CN104232702B - 一种赖氨酸的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种赖氨酸的生产方法，该方法包括将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，其特征在于，在发酵培养2‑6小时后至发酵培养12‑16小时内向发酵液中流加促进剂，在发酵培养12‑16小时后至发酵培养结束前6‑8小时内向发酵液中流加无机盐，在发酵培养16‑20小时后至发酵培养40‑42小时内向发酵液中流加氨基酸，在发酵培养20‑24小时后至发酵培养42‑48小时内向发酵液中流加维生素，其中，该促进剂为乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和氨基三乙酸钠中的一种或多种。本发明提供的方法能够提高终点赖氨酸含量、单罐供酸量和转化率。

Description

一种赖氨酸的生产方法

技术领域

本发明涉及一种赖氨酸的生产方法。

背景技术

赖氨酸是人和动物营养的八种必需氨基酸之一，它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、醋精生长发育均有重要作用。目前主要用于医药、食品和饲料工业，从消费结构上看，赖氨酸在饲料中的消费占了近90％，而在食品及医药中间体的消费仅占10％。

一般情况下赖氨酸的生产是通过将赖氨酸发酵菌种经过种子培养后接种至发酵培养基中发酵产生赖氨酸。在赖氨酸发酵过程中，需要碳水化合物、蛋白质和前体等物质提供能量和构成特定产物的需要，其营养物质一般包括碳源、氮源(有机氮源、无机氮源)、无机盐及微量元素、生长因子、前体、产物促进和抑制剂等。

在赖氨酸的发酵过程中，随着发酵的进行，赖氨酸酸度逐渐提高，且随着碳源和氮源的流加以及发酵过程中的放料，发酵罐中碳、氮以外的其他营养物质的浓度逐渐降低，赖氨酸菌种过早衰老、自溶，代谢能力下降，发酵产酸速率呈下降趋势；最终因发酵产酸速率缓慢而放罐，致使限制了赖氨酸的产能，成本较高，经济效益较低；另外，培养基中的各底物避免不了相互之间的抑制，降低有效成分，同时也降低了发酵水平，不利于赖氨酸的产能。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中赖氨酸产能不高的缺陷的提供一种新的赖氨酸的生产方法。

本发明人在研究中意外发现，根据赖氨酸不同的生长周期的营养需求，对赖氨酸的发酵过程进行调控，优化出合理的培养基成分的添加顺序和添加周期：即在发酵培养2-6小时后至发酵培养12-16小时内向发酵液中流加促进剂，在发酵培养12-16小时后至发酵培养结束前6-8小时内向发酵液中流加无机盐，在发酵培养16-20小时后至发酵培养40-42小时内向发酵液中流加氨基酸，在发酵培养20-24小时后至发酵培养42-48小时内向发酵液中流加维生素，能够提高终点赖氨酸含量、单罐供酸量和转化率，即提高赖氨酸产能，从而提高经济效益。这可能是因为根据赖氨酸发酵不同周期产赖氨酸变化，流加赖氨酸发酵所需的营养物质可以减少培养基底物之间的相互抑制和减少底物之间的美拉德反应，进而提高培养基中有效成分的利用率；此外，促进剂可以促进葡萄糖氧化酶的形成，保证TCA循环酶系活力，改进了细胞膜的渗透性，同时增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用，以增加赖氨酸的积累。

为了实现上述目的，本发明提供一种赖氨酸的生产方法，该方法包括将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，其中，在发酵培养2-6小时后至发酵培养12-16小时内向发酵液中流加促进剂，在发酵培养12-16小时后至发酵培养结束前6-8小时内向发酵液中流加无机盐，在发酵培养16-20小时后至发酵培养40-42小时内向发酵液中流加氨基酸，在发酵培养20-24小时后至发酵培养42-48小时内向发酵液中流加维生素，其中，所述促进剂为乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和氨基三乙酸钠中的一种或多种。

