CN112410381B - 一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速发酵生产ε‑聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,主要包括种子培养、发酵的制备、将发酵液依次进行过滤、碱化、吸附、解析、脱色、纳滤、干燥,得到本发明所需产品。与传统生产ε‑聚赖氨酸方法相比,通过采用本发明的发酵生产方法,ε‑聚赖氨酸及其盐酸盐的生产发酵周期由192‑216h缩短到120‑136h,ε‑聚赖氨酸的浓度由20‑25g/L增加到48‑52g/L,相当于提高了ε‑聚赖氨酸的产量,缩短了ε‑聚赖氨酸生产发酵周期,提高了规模工业化生产的产量,从而降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵工程技术领域,具体涉及一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法。
技术背景
ε-聚赖氨酸(ε-poLy-L-Lysine,简称ε-PL)是L-赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基形成的酰胺键连接而成的同型单体聚合物,故称为ε-聚赖氨酸。ε-聚赖氨酸作为一种天然的生物代谢产品,具有广谱抗菌性,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有很好的抑菌效果,是目前天然防腐中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的生物类食品防腐剂。相比于山梨酸及其盐,脱氢乙酸及其盐,苯甲酸及其盐等传统化学食品防腐剂,ε-聚赖氨酸具有抑菌谱广,抑菌能力强,不受pH影响,并且热稳定性好,使用量低和安全性能高等优点。ε-聚赖氨酸作为一种安全、高效,广谱的食品添加剂在美国、日本、韩国、比利时等国家已被广泛使用。在我国,2014年中华人民共和国国家卫生计生委批准了ε-聚赖氨酸及其盐酸盐可作为食品添加剂防腐剂使用。
然而六年来ε-聚赖氨酸及其盐酸盐在国内并没能得到广泛的使用,其主要原因是因为ε-聚赖氨酸及其盐酸盐工业化生产发酵生产周期长且产率不高,导致生产成本较高,价格昂贵,食品加工企业难以承受该产品的使用成本,从而限制了ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的广泛应用。因此,近些年来人们也致力于通过改善发酵添加和发酵用添加剂等方法来提高ε-聚赖氨酸的产率产量,但是其效果都不够显著。进而又逐渐致力于通过提高从发酵液中提取和提纯ε-聚赖氨酸及其盐酸盐收率的方法上,虽然取得一定的进展,但收率的提高受发酵产率反制,从而也不能达到较高的产量。
因此,针对ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的生产方法进行进一步的创新和研究,提高ε-聚赖氨酸的产量并降低生产成本,成为了推动ε-聚赖氨酸工业化发展过程中亟需解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的不足,本发明的目的是提供一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法。该方法能够提高ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的产量,缩短ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的生产发酵周期,从而降低了生产成本。
为了实现上述发明目的,本发明采用如下技术方案:
一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,包括以下步骤:
(1)种子培养:将种子罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入种子罐内,配制种子培养基至种子罐,再进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至种子罐中,调节好种子培养所需控制的参数将实验室培养好的斜面白色链霉菌菌种接种至种子罐中,培养14-22h,得发酵用菌种;
(2)发酵培养:将发酵罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入发酵罐内,配制发酵培养基至发酵罐,之后进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至发酵罐中,调节好发酵培养所需的参数,将步骤(1)制备的发酵用菌种移种至发酵罐中,使得菌体浓度达到15%以上,发酵15-22h,之后用氨水自动调整发酵液的pH为4.1±0.2,以无菌操作的方式一定速度连续流加葡萄糖、氯化钙和硫酸铵,葡萄糖的残留量控制在0.2%-2%,发酵120-136h,即制得发酵液;
(3)发酵结束后,将步骤(2)制备的发酵液依次进行过滤、碱化、吸附、氨水解析、脱色、纳滤、干燥,即得本发明所述的ε-聚赖氨酸;
(4)发酵结束后,将步骤(2)制备的发酵液依次进行过滤、碱化、吸附、盐酸解析、脱色、纳滤、干燥,即得本发明所述的ε-聚赖氨酸盐酸盐。
进一步地,所述步骤(1)中种子培养所需控制的参数为温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.8-7.0,之后用氨水将pH自动控制在6.0。
进一步地,所述步骤(2)中发酵培养基组成为:25-50g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5-15g/L(NH4)SO4、0.8g/LK2HPO4·3H2O、1.36g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.04g/LZnSO4·7H2、0.03g/LFeSO4·7H2O、所述发酵培养基的pH为6.0-6.2。
进一步地,所述步骤(2)中发酵培养所需控制的参数为温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.0-6.2用氨水进行自动控制。
进一步地,所述步骤(2)中在发酵进行到第30-35h开始流加氯化钙,间隔5-30min再流加与氯化钙等摩尔等量的硫酸铵。
