CN110373359B - 一种白色链霉菌X-18及利用该菌生产ε-聚赖氨酸的方法 - Google Patents

一种白色链霉菌X-18及利用该菌生产ε-聚赖氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种白色链霉菌X‑18及利用该菌生产ε‑聚赖氨酸的方法，属于生物工程技术领域。所述白色链霉菌X‑18是从土壤中分离并筛选得到的，已进行保藏，保藏编号为CGMCC No.17536。利用所述白色链霉菌X‑18发酵生产ε‑聚赖氨酸，并通过对发酵培养基和发酵条件的改良，结合中间补料和添加诱导物的方法，使ε‑聚赖氨酸的发酵产量可达到3.5‑4.2g/L。本发明主要使用具有自主知识产权的菌种，并使用价格低廉的玉米淀粉作为发酵培养基的主要成分，降低了生产成本，提高了发酵产量。

Description

一种白色链霉菌X-18及利用该菌生产ε-聚赖氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种白色链球菌X-18及利用该菌生产ε-聚赖氨酸的方法。
背景技术
食品在贮存中极易受微生物侵袭，引起的霉变、腐败对人类生活带来很大影响。据不完全统计，世界上约有 20%的食品因霉变、腐败而浪费掉，同时还危及人们的健康。传统的防腐方法如干制、盐腌等会使处理后的食品风味等发生很大变化。因此，添加食品防腐剂仍是食品加工保藏的有效手段之一。在人工合成食品防腐剂的使用过程中，人们逐渐发现其对人身健康造成很大影响。近年来，天然防腐剂的研究与使用逐渐吸引了人们的注意力，并已成为当今食品保藏研究的热点。
ε-聚赖氨酸（ε-Poly-L-lysine，ε-PL）是多以链霉菌属的好氧发酵培养得到的一种天然微生物代谢产物，由10～40个不等赖氨酸残基通过α-ε酰胺键连接而成，25～35个氨基酸残基的ε-聚赖氨酸具有较强的抗微生物活性，通常用作食品防腐剂，在人体内可分解为L-赖氨酸，作为人体必需氨基酸被吸收，不存在任何毒副作用，具有防腐和营养强化双重功能，其具有热稳定性好、水溶性强、安全性高、抗菌谱广等优点，广泛用于食品保鲜，是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类食品防腐剂。此外，在基因治疗、微囊药物的制备、高分子材料等领域中，聚赖氨酸亦有着广泛的用途，优良防腐性能和巨大商业潜力。
ε-聚赖氨酸产生菌主要有链霉菌属、芽孢杆菌属和北里孢菌属，不同菌株的ε-聚赖氨酸的摇瓶发酵产量差别较大，高产菌株主要集中在放线菌属的菌株，在不同种类链霉菌中，ε-聚赖氨酸的发酵产量相差比较大，最低的仅为0.4g/L，而最高的金霉素链霉菌的产量可以达到4.5 g/L。ε-聚赖氨酸的研究在日本进行的较早并比较成熟，并且获得了多株自主知识产权的菌株；我国的相关研究起步较晚，江南大学、天津科技大学、南京工业大学、华南理工大学和南开大学等单位在ε-聚赖氨酸产生菌株的筛选、诱变、分子改良育种及发酵生产上做了大量的研究，但具有自主知识产权的菌株较少；并且通过添加外源诱导物刺激ε-聚赖氨酸产量的提高报道较少。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一种产ε-聚赖氨酸的白色链球菌X-18，目的二在于提供利用所述白色链球菌X-18生产ε-聚赖氨酸；所述方法通过对白色链霉菌X-18发酵培养基和发酵条件的改良，并结合添加诱导物和补料的方法，使ε-聚赖氨酸的产量大幅度提高。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种白色链霉菌X-18，分类命名为白色链霉菌(Streptomyces albulus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCC No. 17536，保藏时间为2019年04月09日。
本发明另外请求保护利用上述白色链球菌X-18发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，包括以下步骤：
步骤一、斜面固体培养
将菌种接种在固体斜面培养基上，于25～32℃培养4~7天，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；
步骤二、摇瓶种子培养
取步骤一得到的活化菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一环菌种加入2～3mL；将菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体种子培养基体积的5～10%，培养温度25～32℃，摇床速度150～250 r/min，培养时间1～2 天，得到摇瓶种子液，备用；