本发明提供的赖氨酸的生产方法，可提高终点赖氨酸含量、单罐供酸量和转化率，即提高赖氨酸产能，从而提高经济效益。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种赖氨酸的生产方法，该方法包括将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，其中，在发酵培养2-6小时后至发酵培养12-16小时内向发酵液中流加促进剂，在发酵培养12-16小时后至发酵培养结束前6-8小时内向发酵液中流加无机盐，在发酵培养16-20小时后至发酵培养40-42小时内向发酵液中流加氨基酸，在发酵培养20-24小时后至发酵培养42-48小时内向发酵液中流加维生素，其中，所述促进剂为乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和氨基三乙酸钠中的一种或多种。

需要说明的是，“在发酵培养2-6小时后”指的是在发酵培养2-6小时的时间段内选择流加促进剂的时间起点，“至发酵培养12-16小时内”指的是在发酵培养12-16小时内选择流加促进剂的时间终点，在选择的流加促进剂的时间起点至选择的流加促进剂的时间终点的这个时间段内可以采用间歇流加或连续流加方式，向发酵液流加无机盐、氨基酸和维生素的时间段的选择与此类似。

为了更好的提高赖氨酸产能，优选地，在发酵培养2-6小时后至发酵培养12-15小时内向发酵液中流加促进剂，在发酵培养13-15小时后至发酵培养结束前6-8小时内向发酵液中流加无机盐，在发酵培养16-18小时后至发酵培养40-42小时内向发酵液中流加氨基酸，在发酵培养20-22小时后至发酵培养45-48小时内向发酵液中流加维生素。

本发明中，发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微生物生长和维持用的人工配制的养料。

本发明中，促进剂是指那些细胞生长非必需的且既不是营养物质又不是前体，但却能提高产量的添加剂。

根据本发明，所述促进剂为乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和氨基三乙酸钠中的一种或多种。考虑到有机金属离子螯合剂的螯合能力和螯合物的稳定性受发酵培养所需的pH值的影响，优选情况下，所述促进剂为乙二胺四乙酸。

根据本发明，所述赖氨酸发酵培养基可以为含有促进剂的培养基或不含促进剂的培养基。考虑到利于赖氨酸的生长，优选情况下，所述赖氨酸发酵培养基为含有促进剂的培养基。

本发明对赖氨酸发酵培养基的其他成分(碳源、氮源、无机盐、氨基酸和维生素)无特殊要求，可以采用本领域常规使用的物质，例如，可以用淀粉质原料液化清液、糖蜜、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、苏氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、生物素、烟酰胺和维生素B1等配制本发明的培养基。

根据本发明，每升赖氨酸发酵培养基中各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，相对于每升赖氨酸发酵培养基，淀粉质原料液化清液的用量可以为30-70克，糖蜜的用量可以为20-40克，玉米浆(干重为18-52重量％)的用量可以为25-50克，硫酸铵的用量可以为30-50克，磷酸二氢钾的用量可以为0.4-1.2克，硫酸镁的用量可以为0.2-0.5克，硫酸亚铁的用量可以为0.01-0.05克，硫酸锰的用量可以为0.01-0.08克，苏氨酸的用量可以为0.1-0.4克，蛋氨酸的用量可以为0.1-0.5克，谷氨酸的用量可以为0.2-0.6克，生物素的用量可以为0.05-0.8毫克，烟酰胺的用量可以为0.1-1.0毫克，维生素B1的用量可以为0.2-0.8毫克，促进剂的用量可以为9-25克。

其中，所述淀粉质原料液化清液既可以采用干法制糖工艺制备，也可以采用湿法制糖工艺制备。从工艺简单、设备投资少，生产成本较低的方面考虑，优选通过干法制糖工艺制备。

干法制糖工艺是指淀粉质原料不经浸泡直接进行破碎和酶解。干法制糖工艺可以包括：将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解(酶解)，然后进行碘试，碘试呈本色合格，不需进行二次酶解，若碘试不合格，需进行二次水解(酶解)：在第一水解产物中加入淀粉酶进行第二次水解，碘试合格，对二次水解产物进行固液分离得到淀粉质原料液化清液。

优选地，粉碎使淀粉质原料过60目筛的通过率大于66％，更优选过60目筛的通过率为100％。其中，所述调浆的方法为本领域技术人员所熟知，优选地，调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为14-17波美度(波美度是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数)。

