CN101982171B - 苦豆双黄酮苷在制备抗病毒或/和抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗病毒或
/
和抗肿瘤药物及其制备方法、苦豆双黄酮苷在制备抗病毒或
/
和抗肿瘤药物中的应用，本发明首次提出苦豆子中的化学成分苦豆双黄酮苷作为药物的用途，并首次将苦豆双黄酮苷应用于制备抗病毒药物和抗肿瘤药物。体内、外实验研究表明，本发明苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊具有显著的抗流感病毒作用，其抗流感药效优于现有西药利巴韦林片。苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊的抗乙肝病毒作用优于苦参素胶囊，其抗爱滋病毒作用优于齐多夫定片。苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊对肝癌、胃癌、肠癌、肺癌及宫颈癌细胞均有明显的抗增殖作用，其抗肿瘤作用优于现有化学成分制剂羟基喜树碱注射液。
Description
技术领域
本发明涉及从植物中提取分离的化学成分作为药物的应用技术领域，是一种抗病毒或/和抗肿瘤药物及其制备方法、苦豆双黄酮苷在制备抗病毒或/和抗肿瘤药物中的应用，本发明首次提出苦豆子中的化学成分苦豆双黄酮苷作为药物的用途，并首次将苦豆双黄酮苷应用于制备抗病毒药物和抗肿瘤药物。
背景技术
病毒性传染病的发病率很高，死亡率也很高,其传播不仅造成严重的社会影响和经济损失,而且随时随地象恶魔般杀死无数生灵。在人类已发现众多病毒中,流感病毒堪称元老,由于其变异性极高,科学家们至今还没有弄清其变异规律,当针对流行株的疫苗研制成功后,往往又出现新的传播性更强的变异株,使人类无法获得终身免疫。在这种形势下,应用抗病毒药物对人群进行保护,或控制感染者的病情就显得十分重要。
乙型肝炎也是世界性的流行病，我国属高地方流行区, 在全球3.5亿乙肝病毒感染者中，中国人占三分之一, 每年有数百万人死于由乙型肝炎导致的肝硬化和原发性肝癌。由于社会和经济方面的原因，计划免疫在我国还无法全面普及，乙型肝炎的流行已成为我国最大的公共卫生问题之一。由于抗乙肝药物的开发在国际上一直未取得理想的进展，目前临床上可选择的有效药物寥寥无几,而且都存在治疗周期长、反弹率高、副作用大、价格昂贵等种种无法克服的问题。
爱滋病自被发现后,其传播速度惊人，在短短20年时间里,已扩散到了全球各个角落。目前，我国HIV感染每年增加人数列世界第1位，感染人数已超过100万。新疆为我国艾滋病重灾区之一,于1995年发现第一例艾滋病病毒感染者，截至2005年,已累计报告艾滋病病毒感染者11303人，艾滋病病毒感染者人数居全国第4位。艾滋病的防治已成为我区不容忽视的社会问题和重大科研课题。近年来，虽然政府一直在不断加强各级医疗部门防控艾滋病的能力，全面推进艾滋病的预防与控制仍是一项极其艰巨的工程。
由于为世人瞩目的HIV疫苗研制工作在众多科学家付出了20年的艰辛努力之后，成功的希望依然“非常渺茫”,使抗爱滋病毒药物的研发在国际上备受瞩目，许多发达国家一直在努力通过药物筛选争取实质性的进展。随着对HIV病毒及其感染机制的研究不断深入，积极运用现代技术手段，进行抗HIV药物的筛选及评价，促使更多高效、低毒的抗AIDS药物问世，是攻克艾滋病防治的这一世纪性难题的有效途径。
恶性肿瘤也是目前危害人类生命健康的严重疾病之一。世界卫生组织的统计资料表明，癌症每年发病1000万人，死亡700万人，是仅次于心血管病的人类第2杀手。目前，化疗、放疗和手术治疗是临床治疗恶性肿瘤的主要手段。通常，对于有转移淋巴结癌灶的早期癌症及全部进展期癌症，均需进行化学药物治疗，合理的化疗能最大限度地通过细胞毒作用抑制肿瘤扩散，消灭残存癌灶，防止复发和转移，晚期癌症患者也可通过化疗延长生存期，改善生存质量。但现有的化学抗癌药均存在疗效有限、价格昂贵、毒副作用大等缺点,天然药物在癌症治疗中的作用受到备受关注。能否找到既能杀伤肿瘤细胞，毒副作用又比较小的药物及治疗方法，对肿瘤的临床治疗意义重大。
从天然产物中发现的抗肿瘤活性物质具有作用广泛，副作用小和调节免疫功能等特性，对很多常规化疗效果欠佳的肿瘤有较好疗效。据研究报道，我国传统中药中存在许多抗癌有效成分，如黄酮类、生物碱类、多糖类成分，作为抗肿瘤活性物质都具有广阔的开发前景。许多研究表明，黄酮类化合物具有广泛的抗肿瘤活性，可抑制多种肿瘤细胞的生长,如人结肠癌细胞、人胃癌细胞和人肝癌细胞等的增殖。通过对该类物质抗肿瘤作用机理的研究，发现黄酮类化合物可通过多种机制发挥抗肿瘤效应，如细胞生长抑制，影响信号转导，凋亡诱导，抑制基质金属蛋白酶分泌，抑制肿瘤侵袭行为等。这些研究结果为黄酮类化合物在抗肿瘤领域的应用提供了依据。目前，针对黄酮类化合物抗肿瘤作用的基础和应用研究仍在积极进行，发达国家在此方面作了大量的工作。在我国现有国情下，应当充分发挥中草药资源丰富的优势，加快该领域的研究，尽早开发出高效的抗肿瘤新药。
苦豆子Sophora alopecuroides L.为豆科槐属植物，药用全草或种子，主产于我国西北地区。苦豆子中含有生物碱、黄酮、有机酸和多糖等多种化学成分。苦豆双黄酮苷为从苦豆子中提取分离的双黄酮苷类化合物，为苦豆子中含量较高的一种黄酮类成分，其化学结构式如下：