进一步地,所述步骤(3)的具体操作方法为:向步骤(2)所得的发酵液中加入珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附至饱和后依次用反渗透水洗涤和氨水解析,制得ε-聚赖氨酸溶液,然后将ε-聚赖氨酸溶液升温至60±5℃,加入活性炭进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸清液,将ε-聚赖氨酸清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度大于10g/L,滤出盐水的电导率小于200us/cm停止纳滤,最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸。
进一步地,所述步骤(4)的具体操作方法为向步骤(2)所得的发酵液中加入珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附至饱和后依次用反渗透水洗涤和盐酸解析,制得ε-聚赖氨酸溶液,然后将ε-聚赖氨酸溶液升温至60±5℃,加入活性炭进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸清液,将ε-聚赖氨酸清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度大于10g/L,滤出盐水的电导率小于200us/cm停止纳滤,最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸盐酸盐。
进一步地,所述氨水解析是将用反渗透水洗涤后的吸附饱和的树脂用氨水进行洗脱;所述盐酸解析是将用反渗透水洗涤后的吸附饱和的树脂用盐酸进行洗脱。
进一步地,所述的循环纳滤过程中浓缩液流量为500-600L/h,滤出的盐水流量为20-30L/h。
进一步地,所述的喷雾干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为80-120L/h。
与现有技术相比,本发明具备的有益效果在于:发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐需要大量的氮源来作为微生物酶合成ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的原料,传统的发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐一般通过流加硫酸铵或培养基底料加入足量的硫酸铵来实现,但不管是流加硫酸铵还是培养基底料加入足量的硫酸铵,都会导致硫酸根的浓度过大而影响白色链霉菌(其他类生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐微生物也适用)菌体生长的活性,进而导致ε-聚赖氨酸合成酶合成ε-聚赖氨酸及其盐酸盐缓慢或不合成,又因合成的ε-聚赖氨酸是一种pH大于9的碱性物质,而生产ε-聚赖氨酸需要维持的适宜pH为4.1±0.2,本发明通过前期培养基加入(NH4)2SO4维持ε-聚赖氨酸生产菌株的生长及其生理酸性使发酵pH下降至生产ε-聚赖氨酸需要的适宜pH4.1±0.2,在发酵过程进行到第30-35h后通过流加氯化钙来解除硫酸根对白色链霉菌(其他类生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐微生物也适用)菌体生长的活性的不利影响及ε-聚赖氨酸合成酶合成ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的抑制,从而到达ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的快速生产合成,随着ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的快速生产合成发酵液中铵根被消耗,就需要继续补加硫酸铵,本发明通过先流加氯化钙,间隔5-30min再流加与氯化钙等摩尔等量的硫酸铵,这样保证有足够的时间让流加的氯化钙与原发酵液中硫酸根反应生成硫酸钙,保证合成ε-聚赖氨酸及其盐酸盐所需充足的氮源及维持合成ε-聚赖氨酸发酵条件pH为4.1±0.2的生理酸性物质,并解除过多硫酸根浓度影响ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的快速合成。与传统生产ε-聚赖氨酸方法相比,通过采用本发明的发酵生产方法,ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的生产发酵周期由192-216h缩短到120-136h,ε-聚赖氨酸的浓度由20-25g/L增加到48-52g/L,相当于提高了ε-聚赖氨酸的产量,缩短了ε-聚赖氨酸生产发酵周期,提高了规模工业化生产的产量,从而降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明,但应理解本发明的范围非限于这些实施例的范围。
实施例1
(1)种子培养:将种子罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入种子罐内,配制种子培养基至种子罐,再进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至种子罐中,调节好种子培养所需控制的参数:温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.8-7.0,之后用氨水将pH自动控制在6.0;之后将实验室培养好的斜面白色链霉菌菌种接种至种子罐中,培养14-22h,得发酵用菌种;
(2)发酵培养:将发酵罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入发酵罐内,配制发酵培养基:发酵培养基组成为:25g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L(NH4)SO4、0.8g/LK2HPO4·3H2O、1.36g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.04g/LZnSO4·7H2、0.03g/LFeSO4·7H2O,所述发酵培养基的pH为6.0-6.2,至发酵罐,之后进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至发酵罐中,调节好发酵培养所需的参数:温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.0用氨水进行自动控制;将步骤(1)制备的发酵用菌种移种至发酵罐中,使得菌体浓度达到15%以上,发酵15h后用氨水自动调整发酵液的pH为4.1±0.2,以无菌操作的方式一定速度连续流加葡萄糖、氯化钙和硫酸铵,葡萄糖的残留量控制在0.2%-2%,发酵进行到第30h开始流加氯化钙,间隔5min再流加与氯化钙等摩尔等量的硫酸铵,发酵120h,即制得发酵液,ε-聚赖氨酸的发酵浓度为50.2g/L;