所述淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备赖氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以为选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种。

根据本发明，在第一次水解中，以每克粉碎后的产物的干重计，淀粉酶的用量可以为110-130个酶活力单位，酶解的温度可以为82-84℃，酶解的时间可以为90-120分钟，酶解的pH值可以为5.8-6.0。

根据本发明，在第二次水解中，以每克液相组分计，淀粉酶的用量可以为10-30个酶活力单位，酶解的温度可以为90-95℃，酶解的时间可以为10-20分钟，酶解的pH值可以为5.8-6.0。固液分离的条件没有特别的限定，优选地，固液分离的条件使得到的液相组分中的固含量为19-22重量％，更优选为20-21重量％。

本发明酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原性糖所需的酶量为一个酶活力单位。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1,4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1,4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶。

本发明中，优选地，所述淀粉质原料液化清液中的葡萄糖含量为20-30重量％。

在本发明中，发酵液为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌株的液体培养基经过一段时间的培养后所得产物。

根据本发明，流加的碳源、氮源、无机盐、氨基酸和维生素为本领域的公知的各种碳源、氮源、无机盐、氨基酸和维生素。优选情况下，所述碳源为淀粉质原料液化清液；所述氮源为铵盐，所述铵盐为硫酸铵；所述无机盐为硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰和磷酸二氢钾中的一种或多种；所述氨基酸为苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸中的一种或多种；所述维生素为生物素、烟酰胺和维生素B1中的一种或多种。

根据本发明，流加促进剂的量使发酵液中促进剂的浓度控制在8-12克/升；流加无机盐的量使发酵液中无机盐的浓度控制在0.01-1.2克/升，流加氨基酸的量使发酵液中氨基酸的浓度控制在0.1-0.6克/升，流加维生素的量使发酵液中维生素的浓度控制在0.05-1毫克/升。优选情况下，为了进一步提高赖氨酸的产能，流加促进剂的量使发酵液中促进剂的浓度控制在9-11克/升；流加硫酸镁的量使发酵液中硫酸镁的浓度控制在0.2-0.5克/升，流加硫酸亚铁的量使发酵液中硫酸亚铁的浓度控制在0.01-0.05克/升，流加硫酸锰的量使发酵液中硫酸锰的浓度控制在0.01-0.08克/升，流加磷酸二氢钾的量使发酵液中磷酸二氢钾的浓度控制在0.4-1.2克/升；流加苏氨酸的量使发酵液中苏氨酸的浓度控制在0.1-0.4克/升，流加蛋氨酸的量使发酵液中蛋氨酸的浓度控制在0.1-0.5克/升；流加谷氨酸的量使发酵液中谷氨酸的浓度控制在0.2-0.6克/升；流加生物素的量使发酵液中生物素的浓度控制在0.05-0.8毫克/升，流加烟酰胺的量使发酵液中烟酰胺的浓度控制在0.1-1毫克/升，流加维生素B1的量使发酵液中维生素B1的浓度控制在0.2-0.8毫克/升。对于流加各物质的浓度和流速无特殊要求，只要使发酵液中各物质的浓度控制在上述范围内即可。

本发明提供的赖氨酸的生产方法相对于现有技术的改进主要在于根据赖氨酸生长周期，对赖氨酸的发酵过程进行调控，优化出合理的培养基成分的添加顺序和添加周期。因此，对于赖氨酸发酵的其他条件和操作没有特殊要求，可以采用本领域常用的条件和操作。

本发明中，以接种后且流加碳源和流加氮源之前的发酵培养基为基准，赖氨酸发酵菌种的接种量优选为10-18体积％。本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸发酵菌种在被接种至发酵培养基中之前，采用常规方法将赖氨酸发酵菌种经过种子罐培养，然后再将菌种接入发酵培养基中。在种子罐培养的培养程度可以通过取样显微镜镜检、OD(opticaldensity)值测定对赖氨酸发酵菌种的生长进行观察，当通过上述方法观察菌体形态正常、测定OD值达到0.8以上时停止培养，将此时种子罐中的种子液称为成熟种子液，然后再将成熟种子液接入发酵培养基中。因此，本发明中，赖氨酸发酵菌种的接种量优选为10-18体积％，指的是接入发酵培养基中的成熟种子液的体积占接入成熟种子液后发酵培养基体积的10-18％。