有关苦豆双黄酮苷在制备抗病毒及抗肿瘤药物的应用在国内外均未见研究报道，也未检索到有相关的文献。
本发明首次提出苦豆双黄酮苷作为药物的用途，并首次将苦豆双黄酮苷用于制备抗病毒药物和抗肿瘤药物。
发明内容
本发明提供了一种抗病毒或/和抗肿瘤药物及其制备方法、苦豆双黄酮苷在制备抗病毒或/和抗肿瘤药物中的应用，本发明首次提出苦豆子中的化学成分苦豆双黄酮苷作为药物的用途，并首次将苦豆双黄酮苷应用于制备抗病毒药物和抗肿瘤药物。
本发明的技术方案之一是通过以下方式得到的：一种抗病毒或/和抗肿瘤药物，其为含有苦豆双黄酮苷的单位剂量形式，单位剂量中含苦豆双黄酮苷按重量计为45毫克至220毫克。
下面是对上述技术方案之一的进一步优化和/或选择：
上述抗病毒或/和抗肿瘤药物采用片剂或硬胶囊剂剂型。
上述的抗病毒或/和抗肿瘤药物按以下方法得到：
第一步，苦豆子种子或全草以水或乙醇粗提，其中水粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液；乙醇粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；
第二步，将上述粗提物浓缩液加相当于1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀得到乙醇溶液, 浓缩乙醇溶液并回收乙醇得浓缩液;
第三步,将上述第二步中的浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；
第四步，取上述提取物浸膏加3倍量至8倍量的水溶解后，以体积百分比浓度为10%的盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 萃取液合并后减压浓缩, 回收正丁醇, 得流浸膏;
第五步, 将上述流浸膏用2倍量至10倍量的水溶解后上聚酰胺层析柱吸附,
以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%至 60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；
第六步，将上述第五步中的浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%至50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并,于50℃至60℃减压浓缩成流浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得淡黄色苦豆双黄酮苷粉末；
第七步，取上述苦豆双黄酮苷粉末与赋形剂混合后，按单位剂量中含苦豆双黄酮苷45毫克至220毫克制成片剂或硬胶囊剂。
本发明的技术方案之二是通过以下方式得到的：一种上述的抗病毒或/和抗肿瘤药物的制备方法，其按以下方法制备：
第一步，苦豆子种子或全草以水或乙醇粗提，其中水粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液；乙醇粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；
第二步，将上述粗提物浓缩液加相当于1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀得到乙醇溶液, 浓缩乙醇溶液并回收乙醇得浓缩液;
第三步,将上述第二步中的浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；
第四步，取上述提取物浸膏加3倍量至8倍量的水溶解后，以体积百分比浓度为10%的盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 萃取液合并后减压浓缩, 回收正丁醇, 得流浸膏;
第五步, 将上述流浸膏用2倍量至10倍量的水溶解后上聚酰胺层析柱吸附,
以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%至 60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；
第六步，将上述第五步中的浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%至50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并,于50℃至60℃减压浓缩成流浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得淡黄色苦豆双黄酮苷粉末；
第七步，取上述苦豆双黄酮苷粉末与赋形剂混合后，按单位剂量中含苦豆双黄酮苷45毫克至220毫克制成片剂或硬胶囊剂。
本发明的技术方案之三是通过以下方式得到的: 苦豆双黄酮苷在制备抗病毒或/和抗肿瘤药物中的应用。
下面是对上述技术方案之三的进一步优化和/或选择：
上述苦豆双黄酮苷在制备治疗流感和/或乙型肝炎和/或艾滋病或/和肝癌和/或胃癌和/或肠癌和/或肺癌和/或宫颈癌药物中的应用。