(3)ε-聚赖氨酸的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用氨水进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸溶液,然后将ε-聚赖氨酸溶液加入活性炭,升温至60℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸清液;将所得的ε-聚赖氨酸清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为12g/L,滤出盐水的电导率为180us/cm停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为500L/h,滤出的盐水流量为20L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为80L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸。
(4)ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用盐酸进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液,然后将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液加入活性炭,升温至60℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸盐酸盐清液,将ε-聚赖氨酸盐酸盐清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为12g/L,滤出盐水的电导率为180us/cm停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为500L/h,滤出的盐水流量为20L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为80L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸盐酸盐。
实施例2
(1)种子培养:将种子罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入种子罐内,配制种子培养基至种子罐,再进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至种子罐中,调节好种子培养所需控制的参数:温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.8-7.0,之后用氨水将pH自动控制在6.0;之后将实验室培养好的斜面白色链霉菌菌种接种至种子罐中,培养14-22h,得发酵用菌种;
(2)发酵培养:将发酵罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入发酵罐内,配制发酵培养基:发酵培养基组成为:40g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、10g/L(NH4)SO4、0.8g/L K2HPO4·3H2O、1.36g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.04g/LZnSO4·7H2、0.03g/L FeSO4·7H2O,所述发酵培养基的pH为6.0-6.2,至发酵罐,之后进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至发酵罐中,调节好发酵培养所需的参数:温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.1用氨水进行自动控制;将步骤(1)制备的发酵用菌种移种至发酵罐中,使得菌体浓度达到15%以上,发酵18h后用氨水自动调整发酵液的pH为4.1±0.2,以无菌操作的方式一定速度连续流加葡萄糖、氯化钙和硫酸铵,葡萄糖的残留量控制在0.2%-2%,发酵进行到第32h开始流加氯化钙,间隔15min再流加与氯化钙等摩尔等量的硫酸铵,发酵128h,即制得发酵液,ε-聚赖氨酸的发酵浓度为49.3g/L;
(3)ε-聚赖氨酸的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用氨水进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸溶液,然后将ε-聚赖氨酸溶液加入活性炭,升温至55℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸清液;将所得的ε-聚赖氨酸清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为11g/L,滤出盐水的电导率为175/cm停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为550L/h,滤出的盐水流量为25L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为100L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸。
(4)ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用盐酸进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液,然后将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液加入活性炭,升温至55℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸盐酸盐清液,将ε-聚赖氨酸盐酸盐清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为11g/L,滤出盐水的电导率为175us/cm,停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为550L/h,滤出的盐水流量为25L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为100L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸盐酸盐。