本领域中一般均采用OD值来表示种子液中赖氨酸发酵菌种的数量，本发明也沿用本领域的采用OD值来表示种子液中赖氨酸发酵菌种的数量的习惯。且本发明中，OD值用722N可见光分光光度计测定。

根据本发明，种子罐培养可以采用一级种子罐培养也可以采用二级种子罐培养，一级种子罐培养即将赖氨酸发酵菌种在一个种子罐中一直培养到所需的培养程度；二级种子罐培养即先将赖氨酸发酵菌种在一个种子罐中培养一段时间后再转入另一个种子罐继续培养，培养到所需的培养程度。二级种子罐培养在各个种子罐的培养时间没有具体限定，只要最终能培养到所需的培养程度即可。为了操作方便，本发明的种子罐培养优选采用一级种子罐培养。

本发明中，对于种子罐培养基的成分无特殊要求，可以采用本领域常用的种子罐培养基，例如，可以用淀粉质原料液化清液、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵、苏氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、生物素、烟酰胺和维生素B1等配制种子罐培养基。根据本发明，每升种子罐培养基中各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升种子罐培养基中，淀粉质原料液化清液的用量可以为25-45克，玉米浆(干重为18-52重量％)的用量可以为65-80克，磷酸二氢钾的用量可以为0.3-1.8克，硫酸镁的用量可以为0.2-1.5克，硫酸铵的用量可以为6-12克，苏氨酸的用量可以为0.1-0.8克，蛋氨酸的用量可以为0.1-0.5克，谷氨酸的用量可以为0.2-0.8克，生物素的用量可以为0.01-0.1毫克，烟酰胺的用量可以为0.1-5毫克，维生素B1的用量可以为0.2-1.0毫克。

本发明中，优选情况下，流加碳源的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在4-10克/升，流加氮源的量使发酵液中氮的浓度控制在0.8-1克/升。此处“流加碳源的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在4-10克/升，流加氮源的量使发酵液中氮的浓度控制在0.8-1克/升”是指通过控制流加碳源和流加氮源的速度来使在整个发酵培养过程中发酵液中还原性糖的浓度维持在4-10克/升，使发酵液中氮的浓度维持在0.8-1克/升。

本发明中，当氮源为铵盐时，培养基中氮的浓度以铵根离子的浓度表示，氮的浓度控制在0.8-1克/升，则铵根离子的浓度控制在1.0-1.3克/升。

本发明的发明人在实验中发现，对于碳源和氮源的流加，以及各种培养基成分的流加，连续流加比间歇流加的发酵效果好，因此，本发明中的流加优选为连续流加。

本发明中，发酵培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行发酵培养。本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸的发酵培养应该在空气中进行。为了有效利用发酵罐的产能，接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养基的体积优选为发酵罐体积的30-60％，随着流加碳源和流加氮源以及流加各种培养基成分，发酵罐中的培养基的体积逐渐增大，为了保证发酵罐中的空气量，优选为当流加碳源和流加氮源以及流加所述促进剂、无机盐、氨基酸和维生素至发酵罐体积的70-80％时放料，为了保证放料后发酵罐中的菌种数量，不影响放料后发酵罐中的发酵培养，放料体积优选为放料前发酵罐中培养基体积的5-10％。

现有技术中，将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，随着发酵的进行，赖氨酸酸度逐渐提高，营养物质逐渐降低，发酵产酸速率呈下降趋势，当营养物质降低到一定程度后，发酵产酸速率降低到一定程度即判断为发酵终点，达到发酵终点即放罐，放罐是指将发酵罐中的培养基全部从发酵罐中放出，即停止发酵。现有技术中一般发酵培养40-50小时后放罐。本发明由于在发酵培养过程中流加各种营养物质，因此可适当延长发酵培养的时间，优选发酵培养42-54小时后放罐。