所述的液体种子培养基的配方为：每1000mL培养基中包含蛋白胨8～14 g、酵母粉4～8 g和NaCl 4～8 g，余量为水；pH为7.0～7.5。
步骤三、发酵罐培养
将经步骤二培养好的摇瓶种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，接种量为发酵培养基体积的5～10%，培养温度26～30℃，DO 70-90%，搅拌速度200～300 r/min，发酵液的体积与每分钟通入发酵液的空气体积比为1：2～1：5；其中，在发酵培养0-48h时向发酵液中添加无水乙醇作为诱导物，发酵培养48h后每隔24h向发酵液中添加补料液；培养时间5～7天，即可得含有ε-聚赖氨酸的发酵液；
所述的发酵培养基配方如下：每1000mL培养基，玉米淀粉10～20g，酵母粉5～10g，(NH4)2SO4 8～12g，K2HPO4 0.5～1.5g，KH2PO4 0.8～1.5g，MgSO4 0.5～1.0g，ZnSO4 0.03～0.05g，FeSO4 0.03～0.05g，pH 7.0～7.5，余量为水；
所述的补料液的组成为：每100mL补料液中含有大豆油1～3g、葡萄糖2～5g、柠檬酸二钠0.1～0.3g和硫酸铵0.3～0.5g，余量为水；所述补料液的pH 7.0～7.5。
作为对上述方案的进一步优化，所述诱导物的添加量为：每100mL发酵液中添加1～3mL 无水乙醇。
作为对上述方案的进一步优化，所述补料液的添加量为发酵液体积的5%。
作为对上述方案的进一步优化，步骤一所述固体斜面培养基的配方如下：每1000mL培养基中包括葡萄糖7～15g、蛋白胨 1.0～5.0g、酵母粉1～3g和琼脂 15～20g，余量为水；所述固体斜面培养基pH 7.2～7.8。
有益效果：
本发明的特点是从土壤中分离了有效产生ε-聚赖氨酸的白色链霉菌CGMCC No.17536，其在有氧等适合条件下，能显著积累ε-聚赖氨酸。可以利用相对廉价的玉米淀粉等可再生的农副产品为原料发酵生产ε-聚赖氨酸，是一种可持续生产方法；并且向发酵培养基中添加诱导物乙醇和采取补料的方式，提高发酵产物ε-PL的产量。
附图说明
图1是白色链霉菌X-18菌落图；
图2是白色链霉菌X-18菌丝体扫描电镜图；
图3 是白色链霉菌X-18发育树；
图4是白色链霉菌X-18发酵产物对不同微生物的抑菌效果图；
图5是利用本发明所述白色链霉菌获得的ε-PL的紫外光谱图；
图6是利用本发明所述白色链霉菌获得的ε-PL的红外光谱图；
图7是利用本发明所述白色链霉菌获得的ε-PL的质谱图；
图8是利用本发明所述白色链霉菌获得的ε-PL的氢谱图；
图9是利用本发明所述白色链霉菌获得的ε-PL的碳谱图。
具体实施方式
一、一种产ε-聚赖氨酸的微生物菌株筛选和鉴定，其具体步骤如下：
本发明从土壤（土样采自河南、河北、江苏等地）中采样，取较干、较肥沃土表下5～10cm处土壤于富集培养基中富集培养1～2天，再涂布于加有亚甲基蓝的固体平板中，30℃恒温培养5～7天，划线纯化形成较大透明圈的菌落，同时接种菌落于种子培养基，1天后转接发酵培养基。ε-PL是生物碱，可与DR碘化铋钾试剂反应可产生红色沉淀，来发酵复筛ε-PL产生菌。利用Itzhaki方法（利用分光光度计，取2mL稀释到适当浓度的发酵液与2mL 1mmol/L甲基橙混合，于30℃振荡，离心后在465nm处测吸光度），并根据ε-PL标准曲线计算得到发酵液中ε-PL的质量浓度，从而筛选出产量较高，遗传稳定性较好的产ε-PL菌株X-18菌株。X-18菌的发酵液离心除菌体后，用阳离子树脂D152进行产物吸附，蒸馏水及0.2M醋酸洗涤树脂，洗去未吸附的杂质；利用0.1M的稀盐酸洗脱产物，洗脱液利用2M的NaOH溶液中和pH至7.0后进行减压蒸发浓缩和活性炭过滤脱色。利用透过分子量为1000的透析袋进行除盐，收集透析袋内的液体，冻干获得ε-PL，对该物质的紫外光谱（图5）、红外光谱（图6）、质谱（图7）、氢谱（图8）和碳谱（图9）等谱图进行分析，该ε-聚赖氨酸的分子量为3347-3860Da，结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明筛选得到的能有效积累ε-PL的微生物X-18，经16S rDNA序列分析和按《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》生理生化鉴定，为放线菌目（Actinomycetales）链霉菌科（Streptomycetaceae）链霉菌属（Streptomyces）的白色链霉菌(Streptomyces albulus)。该菌为纤细，多核菌丝，革兰氏阳性，分离时菌落小，分散呈地衣状，最初表面光滑，然后发育一层短菌丝体，呈绒状。异养菌，生长利用葡萄糖，可水解明胶，淀粉，好氧菌，最适温度25～32℃，生长最适pH6.5～8.0。