实施例3
(1)种子培养:将种子罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入种子罐内,配制种子培养基至种子罐,再进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至种子罐中,调节好种子培养所需控制的参数:温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.8-7.0,之后用氨水将pH自动控制在6.0;之后将实验室培养好的斜面白色链霉菌菌种接种至种子罐中,培养14-22h,得发酵用菌种;
(2)发酵培养:将发酵罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入发酵罐内,配制发酵培养基:发酵培养基组成为:50g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、15g/L(NH4)SO4、0.8g/L K2HPO4·3H2O、1.36g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.04g/LZnSO4·7H2、0.03g/L FeSO4·7H2O,所述发酵培养基的pH为6.0-6.2,至发酵罐,之后进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至发酵罐中,调节好发酵培养所需的参数:温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.2用氨水进行自动控制;将步骤(1)制备的发酵用菌种移种至发酵罐中,使得菌体浓度达到15%以上,发酵22h后用氨水自动调整发酵液的pH为4.1±0.2,以无菌操作的方式一定速度连续流加葡萄糖、氯化钙和硫酸铵,葡萄糖的残留量控制在0.2%-2%,发酵进行到第35h开始流加氯化钙,间隔30min再流加与氯化钙等摩尔等量的硫酸铵,发酵136h,即制得发酵液,ε-聚赖氨酸的发酵浓度为50.6g/L;
(3)ε-聚赖氨酸的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用氨水进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸溶液,然后将ε-聚赖氨酸溶液加入活性炭,升温至65℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸清液;将所得的ε-聚赖氨酸清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为13g/L,滤出盐水的电导率为190us/cm停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为600L/h,滤出的盐水流量为30L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为120L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸。
(4)ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用盐酸进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液,然后将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液加入活性炭,升温至65℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸盐酸盐清液,将ε-聚赖氨酸盐酸盐清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为13g/L,滤出盐水的电导率为190us/cm,停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为600L/h,滤出的盐水流量为30L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为120L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸盐酸盐。
对比例1
(1)种子培养:种子罐经水清洗干净后,开始进行空消,然后将溶氧和pH电极校正准确后装入种子罐内,配制种子培养基至种子罐,之后进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至种子罐中;调节好种子培养所需控制的各参数,温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.8-7.0,之后用氨水自动控制在6.0;之后将实验室培养好的斜面白色链霉菌菌种接种至种子罐中,培养14-22h,得发酵用菌种;
(2)发酵培养:发酵罐经水清洗干净后,开始进行空消,然后将溶氧和pH电极校正准确后装入发酵罐内,配制发酵培养基:40g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、10g/L(NH4)SO4、0.8g/LK2HPO4·3H2O、1.36g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.04g/L ZnSO4·7H2、0.03g/LFeSO4·7H2O,所述发酵培养基的pH为6.0-6.2,至发酵罐,之后进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至发酵罐中;调节好发酵培养所需控制的各参数:温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.1用氨水进行自动控制;将步骤1)制备的发酵用菌种移种至发酵罐中,使得菌体浓度达到15%以上,发酵18h后用氨水自动调整发酵液的pH为4.1±0.2,以无菌操作的方式一定速度连续流加葡萄糖,葡萄糖的残留量控制在0.2%-2%,发酵周期192h,即制得发酵液,此时ε-聚赖氨酸的发酵浓度为23.3g/L。
