CN112852672A - 大肠杆菌及其在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用 - Google Patents

大肠杆菌及其在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌及其在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。所述的应用是将大肠杆菌经培养后获得的湿菌体为生物转化剂，以连翘苷为底物，以含湿菌体的发酵液或将湿菌体悬浮于生理盐水中构成转化体系，于35～38℃、120～200r/min恒温振荡条件下进行转化15～20h。转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得连翘脂素。在底物浓度为1mg/mL，体系中菌量为3.39×109CFU/mL时，连翘脂素的转化得率为97.1％。大肠杆菌SXUXJ‑1生长繁殖快、抗污染能力强、对氧气和温度不敏感，转化连翘苷的效率高，几乎无副产物生成，具有潜在的工业应用价值。

Description

大肠杆菌及其在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用
技术领域
本发明属于微生物和药物生物转化，具体涉及一种大肠杆菌及其在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。
背景技术
连翘脂素(phillygenin)，又名连翘苷元(CAS号为487-39-8，分子式为C21H24O6，分子量为372.41)，属于双环氧木脂素类物质。连翘脂素具有抗炎、抗肿瘤、保肝等多种生物活性，能预防或治疗由过氧化物引起的相关疾病，如类风湿关节炎，癌症，动脉粥样硬化和神经退行性等疾病。连翘脂素以游离状态存在于一些木犀科植物中，如连翘、流苏树和桂花等，因此，可以从这些植物中分离获得，但其含量相对较低。在上述植物中，连翘脂素更多的与葡萄糖结合成苷，即以连翘苷(phillyrin，CAS号为487-41-2，分子式为C27H34O11，分子量为534.56)的形式存在，含量相对较高。有报道连翘叶中连翘苷的含量可达3.14％，是连翘脂素含量的19.4倍。因此，采用适当方法将连翘苷转化为连翘脂素是一种制备连翘脂素的良好策略。目前，有报道采用纤维素酶转化连翘苷制备连翘脂素，转化时间为48h，转化率可达93.6％(一种制备抗病毒药物连翘脂素的方法，中国发明专利，CN 105331653 A)，但该方法的纤维素酶用量较大，是底物质量的1～10倍，酶的成本较高；此外，还有采用桔青霉转化连翘苷制备连翘脂素的方法(桔青霉LB及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用，中国发明专利，CN106282032A)，该方法所用霉菌需培养2-3天，时间长，较为繁琐，且桔青霉LB生长活力不如细菌。
为了克服现有连翘脂素制备方法的不足，本发明采用一种大肠杆菌转化连翘苷制备连翘脂素的方法(图1)，该菌株生长繁殖快，培养周期短，可进行连续发酵，并且抗污染能力强，对氧气和温度不太敏感。其转化连翘苷的效率高，几乎无副产物，在体系中连翘苷的浓度为1mg/mL、菌量为3.39×109CFU/mL时，连翘脂素的转化得率可达97.1％。
发明内容
本发明目的是提供一种大肠杆菌(Escherichia coli)SXUXJ-1，及其在转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。使用该菌株生长繁殖快，培养周期短，可进行连续发酵，并且抗污染能力强，对氧气和温度不太敏感，其转化连翘苷的效率高。
本发明提供的一种大肠杆菌(Escherichia coli)SXUXJ-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No:21514，保藏日期2020年12月21日，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明所述大肠杆菌SXUXJ-1，是从人肠道中分离，经过筛选得到的菌株。所述大肠杆菌SXUXJ-1的形态特征如下：平板上菌落为圆或近圆，边缘整齐表面光滑，颜色为乳白色，培养24h后菌落大小为2mm，菌株在液体培养基中培养24h后培养基变浑浊，产生气泡及沉淀。经革兰氏染色后在显微镜下可观察到菌体成短杆状，两端圆头。
所述大肠杆菌SXUXJ-1的16s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种所述大肠杆菌SXUXJ-1在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。
所述的应用是将大肠杆菌SXUXJ-1经扩增培养后获得的菌液为生物转化剂，以连翘苷为底物，将菌液加入到生理盐水中构成转化体系，于35～38℃、120～200r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得连翘脂素。