二、一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵工艺方法，其具体步骤如下：
（1）斜面固体培养
将筛选菌株接种在固体斜面培养基上，25～32℃培养4~7天，得到斜面固体培养的菌种，备用；
所述的固体斜面培养基配方为：每1000mL培养基，加入葡萄糖7～15g，蛋白胨 1.0～5.0g，酵母粉1～3 g和琼脂 15～20g，pH 7.2～7.8，余量为水。
（2）摇瓶种子培养
取上述步骤（1）所制备的斜面固体培养的菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一环菌种加入2～3mL；将菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体种子培养基体积的5～10%，培养温度25～32℃，摇床速度150～250 r/min，培养时间1～2 天，得到摇瓶种子液，备用；
所述的液体种子培养基配方为：每1000mL培养基，种子培养基组成：蛋白胨8～14g，酵母粉4～8 g，NaCl 4～8 g，pH7.0～7.5，余量为水。
（3）发酵罐培养
将上述步骤（2）培养好的摇瓶种子液接种于5L发酵罐中发酵，装液量为3L，接种量为发酵培养基体积的5～10%，培养温度26～30℃，DO 70-90%，搅拌速度200～300 r/min，发酵液的体积与每分钟通入发酵液的空气体积比为1：2～1：5，其中，在发酵培养0-48h时向发酵液中添加无水乙醇作为诱导物，2天后每隔24h添加补料液，培养时间5～7天，即可得含有ε-聚赖氨酸的发酵液，发酵产量可达到3.5-4.2g/L。
所述的发酵培养基配方如下：每1000mL培养基，玉米淀粉10～20g，酵母粉5～10g，(NH4)2SO4 8～12g，K2HPO4 0.5～1.5g，KH2PO4 0.8～1.5g，MgSO4 0.5～1.0g，ZnSO4 0.03～0.05g，FeSO4 0.03～0.05g，pH 7.0～7.5，余量为水。
所述诱导物的组成如下：每100mL发酵液中添加1～3mL 无水乙醇。
所述的补料液的组成为：每100mL补料液中含有大豆油1～3g，葡萄糖2～5g，柠檬酸二钠0.1～0.3g，硫酸铵0.3～0.5g，pH 7.0～7.5，余量为水。所述补料液的添加量为：每100mL发酵液中添加5mL 补料液。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
说明如何筛选得到产生ε-PL的菌株白色链霉菌(Streptomyces albulus) X-18
（1）土样采集：土壤（土样采自河南、河北、江苏等地）采样，取较干、较肥沃土表下5cm处土壤。
（2）富集培养：采集土壤样本30份，分别称取2.5g样品添加到25mL无菌富集培养基中，在28℃、150rpm恒温培养2天。
富集培养基的组成为（g/L）：甘油 10，琼脂 15，酵母膏 0.1，NaH2PO4 0.68，MgSO4·7H2O 0.25，(NH4) 2SO4 0.66，140mL 痕量矿物溶液， pH 7.0，余量为水。
痕量矿物溶液组成为（g/L）： NaCl 1， FeSO4·7H2O 0.1， ZnSO4·7H2O 0.1，CaCl2·2H2O 0.1，明矾 0.01，CuSO4·5H2O 0.01，CoCl2·6H2O 0.1，H3BO3 0.01， NH4MO2·4H2O 0.01，余量为水。
（3）平板初筛：取1mL富集好的菌悬液10倍稀释法稀释适当浓度（10-4，10-5，10-6），涂布于加有0.02g/L的亚甲基蓝和0.05g/L K2Cr7O7的平板上，28℃恒温培养7d。观察菌落生长情况，划线纯化形成较大透明圈的菌落，对其进行摇瓶发酵复筛。
（4）摇瓶复筛：挑取菌落接种于液体培养基中，28℃活化培养24 h。再将活化好的种子悬液接种到发酵培养基中，28℃发酵培养，对发酵产物进行定性及定量检测，选择ε-PL产量较高的菌株X-18（见图1和图2）。用接种环转接于贝特纳斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，置于4℃冰箱保存备用。
实施例2
说明如何实现鉴定筛选得到的白色链霉菌(Streptomyces albulus) X-18
（1）分离纯化出单菌落斜面交由上海生物工程有限公司测序，测序结果提交到NCBI数据库进行比对。结果显示，菌株X-18与白色链霉菌的16S rDNA 序列的同源性高达98％。采用MEGA 6.0软件构建出X-18菌株的系统发育树见图3，从进化距离分析发现X-18与白色链霉菌标准模式菌株接近。
（2）通过菌株X-18的形态特征、生理生化特征（见下表1）、16SrDNA特征，确定菌株X-18为白色链霉菌 (Streptomyces albulus) 。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