本发明首次提出苦豆双黄酮苷作为药物的用途，并首次将苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊应用于治疗病毒性疾病和恶性肿瘤。体内、外实验研究表明，本发明苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊具有显著的抗流感病毒作用，其抗流感药效优于现有西药利巴韦林片。苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊在体外实验中还显示了较强的抗乙肝病毒作用及抗爱滋病毒作用。苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊对肝癌、胃癌、肠癌、肺癌及宫颈癌细胞均有明显的抗增殖作用，其抗肿瘤作用优于现有化学成分制剂羟基喜树碱注射液。本发明苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊可作为抗病毒药物治疗流感、乙肝和爱滋病，并可作为抗肿瘤药物用于治疗肝癌、胃癌、肠癌、肺癌及宫颈癌。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
下面结合实施例对本发明作进一步论述：
实施例1：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例2：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以40%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例3：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例4：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以50%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例5：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以50%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以40%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例6：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以50%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例7：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例8：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以40%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例9：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例10：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例11：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以50%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例12：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例13：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以40%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例14：苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例15：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例16：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以40%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例17：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例18：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以50%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例19：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以50%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以40%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例20：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以50%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例21：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例22：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以40%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例23：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例24：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例25：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以50%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例26：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例27：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以40%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
实施例28：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；加相当于粗提物浓缩液1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀, 浓缩并回收乙醇得浓缩液；浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏后，以稀盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 合并萃取液并减压浓缩, 回收正丁醇得流浸膏; 用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏后, 上聚酰胺层析柱吸附,以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 并于50℃至60℃减压浓缩成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解浸膏，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得苦豆双黄酮苷；取苦豆双黄酮苷与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁按重量比1比0.3比1比0.2配比制成颗粒,压片或装入硬胶囊壳,即得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊。
将上述实施例所得苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊进行药效学试验，其过程和结果如下：
苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊的规格为每片或每粒含苦豆双黄酮苷按重量计为45毫克至220毫克，临床用量为每次1至2片或粒，每天2至3次。
试验例1：本发明苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊抗流感病毒作用
实验材料：流感甲型病毒（H
3
N
2
亚型粤防72243株）、流感乙型病毒（济防97-13株）及狗肾传代细胞MDCK，分别购自中国预防医学科学院病毒学研究所，自行传代后备用。阳性对照药利巴韦林片，江西汇仁药业有限公司生产,批号0911025。 样品苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊, 由新疆药物研究所药理室提供，实验时将片剂粉碎或取胶囊内容物配成所需要浓度的溶液或混悬液给药，给药浓度或剂量均按苦豆双黄酮苷原料计。
苦豆双黄酮苷片样品对MDCK细胞毒性的测定：苦豆双黄酮苷片用营养液配成2毫克/毫升原液，以营养液作2倍稀释,取1000微克/毫升至62.5微克/毫升6个浓度；阳性对照利巴韦林片配成400微克/毫升原液，以营养液作2倍稀释,取200微克/毫升至6.25微克/毫升6个浓度，分别加到接种MDCK和Hela细胞并已长成单层的培养板中，100微升/孔，每浓度4个平行孔，同时设细胞对照。将培养板置37℃、5％CO
2
条件培养四天，每日观察细胞生长情况，以细胞不出现明显退变的最小稀释倍数为最大无毒浓度（TC
0
）。并按Reed-Muench法计算50%有毒浓度（TC
50
）。详见表一。
苦豆双黄酮苷片样品对病毒致细胞病变的影响：取接种后已长成单层的MDCK细胞培养板，吸弃上清液，设细胞对照组、病毒对照组、阳性对照利巴韦林片（取25微克/毫升至0.8微克/毫升共六个2倍稀释度）组和不同浓度苦豆双黄酮苷片给药组（取62.5微克/毫升至2.0微克/毫升共六个2倍稀释度），每组4个平行孔。病毒对照组、阳性对照组和给药组每孔接种病毒液100微升, 细胞对照组加等体积的维持液，置35℃吸附2小时后吸弃上清液，以不含血清的维持液洗细胞表面2次,给药组加入相应稀释度的苦豆双黄酮苷片样品溶液，细胞对照组、病毒对照组加等体积的维持液。于37°C、5%CO