进一步，所述生物转化剂按如下方法制备：将大肠杆菌SXUXJ-1接种于GAM液体培养基于35～38℃进行扩增培养12～14小时，使处于生长对数期(OD600nm＝0.3～0.8)，7000-10000r/min离心收集菌体，以生理盐水稀释至活菌数为1×1011～4×1011CFU/mL(经平板计数法测得)，将菌液保存于终浓度20％甘油中置于-80℃冰箱备用。
进一步，所述转化体系中菌液与生理盐水体积比为1:80～120，底物连翘苷的终浓度为0.5～1.5mg/mL。
进一步，所述的转化反应条件为：在35～38℃、120～200r/min恒温振荡条件下转化15～20h。
进一步，所述的转化液分离纯化的方法：生物转化反应结束后，7000～10000r/min离心收集菌体；上清液水浴蒸干用两倍体积的乙酸乙酯萃取1～2次，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩并回收，用原转化体系1/5体积的甲醇溶解残留物，过滤、减压干燥，即得连翘脂素。
与现有技术相比本发明的有益效果：本发明提供一种利用大肠杆菌SXUXJ-1发酵获得生物转化剂，以连翘苷为底物制备连翘脂素的方法。该菌种生长繁殖快，平均每20分钟繁殖一代，培养周期短，可进行连续发酵，并且抗污染能力强，对氧气和温度不敏感；其转化连翘苷的效率高，几乎无副产物生成。在底物浓度为1mg/mL时，连翘脂素的转化得率可达97.1％。本发明将植物资源中含量较大，但活性较低的连翘苷转化为活性高的连翘脂素，具有潜在的工业应用价值。
附图说明
图1为连翘苷转化为连翘脂素的示意图
图2为SXUXJ-1转化连翘苷前后的液相色谱图；图中：A为菌液空白组；B为药物空白组；C为混标；D为实验组0h；E为实验组7h；F为实验组13h；G为实验组15h；
图3为SXUXJ-1生长曲线及转化连翘苷生成连翘脂素的时效曲线；
图4为UPLC-MS对产物鉴定质谱图；图中：A：转化15小时正离子模式一级质谱图；B：转化35小时正离子模式一级质谱图；C：标准品正离子模式一级质谱图；D：转化15小时二级质谱图；E：转化35小时二级质谱图；F：标准品二级质谱图；
图5SXUXJ-1的形态学观察图：A为固体培养基上形态图；B为显微镜镜检图；
图6为为SXUXJ-1的系统发育树图；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1转化菌种的分离、筛选及鉴定
(1)菌株的分离与筛选
肠道菌混悬液制备：取健康成人(三个月内未服用抗生素)的4g中段粪便，立即溶于20mL冰浴生理盐水中，搅拌均匀后经三层纱布过滤，弃去沉淀取上清即为肠道菌混悬液。
培养基的配制：GAM液体培养基为底物空白培养基，在GAM液体培养基中加入终浓度为0.5mg/mL的连翘苷为含底物的GAM液体培养基。在GAM液体培养基中加入琼脂为固体GAM培养基。
菌株初筛：量取4mL含底物的GAM液体培养基于5mL离心管中，加入肠道菌混悬液1mL，置于37℃厌氧培养箱中培养12小时后取出，振荡均匀获得转化液。吸取1mL转化液加入4mL甲醇，8000r/min离心10min去除蛋白，将上清液减压蒸干后以2mL乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液减压蒸干后用1mL甲醇复溶，过0.22μm滤膜、UPLC分析。同时做菌液空白及底物空白，各样平行3份。
涂布平板法复筛：在超净工作台中取上述含肠道菌的转化液配置成浓度梯度依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌液。吸取100μL不同浓度菌液分别加入到固体培养基中，用涂布棒涂布均匀，然后置于37℃厌氧培养箱中倒置培养至长出菌落。
试管再纯化：挑取平板中形态及颜色不同的单菌落，于试管中划线培养再纯化，至同一试管中长出的菌落形态及颜色均相同，获得纯化的单菌株。
单菌扩增培养：取9mL GAM液体培养基于10mL带盖EP管中，分别接种不同的单菌株，置厌氧箱中进行单菌扩增培养，至OD600nm值为0.7-0.8。
单菌株转化连翘苷：取4mL含底物的GAM液体培养基于5mL带盖EP管中，加入1mL扩增后的单菌株菌液。平行制备11份置于厌氧箱中37℃培养。分别于0h、1h、3h、5h、7h、9h、11h、13h、15h、25h、35h取出一管，震荡均匀。吸取1mL加入2mL甲醇中淬灭并沉淀去除蛋白。过滤、上清液水浴蒸干，然后，分别用3mL乙酸乙酯溶解、提取两次，合并提取液、减压浓缩，再用1mL甲醇复溶，过0.22μm滤膜、UPLC分析。单菌株保存于终浓度为20％甘油中，置于-80℃冰箱保存。
UPLC分析方法：使用Waters ACQUITY H-class型超高效液相色谱仪，ACQUITY-UPLC-BE H C18色谱柱(1.7mm,2.1′100mm)。流动相为乙腈(A)-0.2％甲酸水溶液(B)。梯度洗脱(0～4m in:10％-23％A；4～9.5min:23％-23％A；9.5～11min:23％-30％A；11～15min：30％～40％A；15～17min：40％～10％A；17～18min：10％～10％A)。流速0.3mL/min，检测波长280nm，柱温40℃，进样量2μL。