将鉴定为白色链霉菌(Streptomyces albulus) 的菌株X-18进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.17536，保藏日期为2019年04月09日。
所述编号为CGMCC 17536的白色链霉菌菌株X-18的16S rDNA 的碱基序列如SEQID NO：01所示。
实施例3
说明如何实现产物ε-聚赖氨酸产量的提高，实施方法如下：
（1）斜面固体培养
将白色链霉菌CGMCC No. 17536菌株接种在固体斜面培养基上，26℃培养5天，得到斜面固体培养的菌种，备用；
所述的固体斜面培养基配方为：每1000mL培养基，加入蛋白胨 2.0g，葡萄糖7 g，酵母粉1 g和琼脂 15g，pH 7.5，余量为水。；
（2）摇瓶种子培养
取上述步骤（1）所制备的斜面固体培养的菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一环菌种加入2mL；将菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体种子培养基体积的5%，培养温度26℃，摇床速度200 r/min， pH 7.5，培养时间2 天，得到摇瓶种子液，备用；
所述的液体种子培养基配方为：每1000mL培养基中：蛋白胨8g，酵母粉4g，NaCl 5g，pH 7.5，余量为水。
（3）发酵罐培养
将上述步骤（2）培养好的摇瓶种子液接种于5L发酵罐中发酵，装液量为3L，接种量为发酵培养基体积的6%，培养温度26℃，DO 70%，搅拌速度200 r/min，发酵液的体积与每分钟通入发酵液的空气体积比为1：2.5，pH 7.5。其中，在发酵培养12h时向发酵液中添加无水乙醇，所述无水乙醇的添加量为：每100mL发酵液中添加1mL 无水乙醇；2天后每隔24h添加补料液，所述补料液的添加量为每100mL发酵液中添加5mL 补料液。培养时间5天，即可得含有ε-聚赖氨酸的发酵液，发酵产量可达到3.6g/L；
所述的发酵培养基配方如下：每1000mL培养基中含有玉米淀粉12g，酵母粉6g，(NH4)2SO4 8g，K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.8g，MgSO4 0.5 g，ZnSO4 0.03g，FeSO4 0.03g，pH 7.2，余量为水。
所述的补料液的组成为：每100mL补料液中含有大豆油1g，葡萄糖3g，柠檬酸二钠0.1g，硫酸铵0.3g，pH 7.0，余量为水。
实施例4
说明如何实现产物ε-聚赖氨酸产量的提高，实施方法如下：
（1）斜面固体培养
将白色链霉菌CGMCC No. 17536接种在固体斜面培养基上，28℃培养4天，得到斜面固体培养的菌种，备用；
所述的固体斜面培养基配方为：每1000mL培养基，加入蛋白胨 3.0g，葡萄糖10g，酵母粉2g和琼脂 17g，pH 7.3，余量为水。
（2）摇瓶种子培养
取上述步骤（1）所制备的斜面固体培养的菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一环菌种加入2mL；将菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体种子培养基体积的8%，培养温度28℃，摇床速度220 r/min， pH 7.2，培养时间2 天，得到摇瓶种子液，备用；
所述的液体种子培养基配方为：每1000mL培养基中：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 6g，pH 7.2，余量为水。
（3）发酵罐培养
将上述步骤（2）培养好的摇瓶种子液接种于5L发酵罐中发酵，装液量为3L，接种量为发酵培养基体积的8 %，培养温度28℃，DO 80%，搅拌速度220 r/min，发酵液的体积与每分钟通入发酵液的空气体积比为1：3，其中，在发酵培养18h时向发酵培养基中添加无水乙醇，所述无水乙醇的添加量为：每100mL发酵液中添加2mL 无水乙醇；2天后每隔24h添加补料液，所述补料液的添加量为每100mL发酵液中添加5mL 补料液。培养时间6天，即可得含有ε-聚赖氨酸的发酵液，发酵产量可达到3.9g/L；
所述的发酵培养基配方如下：每1000mL培养基，加入玉米淀粉17g，酵母粉6g，(NH4)2SO4 10g，K2HPO4 1.2g，KH2PO4 0.8g，MgSO4 0.8g，ZnSO4 0.04g，FeSO4 0.04g，pH7.5，余量为水。
所述的补料液的组成为：每100mL补料液中含有大豆油2g，葡萄糖4g，柠檬酸二钠0.3g，硫酸铵0.5g，pH6.8。
实施例5
一种提高白色链霉菌(Streptomyces albulus) X-18发酵产物ε-PL产量的方法。
