CN112481322A - 苏氨酸高效发酵生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了苏氨酸高效发酵生产工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备发酵培养基，步骤2）苏氨酸发酵，步骤3）浓缩离心，步骤4）结晶离心，步骤5）干燥破碎。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及苏氨酸高效发酵生产工艺。
背景技术
苏氨酸，学名2-氨基-3-羟基丁酸。苏氨酸是一种必需的氨基酸，苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。特别是饲料添加剂方面的用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。在配合饲料中加入L-苏氨酸，具有如下的特点：①可以调整饲料的氨基酸平衡，促进禽畜生长；②可改善肉质；③可改善氨基酸消化率低的饲料的营养价值；④可降低饲料原料成本；因此在欧盟国家（主要是德国、比利时、丹麦等）和美洲国家，已广泛地应用于饲料行业。
目前，苏氨酸的生产方法主要有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法三种，其中微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法。申请人是全球最大的氨基酸生物发酵企业，其中，苏氨酸是主要的出口型氨基酸。提高苏氨酸的产率和糖酸转化率可以节约生产成本，促进苏氨酸的产业化生产，也是申请人不断改进和优化的方向。
“L-苏氨酸工业生产发酵条件优化研究，卢伟宁，生物学杂志2010年10月” 以高产L-苏氨酸菌作为出发菌株,结合实际工业生产条件对发酵各条件进行了一系列优化研究，结果表明: 添加0.2%的工业级生长促进剂（生长促进剂由本公司自主研发配制,主要含有促进生长的生物素及其他有益营养成分）,以复合糖代替葡萄糖为初糖,并控制初糖浓度在60g/L，除生长高峰期外，发酵过程中溶解氧控制在 10%-20%之间; 最终发酵放罐湿菌体在45g/L,苏氨酸含量可达110g/L左右。
申请人之前的专利技术“CN109136299A,一种制备、提取以及纯化苏氨酸的方法”在发酵后期通过添加曲拉通X-100结合温度压强的改变，实现菌株培养与透性化处理的耦合，可以在不需要对培养好的细胞进行后续透性化处理的情况下减小菌体细胞壁和细胞膜对底物和产物的传质限制，避免后续透性化处理细胞的步骤及相关设备运转的投入，为提高苏氨酸酸产量提供了一个简便方法。
专利技术“CN110904167A，L-苏氨酸发酵过程优化方法” 通过流加柠檬酸钠能够对柠檬酸脱氢酶产生一定的抑制作用，适当削弱三羧酸循环，能够减少副产物的生成及能量的损失，从而对于提高苏氨酸产率有积极意义；乙醛酸循环消耗大量的ATP及造成碳源的浪费，通过流加琥珀酸对异柠檬酸裂解酶具有抑制作用，从而对减少进入乙醛酸循环代谢流量，苏氨酸产率增加。磷酸戊糖途径对氨基酸发酵也存在较大的影响，如何通过增强磷酸戊糖途径来提高菌株发酵苏氨酸的合成效率现有技术并未给出相关的记载。
发明内容
在现有技术的基础上，为了提高苏氨酸的发酵生产效率，本发明继续对发酵过程进行优化，提供了苏氨酸高效发酵生产工艺。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
苏氨酸高效发酵生产工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
步骤1）制备发酵培养基，步骤2）苏氨酸发酵，步骤3）浓缩离心，步骤4）结晶离心，步骤5）干燥破碎。
具体地，所述工艺包括如下步骤：
步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸0-200mg/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，VB1 2mg/L，VH 50μg/L；
步骤2）苏氨酸发酵：将L-苏氨酸生产菌株的种子液接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度36℃，搅拌转速为300rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集苏氨酸发酵液；
步骤3）浓缩离心：苏氨酸发酵液经陶瓷膜浓缩5-7倍，然后加等量的水，再用硫酸调pH4.0；加热至80℃，然后由卧螺离心机以5000rpm离心3min，收集上清液，
步骤4）结晶离心：将上清液经过双效蒸发器浓缩至原液体积的1/3，用间歇式单效浓缩结晶锅结晶，当锅内料液浓缩至波美度为28时开始加晶种；当锅内晶体大小在1.0mm时，用离心机离心，收集晶体；
步骤5）干燥破碎：将晶体采用70℃流化床干燥，破碎、整粒得到苏氨酸产品。
优选地，所述4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的浓度为100mg/L。
优选地，所述4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的浓度为75mg/L。
优选地，所述4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的浓度为50mg/L。
优选地，所述发酵还包括流加补料液的步骤。
优选地，所述结晶过程中控制温度65℃，真空度0.08MPa。