本领域技术人员应该理解的是，为了得到纯度较高的赖氨酸产品，本发明方法还包括从放料或放罐的溶液中提取赖氨酸。对于提取赖氨酸的方法无特殊要求，可以采用本领域常用的各种方法，例如，采用连续离子交换分离提取方法，向放料或放罐的溶液中加入大量的浓硫酸调pH至2.0-3.0进行酸化，酸化后经过金属膜或陶瓷膜过滤除去菌体，得到赖氨酸膜滤液即赖氨酸清液，或将酸化后的赖氨酸发酵液经絮凝过滤除菌体后得到赖氨酸清液，除菌体后的赖氨酸清液采用强酸型阳离子交换树脂进行吸附交换，树脂吸附饱和后用稀氨水进行洗脱，洗脱下来的赖氨酸经浓缩、盐酸调节pH值、结晶、固液分离、烘干，得到赖氨酸盐酸盐成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使赖氨酸发酵液酸化，经过滤或离心等方法除去菌体。在除去菌体后的赖氨酸清液中加入氢氧化钙调节pH值至8.0-11.5，使赖氨酸清液中的盐、胶体等杂质生成不溶物，经固液分离后得到赖氨酸溶液，将赖氨酸溶液浓缩至每毫升赖氨酸溶液中赖氨酸的含量为0.6-0.8g，再经过过滤可以得到高纯度的赖氨酸溶液，然后经浓缩、盐酸调节pH值、结晶、固液分离、烘干，得到赖氨酸盐酸盐成品。

本发明中，对发酵培养的条件无特殊要求，可以采用本领域常用的条件，优选情况下，所述发酵培养的条件包括：温度为35-38℃，压力为0.05-0.1MPa，pH值为6.7-7.4，通气量为0.5-1.2立方米空气/立方米的培养基/分钟。

本发明中，对赖氨酸发酵菌种的种类无特殊要求，可以采用本领域常用的菌种，优选为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和黄色短杆菌中的至少一种。

另外，本领域技术人员应该理解的是，接入种子罐进行培养的菌种为经过活化后进行增殖培养后的菌种。活化和增殖培养为本领域的公知常识，在此不再赘述。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

在下述实施例和对比例中：甜菜糖蜜购于山东聊城盈动商贸有限公司。

OD值测定：将取样的发酵液进行26倍稀释，采用722N可见光分光光度计，在波长562纳米可见光下测定吸光值，即为OD值。

按照GB/T5009.7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的浓度。

按照GB3595-83的方法测定发酵液中铵根离子的浓度。

按照GB/T 1274-2011的方法测定发酵液中磷酸二氢钾的浓度。

按照GB/T 664-93的方法测定发酵液中硫酸亚铁的浓度。

按照GB/T671-1998的方法测定发酵液中硫酸镁的浓度。

按照GB/T15899-1995的方法测定发酵液中硫酸锰的浓度。

按照GB/T 21979-2008的方法测定发酵液中苏氨酸的浓度。

按照GB/T 17810-2009的方法测定发酵液中蛋氨酸的浓度。

按照生物传感仪法测定发酵液中谷氨酸的浓度。

按照GB/T 23180-2008的方法测定发酵液中生物素的浓度。

按照GB/T 7301-2002的方法测定发酵液中烟酰胺的浓度。

按照GB/T 14700-2002的方法测定发酵液中维生素B1的浓度。

按照GB10794-89标准检测发酵液中的赖氨酸浓度(以赖氨酸盐酸盐计)。

单罐供酸量＝(放罐的赖氨酸浓度×放罐体积+中间放料赖氨酸浓度×中间放料体积)。

转化率(％)＝单罐供酸量/总糖的重量×100％，其中总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。

