HL-60细胞)增殖和诱导白血病细胞(HL-60细胞)凋亡，因此可以用来对白血病进行治疗。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (6)

1.一种中药提取物，其特征在于，由以下重量份的原料制备而成：花楸果15～20份，猫屎瓜6～8份，黑树莓12～16份，金沸草14～18份。

2.一种如权利要求1所述的中药提取物的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：

(1)将各原料分别进行清洗，并于自然环境下晾干，使得各原料的含水量保持在10～12％，按照配比分别进行称取，分别用粉碎机粉碎成30～60目的药材，然后混合均匀；

(2)在上述混合的药材中加入原料10～12倍的水浸泡6～8h，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间3～4h，提取次数3～4次，收集挥发油，得提取物A；

(3)将步骤(2)得到的提取物A用体积浓度为80～95％的乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为2～3h，每次溶剂用量为原料总重量的6～8倍，滤过，得提取物B；

(4)将步骤(3)得到的提取物B浓缩至相对密度d＝1.10～1.20，滤过，药液通过大孔吸附树脂，再用浓度60～75％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，得本发明中药提取物。

3.根据权利要求2所述的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为LSA-21大孔吸附树脂、DM130大孔吸附树脂或LSA-40大孔吸附树脂。

4.一种如权利要求1所述的中药提取物作为活性成分在制药学上接受附加剂的药物组合物在制备治疗白血病中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述治疗白血病药物制成固体制剂或液体制剂，所述固体制剂为颗粒剂、片剂、滴丸剂、粉针剂或胶囊，液体制剂为口服液。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述固体制剂中该中药提取物的质量含量为30～36％，液体制剂中中药提取物的质量含量为15～25％。