（1）斜面固体培养
将白色链霉菌CGMCC No. 17536接种在固体斜面培养基上，30℃培养3天，得到斜面固体培养的菌种，备用；
所述的固体斜面培养基配方为：每1000mL培养基，加入蛋白胨 5.0g，葡萄糖15g，酵母粉3g和琼脂 18g，pH 7.0，余量为水。
（2）摇瓶种子培养
取上述步骤（1）所制备的斜面固体培养的菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一环菌种加入3mL；将菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体种子培养基体积的10%，培养温度32℃，摇床速度250 r/min，培养时间2 天，得到摇瓶种子液，备用；
所述的液体种子培养基配方为：每1000mL培养基中：蛋白胨14g，酵母粉8g，NaCl8g，pH 7.0，余量为水。
（3）发酵罐培养
将上述步骤（2）培养好的摇瓶种子液接种于5L发酵罐中发酵，装液量为3L，接种量为发酵培养基体积的10%，培养温度32℃，DO 90%，搅拌速度250 r/min，发酵液的体积与每分钟通入发酵液的空气体积比为1：4，其中，在发酵培养24h时向发酵培养基中添加无水乙醇，所述无水乙醇的添加量为：每100mL发酵液中添加3mL 无水乙醇；2天后每隔24h添加补料液，所述补料液的添加量为每100mL发酵液中添加5mL 补料液。培养时间6天，即可得含有ε-聚赖氨酸的发酵液，发酵产量可达到4.2g/L；
所述的发酵培养基配方如下：每1000mL培养基，加入玉米淀粉20g，酵母粉10g，(NH4)2SO4 10g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1.5g，MgSO4 0.8g，ZnSO4 0.05g，FeSO4 0.05g，pH7.0，余量为水。
所述的补料液的组成为：每100mL补料液中含有大豆油3g，葡萄糖3g，柠檬酸二钠0.2g，硫酸铵0.3g，pH 7.0，余量为水。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 一种白色链霉菌X-18及利用该菌生产ε-聚赖氨酸的方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1482
<212> DNA
<213> 白色链霉菌
<400> 1
gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgaacgat 60
gaacctcctt cgggagggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc 120
ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatatgacac ggggtcgcat 180
gatctccgtg tggaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg 240
tgaggtagtg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca 300
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat 360
gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct 420
ctttcagcag ggaagaagcg agagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg 480
tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc gagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540
agctcgtagg cggcttgtca cgtcggatgt gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca 600
ttcgatacgg gcaggctaga gttcggtagg ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa 660
atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc gatactgacg 720
ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780