在下述实施例和对比例中：淀粉质原料液化清液按照以下方法制备：

(1)将收获的100重量份玉米通过机械加工将玉米颗粒粉碎，使玉米粉过60目筛的通过率为80％。

(2)将粉碎后的产物加水调浆至14Bé°，相对于每克粉碎产物的干重，加入120个酶活力单位的淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶)，在84℃、pH为5.8的条件下酶解100分钟，然后进行碘试，碘试呈本色合格，不需进行二次酶解，若碘试不合格，需加入20个酶活力单位的淀粉酶，在90℃、pH为6.0的条件下继续酶解20分钟，然后进行二次碘试，碘试合格，得到酶解产物，然后将酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液即淀粉质原料液化清液(固含量为20重量％)，淀粉质原料液化清液中的葡萄糖含量约为25重量％。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的生产方法。

(1)配制种子罐培养基，具体组成为：相对于每升培养基，取淀粉质原料液化清液的用量为35克，玉米浆(干重为35重量％)的用量为80克，磷酸氢二钾的用量为1.0克，硫酸镁的用量为0.5克，硫酸铵的用量为10克，苏氨酸的用量为0.2克，蛋氨酸的用量为0.2克，谷氨酸的用量0.2克，生物素的用量为0.01毫克，烟酰胺的用量为0.1毫克，维生素B1的用量为0.2毫克。将培养基加热到121℃消毒，维持20分钟后降温至37℃并保持恒定。开启搅拌，调节罐压为0.1MPa，按照通风量与培养基1:0.5体积比通入无菌空气，用氨水调节pH至6.8并保持恒定。将黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)活化和增殖后接入种子罐中进行培养，培养过程中每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养，得到成熟种子液。

(2)配制发酵培养基，具体组成为：相对于每升发酵培养基，取淀粉质原料液化清液的用量为50克，甜菜糖蜜的用量为40克，玉米浆(干重为35重量％)的用量为30克，硫酸铵的用量为30克，磷酸二氢钾的用量为1.0克，硫酸镁的用量为0.5克，硫酸锰的用量为0.01克，硫酸亚铁的用量为0.01克，苏氨酸的用量为0.2克，蛋氨酸的用量为0.2克，谷氨酸的用量为0.3克，生物素的用量为0.05毫克，烟酰胺的用量为0.1毫克，维生素B1的用量为0.2毫克，乙二胺四乙酸(EDTA)的用量为9克。将培养基加热到121℃消毒30分钟后降温至37℃并保持恒定，用氨水调节pH至6.9。

(3)在发酵罐中装入步骤(2)中配制好的发酵培养基，发酵培养基的体积为发酵罐体积的30％。将步骤(1)所得的成熟种子液，接入发酵罐的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，步骤(2)所得的成熟种子液的接种量为15体积％。接种后连续流加淀粉质原料液化清液和硫酸铵，流加淀粉原料液化清液的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在6-8克/升，流加硫酸铵的量使发酵液中铵根离子的浓度控制在1.0-1.3克/升。将罐压控制为0.1MPa，发酵温度控制为37℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养基/分钟，并用液氨调节pH维持在7.0进行发酵培养。分别在发酵培养2小时后至发酵培养12小时内向发酵液中连续流加EDTA，流加EDTA的量使发酵液中EDTA的浓度控制在9克/升；在发酵13小时后至发酵培养结束前6小时向发酵液中连续流加磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰，流加磷酸二氢钾的量使发酵液中磷酸二氢钾的浓度控制在0.4克/升，流加硫酸镁的量使发酵液中硫酸镁的浓度控制在0.2克/升，流加硫酸亚铁的量使发酵液中硫酸亚铁的浓度控制在0.01克/升，流加硫酸锰的量使发酵液中硫酸锰的浓度控制在0.01克/升；在发酵培养16小时至发酵培养42小时内向发酵液中连续流加苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸，流加苏氨酸的量使发酵液中苏氨酸的浓度控制在0.1克/升，流加蛋氨酸的量使发酵液中蛋氨酸的浓度控制在0.1克/升，流加谷氨酸的量使发酵液中谷氨酸的浓度控制在0.2克/升；在发酵培养20小时后至发酵培养45小时内向发酵液中连续流加生物素、烟酰胺和维生素B1，流加生物素的量使发酵液中生物素的浓度控制在0.05毫克/升，流加烟酰胺的量使发酵液中烟酰胺的浓度控制在0.1毫克/升，流加维生素B1的量使发酵液中维生素B1的浓度控制在0.2毫克/升。