2
条件培养，每日观察细胞病变情况，细胞病变程度按六级标准判断(－：无病变；±：细胞病约占整个单层的10％以下；1：细胞病变约占整个单层的25％以下；2：细胞病变约占整个单层的50％以下；3: 细胞病变约占整个单层的75％以下； 4: 细胞病变约占整个单层的75％以上)。
当病毒对照组细胞病变为4时记录实验结果。按Reed-Muench法计算半数有效浓度IC
50
,并计算苦豆双黄酮苷片样品的选择指数SI(TC
50
/IC
50
)，结果如表二所示。
苦豆双黄酮苷片抑制甲、乙型流感病毒的选择指数SI均大于利巴韦林，表明苦豆双黄酮苷片对流感病毒的抑制作用优于利巴韦林。以苦豆双黄酮苷胶囊进行上述实验，所得结果与苦豆双黄酮苷片相符。
试验例2：本发明苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊对小鼠流感病毒性肺炎模型的保护作用
测定流感病毒鼠肺适应株PR
8
－M
5
的毒力，取感染后15天内小鼠死亡率在90%以上的浓度作为实验浓度。
取小鼠100只，随机分为病毒感染对照组、利巴韦林对照组（剂量为40毫克/千克）和苦豆双黄酮苷片20、40、80毫克/千克三个剂量的给药组，每组20只。按剂量灌胃给药，每天一次，连续7天，病毒感染对照组灌胃等体积的蒸馏水。于第二天给药后，各组小鼠以乙醚吸入法麻醉，流感病毒鼠肺适应株PR
8
－M
5
以上述实验浓度滴鼻感染小鼠，0.05毫升/只。观察记录小鼠死亡情况，计算死亡保护率、平均存活天数及生命延长率，结果如表三所示。
苦豆双黄酮苷片20毫克/千克、40毫克/千克和80毫克/千克剂量对感染小鼠均有明显的保护作用，可明显降低感染小鼠的死亡率并延长存活时间。从上述实验所测得的死亡保护率和生命延长率数据可知，在临床等效剂量下，苦豆双黄酮苷片对小鼠流感病毒性肺炎模型的保护作用优于利巴韦林。以苦豆双黄酮苷胶囊进行上述实验，所得结果与苦豆双黄酮苷片相符。
试验例1和试验例2的研究结果表明，苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊的抗流感病毒作用明显优于西药利巴韦林。由于利巴韦林是临床治疗流感的经典药物，而苦豆双黄酮苷胶囊作为中药化学成分制剂，其的抗流感病毒作用超过等剂量的利巴韦林,因而该制剂作为抗病毒药物在治疗流感方面比现有药物具有突出的优势。
试验例3：本发明苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊抗乙肝病毒作用
实验材料：乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G
2
)的2.2.15细胞，购自北京大学人民医院肝病中心，以含谷氨酰胺的MEM培养液于37℃，5 % CO
2
条件下培养，大约一周传代一次。MEM培养基，GiBco,Invitrogen Corporation；胰酶，北京三博远志生物技术有限公司；小牛血清、HEPES，中国医科院生物医学工程研究所；乙肝病毒核酸定量检测试剂盒、cPCR－荧光探针，中山大学达安基因股份有限公司。阳性对照药苦参素胶囊，宁夏博尔泰力药业股份有限公司生产，批号：20030901。
实验前取苦豆双黄酮苷片样品配成4毫克（原料）/毫升原液，苦参素胶囊配制成1毫克（原料）/毫升原液, 过滤除菌后于4℃保存，临用时以培养液稀释成所需浓度给药。
细胞毒性的测定： 取2.2.15细胞接种96孔培养板，待细胞长成单层时，吸弃上清，设细胞对照组和苦豆双黄酮苷六个2倍稀释浓度（2000微克/毫升至62.5微克/毫升）的给药组，每组4孔，分别加样，200微升/孔，细胞对照组加等体积的培养液，于37℃、5％CO
2
条件培养，第4天各组换相应浓度的药液，第8天于显微镜下观察，以细胞病变CPE为指标，程度分为五级：完全破坏为4；75％为3；50％为2； 25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制百分率。观察最大无毒浓度TC
0
，并按Reed&Muench法计算半数有毒浓度TC
50
,结果如表四所示。
对乙肝病毒DNA复制的抑制作用： 取 2.2.15细胞接种96孔细胞培养板，每孔200微升，37℃、5％CO
2
条件培养，待细胞长成单层后，吸弃上清，设细胞对照组、苦参素（100微克/毫升）组、苦豆双黄酮苷四个浓度（取100微克/毫升至6.25微克/毫升共五个2倍稀释度）的给药组，每浓度4孔，分别加样，200微升/孔,于37℃、5 % CO
2
条件培养，第4天换一次药液，继续培养，于第8天收集细胞培养上清液，以荧光定量PCR法测定乙肝病毒DNA表达量（拷贝/毫升），计算苦豆双黄酮苷片样品的抑制率。按Reed&Muench法计算半数有效浓度IC
50
，并计算选择指数SI，结果如表五所示。
苦豆双黄酮苷片抑制乙肝病毒DNA复制的选择指数SI达86.8，其100微克/毫升浓度对乙肝病毒DNA的抑制率高于等浓度的苦参素胶囊。以苦豆双黄酮苷胶囊进行上述实验，所得结果与苦豆双黄酮苷片相符。本研究结果表明苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊对乙肝病毒有显著的抑制作用，其抗乙肝病毒作用优于等浓度的苦参素胶囊，临床可用于乙型肝炎的抗病毒治疗。