acgttgggaa ctaggtgtgg gcgacattcc acgtcgtccg tgccgcagct aacgcattaa 840
gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg 900
cacaagcagc ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg 960
acatacaccg gaaaaccgtg gagacacggt cccccttgtg gtcggtgtac aggtggtgca 1020
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tgttctgtgt tgccagcatg cctttcgggg tgatggggac tcacaggaga ctgccggggt 1140
caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca 1200
cacgtgctac aatggccggt acaatgagct gcgataccgc gaggtggagc gaatctcaaa 1260
aagccggtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagttgctag 1320
taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggaatc 1440
gtcgaaggtg ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaacaa gg 1482

Claims (2)

1.一种发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于：利用白色链球菌X-18发酵生产ε-聚赖氨酸，包括以下步骤：
步骤一、斜面固体培养
将菌种接种在固体斜面培养基上，于25～32℃培养4~7天，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；
步骤二、摇瓶种子培养
取步骤一得到的活化菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一环菌种加入2～3mL；将菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体种子培养基体积的5～10%，培养温度25～32℃，摇床速度150～250 r/min，培养时间1～2 天，得到摇瓶种子液，备用；
所述的液体种子培养基的配方为：每1000mL培养基中包含蛋白胨8～14 g、酵母粉4～8g和NaCl 4～8 g，余量为水；pH为7.0～7.5；
步骤三、发酵罐培养
将经步骤二培养好的摇瓶种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，接种量为发酵培养基体积的5～10%，培养温度26～30℃，DO 70-90%，搅拌速度200～300 r/min，发酵液的体积与每分钟通入发酵液的空气体积比为1：2～1：5；其中，在发酵培养0-48h时向发酵液中添加无水乙醇作为诱导物，发酵培养48h后每隔24h向发酵液中添加补料液；培养时间5～7天，即可得含有ε-聚赖氨酸的发酵液；
所述的发酵培养基配方如下：每1000mL培养基，玉米淀粉10～20g，酵母粉5～10g，(NH4)2SO4 8～12g，K2HPO4 0.5～1.5g，KH2PO4 0.8～1.5g，MgSO4 0.5～1.0g，ZnSO4 0.03～0.05g，FeSO4 0.03～0.05g，pH 7.0～7.5，余量为水；
所述的补料液的组成为：每100mL补料液中含有大豆油1～3g、葡萄糖2～5g、柠檬酸二钠0.1～0.3g和硫酸铵0.3～0.5g，余量为水；所述补料液的pH 7.0～7.5；
步骤三中所述诱导物的添加量为：每100mL发酵液中添加1～3mL 无水乙醇；
步骤三中所述补料液的添加量为发酵液体积的5%；
所述白色链霉菌X-18分类命名为白色链霉菌(Streptomyces albulus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCCNo. 17536，保藏时间为2019年04月09日。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一所述固体斜面培养基的配方如下：每1000mL培养基中包括葡萄糖7～15g、蛋白胨 1.0～5.0g、酵母粉1～3 g和琼脂 15～20g，余量为水；所述固体斜面培养基pH 7.2～7.8。
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