流加淀粉质原料液化清液和硫酸铵，以及流加EDTA、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、苏氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、烟酰胺和维生素B1至发酵罐体积的75％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养基体积的8％。发酵培养42小时后放罐，测定放罐的赖氨酸浓度(即终点赖氨酸含量，下同)和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的生产方法。

种子罐培养基配方、种子罐成熟种子液培养方法、发酵罐培养基配方均与实施例1相同。

发酵罐中的培养基体积为发酵罐体积的40％。将成熟种子液接入发酵罐的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，种子液的接种量为12体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料液化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料液化清液的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在5-7克/升，流加硫酸铵的量使发酵液中铵根离子的浓度控制在1.0-1.3克/升，将罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为35℃，通气量为0.8立方米空气/立方米的培养基/分钟，并用液氨调节pH维持在7.2进行发酵培养。分别在发酵培养6小时后至发酵培养15小时内向发酵液中连续流加EDTA，流加EDTA的量使发酵液中EDTA的浓度控制在11克/升；在发酵15小时后至发酵培养结束前7小时向发酵液中连续流加磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰，流加磷酸二氢钾的量使发酵液中磷酸二氢钾的浓度控制在1.2克/升，流加硫酸镁的量使发酵液中硫酸镁的浓度控制在0.5克/升，流加硫酸亚铁的量使发酵液中硫酸亚铁的浓度控制在0.05克/升，流加硫酸锰的量使发酵液中硫酸锰的浓度控制在0.08克/升；在发酵培养17小时至发酵培养40小时内向发酵液中连续流加苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸，流加苏氨酸的量使发酵液中苏氨酸的浓度控制在0.4克/升，流加蛋氨酸的量使发酵液中蛋氨酸的浓度控制在0.5克/升，流加谷氨酸的量使发酵液中谷氨酸的浓度控制在0.6克/升；在发酵培养21小时后至发酵培养46小时内向发酵液中连续流加生物素、烟酰胺和维生素B1，流加生物素的量使发酵液中生物素的浓度控制在0.8毫克/升，流加烟酰胺的量使发酵液中烟酰胺的浓度控制在1.0毫克/升，流加维生素B1的量使发酵液中维生素B1的浓度控制在0.8毫克/升。

流加淀粉质原料液化清液和硫酸铵，以及流加EDTA、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、苏氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、烟酰胺和维生素B1至发酵罐体积的70％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养基体积的5％。发酵培养48小时后放罐，测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的生产方法。

种子罐培养基配方、种子罐成熟种子液培养方法、发酵罐培养基配方均与实施例1相同。

发酵罐中的培养基体积为发酵罐体积的60％。将成熟种子液接入发酵罐的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，种子液的接种量为18体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料液化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料液化清液的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在8-10克/升，流加硫酸铵的量使发酵液中铵根离子的浓度控制在1.0-1.3克/升，将罐压控制为0.05MPa，发酵温度控制为38℃，通气量为0.9立方米空气/立方米的培养基/分钟，并用液氨调节pH维持在7.4进行发酵培养。分别在发酵培养4小时后至发酵培养14小时内向发酵液中连续流加EDTA，流加EDTA的量使发酵液中EDTA的浓度控制在10克/升；在发酵14小时后至发酵培养结束前8小时向发酵液中连续流加磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰，流加磷酸二氢钾的量使发酵液中磷酸二氢钾的浓度控制在0.8克/升，流加硫酸镁的量使发酵液中硫酸镁的浓度控制在0.4克/升，流加硫酸亚铁的量使发酵液中硫酸亚铁的浓度控制在0.03克/升，流加硫酸锰的量使发酵液中硫酸锰的浓度控制在0.05克/升；在发酵培养18小时至发酵培养41小时内向发酵液中连续流加苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸，流加苏氨酸的量使发酵液中苏氨酸的浓度控制在0.25克/升，流加蛋氨酸的量使发酵液中蛋氨酸的浓度控制在0.35克/升，流加谷氨酸的量使发酵液中谷氨酸的浓度控制在0.4克/升；在发酵培养22小时后至发酵培养48小时内向发酵液中连续流加生物素、烟酰胺和维生素B1，流加生物素的量使发酵液中生物素的浓度控制在0.2毫克/升，流加烟酰胺的量使发酵液中烟酰胺的浓度控制在0.7毫克/升，流加维生素B1的量使发酵液中维生素B1的浓度控制在0.5毫克/升。