按本实施例方法，其中菌株SXUXJ-1转化连翘苷液相色谱图(图2)表明转化产物保留时间与连翘脂素标准品一致。从生长及转化曲线(图3)可以看出连翘苷可以实现完全转化，经计算连翘脂素实际得率与理论得率相比可达96.04％，并且，在转化完成后的20小时内量未减少，可以保持稳定。
(2)液相色谱-质谱联用法对产物的鉴定
采用液相色谱-质谱联用的方法，将菌株SXUXJ-1转化连翘苷的产物与连翘脂素标准品比对保留时间，一级碎片，二级碎片来鉴定产物。
UPLC-MS质谱条件：采用ESI电喷雾离子化方式；以正负离子切换采集模式，扫描模式：full scan/dd-MS2,m/z采集范围为100～1000。喷雾电压正极为3.5kV；负极为2.5kV。毛细管温度为320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb；分辨率设定为MS full scan 35000FWHM以及MS/MS 17500FWHM，NCE设定为12.5、25和37.5eV。
质谱图(图4)显示：在正离子模式下，样品的碎片离子峰与对照品的碎片离子峰(355.15、373.16、390.19、189.09、395.15)保持一致。推测其中质核比为355.15的碎片为连翘脂素中性损失水而产生。比较其二级质谱图，相对丰度较高的五个碎片分别为337.14、355.15、284.10、137.06、286.11，以上五个碎片在样品与标准品中均保持一致。结合样品与标准品液相色谱保留时间的一致性，可以判断产物为连翘脂素。
(3)菌株SXUXJ-1的分类鉴定
将菌株接种在GAM液体培养基中，于37℃下培养15h后，可以观察到培养基变浑浊，产生气泡及沉淀。将菌株接种于GAM平板上培养，可以观察到菌落为圆或近圆，边缘整齐表面光滑，颜色为乳白色，培养24h后菌落大小为2mm。革兰氏染色后在显微镜下可观察到菌体成短杆状，两端圆头，染色结果为阴性，见图5。
将菌株交由华大基因科技有限公司武汉分公司进行16S rDNA测序。菌株SXUXJ-1的16S rDNA序列长度为1409bp，序列SEQ ID NO:1如下所示。
将所得细菌的序列提交数据库，利用NCBI网站在线Blast分析序列的同源性，并与核酸序列数据库中的序列进行比对分析，发现所有与该序列高度同源(99％)的序列均为肠杆菌科埃希氏属。利用MEGA 5.1软件构建16S rDNA序列系统发育树(图6)。比对结果及系统发育树显示该菌株与大肠杆菌亲缘关系较近。综合以上特征可以确定菌株SXUXJ-1为肠杆菌科埃希氏属的一株大肠杆菌(Escherichia coli)，定名为大肠杆菌SXUXJ-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No:21514，保藏日期2020年12月21日，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
实施例2
将大肠杆菌SXUXJ-1接种于GAM液体培养基于37℃进行扩增培养12小时，使处于生长对数期(OD600nm＝0.5)，8000r/min离心收集菌体，以生理盐水稀释至活菌数2.94×1011CFU/mL(经平板计数法测得)，将菌液保存于终浓度20％甘油中置于-80℃冰箱备用。
取0.5mL菌液加入到50mL生理盐水中，加入连翘苷使终浓度为1.0mg/mL。然后放入厌氧袋中，在37℃、200r/min条件下恒温振荡转化16小时。转化结束后，离心去除菌体，将上清液水浴蒸干后以2mL乙酸乙酯提取2次，提取液减压浓缩，残渣用10mL甲醇溶解、过滤、减压干燥，即得连翘脂素33.27mg。经计算后的连翘脂素得率为95.5％。
实施例3
将大肠杆菌SXUXJ-1接种于GAM液体培养基于35℃进行扩增培养13小时，使处于生长对数期(OD600nm＝0.6)，8000r/min离心收集菌体，以生理盐水稀释至活菌数1.57×1011CFU/mL(经平板计数法测得)，将菌液保存于终浓度20％甘油中置于-80℃冰箱备用。
取0.5mL菌液加入到50mL生理盐水中，加入连翘苷使终浓度为0.6mg/mL。然后放入厌氧袋中，在35℃、130r/min条件下恒温振荡转化18小时。转化结束后，离心去除菌体，将上清液水浴蒸干后以2mL乙酸乙酯提取2次，提取液减压浓缩，残渣用10mL甲醇溶解、过滤、减压干燥，即得连翘脂素20.11mg。经计算后连翘脂素得率为96.2％。
实施例4
将大肠杆菌SXUXJ-1接种于GAM液体培养基于38℃进行扩增培养13小时，使处于生长对数期(OD600nm＝0.7)，8000r/min离心收集菌体，以生理盐水稀释至活菌数3.39×1011CFU/mL(经平板计数法测得)，将菌液保存于终浓度20％甘油中置于-80℃冰箱备用。
取0.5mL菌液加入到50mL生理盐水中，加入连翘苷使终浓度为1.5mg/mL。然后放入厌氧袋中，在38℃、200r/min条件下恒温振荡转化20小时。转化结束后，离心去除菌体，将上清液水浴蒸干后以2mL乙酸乙酯提取2次，提取液减压浓缩，残渣用10mL甲醇溶解、过滤、减压干燥，即得连翘脂素50.74mg。经计算后连翘脂素得率为97.1％。
实施例5：有氧条件下使用菌体转化连翘苷