试验例4：本发明苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊在人类嗜T淋巴细胞病毒I型感染的T细胞系MT-4细胞中对爱滋病毒HIV-1 P24抗原的抑制作用
MT-4细胞悬液计数，用100CCID
50
的HIV-1 ⅢB感染细胞，在37℃，5%CO
2
培养箱中吸附1.5小时。用无血清的1640培养液洗去未吸附病毒，用培养液将感染病毒的细胞配成2×10
5
个细胞/毫升，接种于96孔细胞培养板内，每孔100微升；再分别加入3倍稀释的苦豆双黄酮苷片样品溶液和5倍稀释的阳性对照药齐多夫定（AZT）溶液100微升。每个稀释度重复3个孔，同时设细胞对照组和病毒对照组。培养板置于37℃、5%CO
2
饱和湿度培养箱内培养。4天后吸出上清，-20℃冻存，待测HIV-1 P24抗原滴度。细胞加MTT染色测药物对细胞的毒性。
染色测定细胞毒性：每孔加5毫克/毫升 MTT10微升染色，37℃、5%CO
2
饱和湿度培养箱内培养4小时后，每孔加入100微升50% DMF-17%Triton X-100脱色液，37℃过夜，酶标仪上波长为570纳米处测定OD值，计算苦豆双黄酮苷片样品的半数有毒浓度（TC
50
）。
测定苦豆双黄酮苷片样品在细胞培养内抑制HIV-1 P24抗原的EC
50
：将冻存的感染病毒的MT-4上清液融化后进行稀释，按预实验结果调整稀释比例。按照HIV-1 P24抗原检测试剂盒说明测定HIV-1 P24抗原滴度，加样组与病毒对照组比较，计算苦豆双黄酮苷片样品的EC
50
及选择指数SI（CC
50
/ EC
50
）。结果见表六所示。
本实验中苦豆双黄酮苷片抑制HIV-1 P24抗原的选择指数SI高于齐多夫定，以苦豆双黄酮苷胶囊进行上述实验，所得结果与苦豆双黄酮苷片相符。说明本发明苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊的抗艾滋病毒作用优于已上市西药齐多夫定片，提示苦豆双黄酮苷胶囊还可用于抗爱滋病治疗。
试验例5：苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊抗肿瘤作用
实验材料：人肝癌细胞HepG
2
、人胃癌细胞BGC823、直肠癌细胞HCT-8、人大细胞肺癌H460、人宫颈癌Hela细胞，均由中国医科院北京药物研究所肿瘤室提供。RPMI1640培养基，L-谷氨酰氨，Sigma出品；DMSO、HEPES，中国医科院生物医学工程研究所；MTT、胰蛋白酶(1:25)，Amresco，北京三博远志生物技术有限公司分装。对照药羟基喜树碱（规格5mg/2ml），批号050601,湖北美升药业有限公司。苦豆双黄酮苷片样品及对照药实验时均以营养液配成所需浓度的溶液，过滤除菌后加样。
细胞培养及接种 HepG
2
、 HCT-8、BGC823、 H460和Hela均为贴壁细胞，用含10 %小牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5 %CO
2
条件下培养。取生长活跃、形态良好的单层培养细胞用0.25 %的胰酶消化后，以RPMI1640培养液配成浓度为4.5×10
5
/ml的细胞悬液，接种于无菌96孔板，200μl/hole，24小时后，吸弃上清，苦豆双黄酮苷片样品以培养液配成1000、500、250、125μg/ml四个浓度加药，每浓度4个复孔,培养48小时后,加入以PBS配制的MTT（5mg/ml）10μl/hole，继续培养4小时，吸弃上清，加DMSO 100μl/hole，振摇后在酶标仪上于570nm测定OD值。实验重复三批。计算苦豆双黄酮苷片样品对细胞生长的抑制率CT，并用SPSS软件16.0计算苦豆双黄酮苷片样品对肿瘤细胞的半数抑制浓度IC
50
，三批实验结果如表七所示。
实验结果表明，苦豆双黄酮苷片对肝癌细胞HepG
2
、胃癌细胞BGC823、肠癌细胞HCT-8、宫颈癌Hela细胞和肺癌细胞H
460
细胞均有明显的抗增殖作用，其0.5毫克/毫升浓度对上述五肿瘤细胞的抑制率均达50％以上；在0.5毫克/毫升浓度下，苦豆双黄酮苷片对上述五种肿瘤细胞增殖的抑制率均高于羟基喜树碱注射液。以苦豆双黄酮苷胶囊进行上述实验，所得结果与苦豆双黄酮苷片相符。
结论：体外实验表明，苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊对人癌传代细胞HepG
2
、BGC823、HCT-8、Hela和H
460
的抗肿瘤作用优于等浓度的化学成分制剂羟基喜树碱注射液,提示其作为中药化学成分制剂在肝癌、胃癌、肠癌、宫颈癌及肺癌的化学治疗中有较高的应用价值。
根据以上试验例，苦豆双黄酮苷可应用于制备广谱抗病毒药物：苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊的抗病毒作用优于现有药物，抗流感病毒作用优于西药利巴韦林，其抗乙肝病毒作用优于化学成分制剂苦参素胶囊，其抗爱滋病毒作用优于西药齐多夫定片。根据以上实验例，苦豆双黄酮苷还可应用于制备抗肿瘤药物：苦豆双黄酮苷片或苦豆双黄酮苷胶囊对肝癌、胃癌、肠癌、宫颈癌和肺癌的抗肿瘤作用优于已上市的化学成分制剂羟基喜树碱注射液。