流加淀粉质原料液化清液和硫酸铵，以及流加EDTA、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、苏氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、烟酰胺和维生素B1培养过程中底料加流加培养基体积为至发酵罐体积的80％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养基体积的10％。发酵培养52小时后放罐，测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

对比例1

按照实施例3的方法生产赖氨酸，不同的是，在发酵培养基配制中不加入EDTA，并且在发酵过程中不向发酵液中流加EDTA、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、苏氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、生物素、烟酰胺和维生素B1。发酵培养52小时后放罐，测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

对比例2

按照实施例3的方法生产赖氨酸，不同的是，在发酵培养基配制中不加入EDTA，并且在发酵过程中不向发酵液中流加EDTA。发酵培养52小时后放罐，测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

表1

从表1中可以看出，采用本发明方法发酵生产赖氨酸，可以明显提高终点赖氨酸含量、单罐供酸量和转化率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种赖氨酸的生产方法，该方法包括将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，其特征在于，在发酵培养2-6小时后至发酵培养12-16小时内向发酵液中流加促进剂，在发酵培养12-16小时后至发酵培养结束前6-8小时内向发酵液中流加无机盐，在发酵培养16-20小时后至发酵培养40-42小时内向发酵液中流加氨基酸，在发酵培养20-24小时后至发酵培养42-48小时内向发酵液中流加维生素，其中，所述促进剂为乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和氨基三乙酸钠中的一种或多种；所述无机盐为硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰和磷酸二氢钾；所述氨基酸为苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸；所述维生素为生物素、烟酰胺和维生素B1，

流加促进剂的量使发酵液中促进剂的浓度控制在8-12克/升；流加硫酸镁的量使发酵液中硫酸镁的浓度控制在0.4-0.5克/升，流加硫酸亚铁的量使发酵液中硫酸亚铁的浓度控制在0.03-0.05克/升，流加硫酸锰的量使发酵液中硫酸锰的浓度控制在0.05-0.08克/升，流加磷酸二氢钾的量使发酵液中磷酸二氢钾的浓度控制在0.8-1.2克/升；流加苏氨酸的量使发酵液中苏氨酸的浓度控制在0.25-0.4克/升，流加蛋氨酸的量使发酵液中蛋氨酸的浓度控制在0.35-0.5克/升；流加谷氨酸的量使发酵液中谷氨酸的浓度控制在0.4-0.6克/升；流加生物素的量使发酵液中生物素的浓度控制在0.2-0.8毫克/升，流加烟酰胺的量使发酵液中烟酰胺的浓度控制在0.7-1毫克/升，流加维生素B1的量使发酵液中维生素B1的浓度控制在0.5-0.8毫克/升。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述碳源为淀粉质原料液化清液；所述氮源为铵盐，所述铵盐为硫酸铵。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，以接种后且流加碳源和流加氮源之前的发酵培养基为基准，所述赖氨酸发酵菌种的接种量为10-18体积％。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流加碳源的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在4-10克/升，所述流加氮源的量使发酵液中氮的浓度控制在0.8-1克/升。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流加为连续流加。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养在发酵罐中进行，接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养基的体积为发酵罐体积的30-60％，当流加碳源和氮源以及流加所述促进剂、无机盐、氨基酸和维生素至发酵罐体积的70-80％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养基体积的5-10％。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，发酵培养42-54小时后放罐。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法还包括从所述放料或所述放罐的溶液中提取赖氨酸。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养的条件包括：温度为35-38℃，压力为0.05-0.1MPa，pH值为6.7-7.4，通气量为0.5-1.2立方米空气/立方米的培养基/分钟。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述赖氨酸发酵菌种为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和黄色短杆菌中的至少一种。