(3)ε-聚赖氨酸的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用盐酸进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液,然后将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液加入活性炭,升温至55℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸盐酸盐清液;采用氢氧化钠将得到的ε-聚赖氨酸盐酸盐清液的pH调整为9,然后加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为11g/L,滤出盐水的电导率为175us/cm停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为550L/h,滤出的盐水流量为25L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为100L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸。
(4)ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用盐酸进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液,然后将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液加入活性炭,升温至55℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸盐酸盐清液,将ε-聚赖氨酸盐酸盐清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为11g/L,滤出盐水的电导率为175us/cm,停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为550L/h,滤出的盐水流量为25L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为100L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸盐酸盐。
对比例2
(1)种子培养:种子罐经水清洗干净后,开始进行空消,然后将溶氧和pH电极校正准确后装入种子罐内,配制种子培养基至种子罐,之后进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至种子罐中;调节好种子培养所需控制的各参数,温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.8-7.0,之后用氨水自动控制在6.0;之后将实验室培养好的斜面白色链霉菌菌种接种至种子罐中,培养14-22h,得发酵用菌种;
(2)发酵培养:发酵罐经水清洗干净后,开始进行空消,然后将溶氧和pH电极校正准确后装入发酵罐内,配制发酵培养基:50g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、15g/L(NH4)SO4、0.8g/LK2HPO4·3H2O、1.36g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.04g/L ZnSO4·7H2、0.03g/LFeSO4·7H2O,所述发酵培养基的pH为6.0-6.2,至发酵罐,之后进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至发酵罐中;调节好发酵培养所需控制的各参数:温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.2用氨水进行自动控制;将步骤1)制备的发酵用菌种移种至发酵罐中,使得菌体浓度达到15%以上,发酵18h后用氨水自动调整发酵液的pH为4.1±0.2,以无菌操作的方式一定速度连续流加葡萄糖,葡萄糖的残留量控制在0.2%-2%,发酵周期216h,即制得发酵液,此时ε-聚赖氨酸的发酵浓度为24.9g/L。
(3)ε-聚赖氨酸的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用盐酸进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液,然后将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液加入活性炭,升温至65℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸盐酸盐清液;采用氢氧化钠将得到的ε-聚赖氨酸盐酸盐清液的pH调整为10,然后加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为13g/L,滤出盐水的电导率为190us/cm停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为600L/h,滤出的盐水流量为30L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为120L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸。
(4)ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备:向步骤(2)所得的发酵液中加入2%左右珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附饱和的树脂用反渗透水进行洗涤,直至洗涤液澄清,然后将洗涤后饱和树脂采用盐酸进行洗脱,制得ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液,然后将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液加入活性炭,升温至65℃,进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸盐酸盐清液,将ε-聚赖氨酸盐酸盐清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度为13g/L,滤出盐水的电导率为190us/cm,停止纳滤,循环纳滤过程中浓缩液流量为600L/h,滤出的盐水流量为30L/h;最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,控制干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为120L/h,得到白色或黄色粉末状产品,即为本发明所述的ε-聚赖氨酸盐酸盐。