综上所述，苦豆双黄酮苷应用于制备抗病毒药物和抗肿瘤药物，苦豆双黄酮苷片和苦豆双黄酮苷胶囊具有广谱抗病毒作用，可治疗流感、乙型肝炎和爱滋病；苦豆双黄酮苷片和苦豆双黄酮苷胶囊还具有抗肿瘤作用，可治疗肝癌、胃癌、肠癌、宫颈癌和肺癌。实验研究证明，苦豆双黄酮苷片和苦豆双黄酮苷胶囊针对上述疾病的抗病毒药效或抗肿瘤药效优于现有药物，有良好的临床应用前景。
Claims (5)
1.一种制备治疗流感和/或乙型肝炎和/或艾滋病或/和肝癌和/或胃癌和/或肠癌和/或肺癌和/或宫颈癌药物的抗病毒或/和抗肿瘤药物，其特征在于是含有苦豆双黄酮苷的单位剂量形式，单位剂量中含苦豆双黄酮苷按重量计为45毫克至220毫克。
2.根据权利要求1所述的抗病毒或/和抗肿瘤药物，其特征在于该药物采用片剂或硬胶囊剂剂型。
3.根据权利要求1或2所述的抗病毒或/和抗肿瘤药物，其特征在于按以下方法得到：
第一步，苦豆子种子或全草以水或乙醇粗提，其中水粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；
第二步，将上述粗提物浓缩液加相当于1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀得到乙醇溶液, 浓缩乙醇溶液并回收乙醇得浓缩液;
第三步,将上述第二步中的浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；
第四步，取上述提取物浸膏加3倍量至8倍量的水溶解后，以体积百分比浓度为10%的盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 萃取液合并后减压浓缩, 回收正丁醇, 得流浸膏;
第五步, 将上述流浸膏用2倍量至10倍量的水溶解后上聚酰胺层析柱吸附,
以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%至 60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；
第六步，将上述第五步中的浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%至50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 于50℃至60℃减压浓缩成流浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得淡黄色苦豆双黄酮苷粉末；
第七步， 取上述苦豆双黄酮苷粉末与赋形剂混合后，按单位剂量中含苦豆双黄酮苷45毫克至220毫克制成片剂或硬胶囊剂。
4.一种根据权利要求1或2所述的抗病毒或/和抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于按以下方法制备：
第一步，苦豆子种子或全草以水或乙醇粗提，其中水粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至10倍量水,在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时,过滤,合并滤液并浓缩得粗提物浓缩液；
第二步，将上述粗提物浓缩液加相当于1倍量至2倍量体积的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀得到乙醇溶液, 浓缩乙醇溶液并回收乙醇得浓缩液;
第三步,将上述第二步中的浓缩液上AB-8型大孔树脂层析柱吸附,以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱除去杂质,再以50%的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，每浓度洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并,在50℃至80℃下浓缩,回收乙醇,得提取物浸膏；
第四步，取上述提取物浸膏加3倍量至8倍量的水溶解后，以体积百分比浓度为10%的盐酸调节pH值为2至3，用等体积的饱和正丁醇萃取3至5次, 萃取液合并后减压浓缩, 回收正丁醇, 得流浸膏;
第五步, 将上述流浸膏用2倍量至10倍量的水溶解后上聚酰胺层析柱吸附,
以3至8个柱体积的水洗脱聚酰胺层析柱除去杂质, 再以40%至 60%浓度的乙醇梯度洗脱上述层析柱，收集乙醇洗脱液并合并, 减压浓缩，回收乙醇得浓缩液；
第六步，将上述第五步中的浓缩液上Sephadex LH-20层析柱吸附, 以30%至50%的甲醇梯度洗脱层析柱，收集洗脱液并合并, 于50℃至60℃减压浓缩成流浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或无水乙醇溶解，放置24小时，析出淡黄色结晶, 将所得结晶真空干燥,即得淡黄色苦豆双黄酮苷粉末；
第七步， 取上述苦豆双黄酮苷粉末与赋形剂混合后，按单位剂量中含苦豆双黄酮苷45毫克至220毫克制成片剂或硬胶囊剂。
5.苦豆双黄酮苷在制备治疗流感和/或乙型肝炎和/或艾滋病或/和肝癌和/或胃癌和/或肠癌和/或肺癌和/或宫颈癌药物中的应用。
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