在实施例2的基础上只改变厌氧培养为普通培养箱中培养，其余条件均不改变，同时做厌氧培养对照。普通培养箱培养及厌氧条件培养对比结果如(表1)所示：
表1普通培养箱培养及厌氧条件培养对比
Figure BDA0002937866630000061
有氧及厌氧培养条件下连翘脂素的最终得率分别为96.9％和96.0％。因此结合表1，可以看出是否提供厌氧培养条件对连翘苷转化率与连翘脂素转化得率无明显影响。在后续转化中无需提供严格厌氧环境，这样可以大大减少成本及降低操作复杂性。
实施例6：
本实施例是在实施例2的基础上将转化体系放大，在非厌氧条件下反应。具体为取20mL菌液(经平板计数法测得活菌数为2.94×1011CFU/mL)加入到2L生理盐水中，加入连翘苷使终浓度为1.5g/L。在36℃、200r/min条件下恒温振荡转化20小时。转化结束后，离心去除菌体，将上清液水浴蒸干后以100mL乙酸乙酯提取2次，提取液减压浓缩，残渣用200mL甲醇溶解、过滤、减压干燥，即得连翘脂素2.02g。经计算后连翘脂素得率为96.8％。
序列表
<110> 山西大学
<120> 大肠杆菌及其在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1409
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 1
aagtcgaacg gtaacaggaa gcagcttgct gcttcgctga cgagtggcgg acgggtgagt 60
aatgtctggg aaactgcctg atggaggggg ataactactg gaaacggtag ctaataccgc 120
ataacgtcgc aagaccaaag agggggacct tcgggcctct tgccatcgga tgtgcccaga 180
tgggattagc ttgttggtgg ggtaacggct cacctaggcg acgatcccta gctggtctga 240
gaggatgacc agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt 300
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tcatcatggc ccttacgacc agggctacac acgtgctaca atggcgcata caaagagaag 1200
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actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtggat cagaatgcca cggtgaatac 1320
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca aaagaagtag 1380
gtagcttaac cttcgggagg gcgctacca 1409

Claims (7)

1.大肠杆菌(Escherichia coli)SXUXJ-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No:21514，保藏日期2020年12月21日。
2.如权利要求1所述大肠杆菌SXUXJ-1在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是将大肠杆菌SXUXJ-1经扩增培养后获得的菌液为生物转化剂，以连翘苷为底物，将菌液加入到生理盐水中构成转化体系，于35～38℃、120～200r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得连翘脂素。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述生物转化剂按如下方法制备：将大肠杆菌SXUXJ-1接种于GAM液体培养基于35～38℃进行扩增培养12～14小时，7000-10000r/min离心收集菌体，以生理盐水稀释至活菌数1×1011～4×1011CFU/mL，将菌液保存于终浓度20％甘油中置于-80℃冰箱备用。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中菌液与生理盐水体积比为1:80～120，底物连翘苷的终浓度为0.5～1.5mg/mL。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的转化反应时间为15～20h。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的转化液分离纯化的方法：生物转化反应结束后，7000～10000r/min离心收集菌体；上清液水浴蒸干用两倍体积的乙酸乙酯萃取1～2次，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩并回收，用原转化体系1/5体积的甲醇溶解残留物，过滤、减压干燥，即得连翘脂素。
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