结论:相较于对比例,本发明除了在发酵罐中流加葡萄糖外,还流加了氯化钙和硫酸铵:通过先流加氯化钙,间隔5-30min再流加与氯化钙等摩尔等量的硫酸铵,这样保证有足够的时间让流加的氯化钙与原发酵液中硫酸根反应生成硫酸钙,保证合成ε-聚赖氨酸及其盐酸盐所需充足的氮源及维持合成ε-聚赖氨酸发酵条件pH为4.1±0.2的生理酸性物质,并解除过多硫酸根浓度影响ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的快速合成。与对比例生产ε-聚赖氨酸方法相比,通过采用本发明的发酵生产方法,ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的生产发酵周期由192-216h缩短到120-136h,ε-聚赖氨酸的浓度由20-25g/L增加到48-52g/L,相当于提高了ε-聚赖氨酸的产量,缩短了ε-聚赖氨酸生产发酵周期,提高了规模工业化生产的产量,从而降低了生产成本。
尽管上述已经描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)种子培养:将种子罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入种子罐内,配制种子培养基至种子罐,再进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至种子罐中,调节好种子培养所需控制的参数将实验室培养好的斜面白色链霉菌菌种接种至种子罐中,培养14-22h,得发酵用菌种;
(2)发酵培养:将发酵罐用水清洗干净后,开始进行空消,之后将溶氧和pH电极校正准确后装入发酵罐内,配制发酵培养基至发酵罐,之后进行实消,降温至30℃,并将实消后降温至30℃的糖并至发酵罐中,调节好发酵培养所需的参数,将步骤(1)制备的发酵用菌种移种至发酵罐中,使得菌体浓度达到15%以上,发酵15-22h,之后用氨水自动调整发酵液的pH为4.1±0.2,以无菌操作的方式一定速度连续流加葡萄糖,在发酵进行到第30-35h开始流加氯化钙,间隔5-30min再流加与氯化钙等摩尔等量的硫酸铵,葡萄糖的残留量控制在0.2%-2%,发酵120-136h,即制得发酵液;
(3)发酵结束后,(a):将步骤(2)制备的发酵液依次进行过滤、碱化、吸附、氨水解析、脱色、纳滤、干燥,即得ε-聚赖氨酸;或(b):将步骤(2)制备的发酵液依次进行过滤、碱化、吸附、盐酸解析、脱色、纳滤、干燥,即得ε-聚赖氨酸盐酸盐。
2.根据权利要求1所述的一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,其特征在于,所述步骤(1)中种子培养所需控制的参数为温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.8-7.0,之后用氨水将pH自动控制在6.0。
3.根据权利要求1所述的一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,其特征在于,所述步骤(2)中发酵培养基组成为:25-50g/L 葡萄糖、5g/L 酵母粉、5-15g/L(NH4)SO4 、0.8g/ L K2HPO4•3H2O、1.36g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4•7H2O、0.04g/L ZnSO4•7H2O、0.03g/LFeSO4•7H2O、所述发酵培养基的pH为6.0-6.2。
4.根据权利要求1所述的一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,其特征在于,所述步骤(2)中发酵培养所需控制的参数为温度自动控制在30±1℃,溶氧大于30%,罐压在0.01-0.03MPa,pH调至6.0-6.2用氨水进行自动控制。
5.根据权利要求1所述的一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,其特征在于,所述步骤(3)中(a)的具体操作方法为:向步骤(2)所得的发酵液中加入珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附至饱和后依次用反渗透水洗涤和氨水洗脱,制得ε-聚赖氨酸溶液,然后将ε-聚赖氨酸溶液升温至60±5℃,加入活性炭进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸清液,将ε-聚赖氨酸清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度大于10g/L,滤出盐水的电导率小于200 us/cm停止纳滤,最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,得到白色或黄色粉末状产品,即为ε-聚赖氨酸。
6.根据权利要求1所述的一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,其特征在于,所述步骤(3)中(b)的具体操作方法为:向步骤(2)所得的发酵液中加入珍珠岩进行板框过滤,得过滤清液,将过滤清液pH调至碱性后经D155树脂上柱吸附,吸附至饱和后依次用反渗透水洗涤和盐酸洗脱,制得ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液,然后将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液升温至60±5℃,加入活性炭进行脱色,再进行板框过滤,得ε-聚赖氨酸盐酸盐清液,将ε-聚赖氨酸盐酸盐清液加入纳滤罐进行循环纳滤,直至纳滤浓缩液的浓度大于10g/L,滤出盐水的电导率小于200 us/cm停止纳滤,最后将纳滤浓缩液进行喷雾干燥,得到白色或黄色粉末状产品,即为ε-聚赖氨酸盐酸盐。
7.根据权利要求5或6所述的一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,其特征在于,所述的循环纳滤过程中浓缩液流量为500-600L/h,滤出的盐水流量为20-30L/h。
8.根据权利要求5或6所述的一种快速发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法,其特征在于,所述的喷雾干燥进口温度为140±10℃,出口温度为83±15℃,料液流速为80-120L/h。
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