优选地，所述步骤4）中的离心具体为：离心机转速由400r/min以20r/s的速率升至900r/min，然后维持900r/min的转速离心150s。
更优选地，
所述流加补料液的步骤为：
1）通过流加50%的蔗糖溶液控制含糖量为3%，直至发酵结束；
2）通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束；
3）在发酵至20h，于每升发酵液中以2ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；
4）在发酵至20h，于每升发酵液中以15ml/h的流速往发酵罐中补料流加琥珀酸和柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束；所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L；
5）在发酵至30h，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L。
本发明取得的有益效果主要包括以下几个方面：
磷酸戊糖途径能够产生6—磷酸葡萄糖和5—磷酸核糖，有利于后需提供足量的三磷酸甘油醛进入苏氨酸合成途径；还能为苏氨酸合成提供大量的NADPH，提高苏氨酸的合成效率。本研究发现，发酵培养基中添加4-羟基-3-甲氧基苯甲酸能够激活磷酸戊糖途径中的多种关键酶，包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，进而提高苏氨酸的糖酸转化率和发酵效率；经浓度梯度试验发现，50mg/L以内的4-羟基-3-甲氧基苯甲酸浓度对苏氨酸的糖酸转化率和发酵效率影响较小，50-100mg/L的浓度能够明显提高苏氨酸的糖酸转化率和发酵效率，继续增大4-羟基-3-甲氧基苯甲酸浓度，苏氨酸的糖酸转化率和发酵效率反而有所下降，可能是过大浓度的4-羟基-3-甲氧基苯甲酸对苏氨酸合成的其他酶或前体物质产生了抑制作用。
发酵液浓缩到5-7倍时陶瓷膜的通量开始急剧下降，陶瓷膜不再继续浓缩，而由卧螺离心机分离菌体蛋白，降低陶瓷膜的运行压力，减少由于菌体蛋白浓度上升造成陶瓷膜芯污染的情况发生。发酵液经陶瓷膜过滤后的浓缩液，经过加水稀释、调酸和加热促使菌体蛋白絮凝，再由卧螺离心机离心，分离后得到的是不含有菌体蛋白的清液。本发明生产工艺适合苏氨酸的生产。
附图说明
图1：4-羟基-3-甲氧基苯甲酸对发酵液中苏氨酸含量的影响；
图2：4-羟基-3-甲氧基苯甲酸对糖酸转化率的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种提高苏氨酸糖酸转化率的方法，其包括如下步骤：
步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸100mg/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，VB1 2mg/L，VH 50μg/L。
步骤2）发酵：将L-苏氨酸生产菌株（以大肠杆菌工程菌TRFC为例）种子液按照1.5%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，接种密度OD600为0.4，温度36℃，搅拌转速为300rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液；
发酵过程中需要流加补料液，具体如下：
1）通过流加50%（蔗糖50g加水定溶至100ml即为50%溶液）的蔗糖溶液控制含糖量为3%，直至发酵结束；
2）通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束；
3）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以2ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；
4）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以15ml/h的流速往发酵罐中补料流加琥珀酸和柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束；所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L；
5）在发酵至30h左右，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L。
实施例2
苏氨酸发酵液的提取分离方法，其包括如下步骤：
1）苏氨酸发酵液经陶瓷膜浓缩6倍，然后加等量的水，再用硫酸调pH4.0；加热至80℃，然后由卧螺离心机以5000rpm离心3min，收集上清液，
2）将上清液经过双效蒸发器浓缩至原液体积的1/3，用间歇式单效浓缩结晶锅结晶，当锅内料液浓缩至波美度(ºBe)为28时开始加晶种，结晶过程控制温度65℃，真空度0.08MPa；当锅内晶体大小在1.0mm时，用离心机离心，离心机转速由400r/min以20r/s的速率升至900r/min，然后维持900r/min的转速离心150s，最后收集晶体；
3）分离出的晶体采用70℃流化床干燥，破碎、整粒得到苏氨酸产品。
对比例1（CN110904167A 实施例1）
一种提高苏氨酸糖酸转化率的方法，其包括如下步骤：
步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，VB1 2mg/L，VH 50μg/L。
步骤2）发酵：将L-苏氨酸生产菌株（以大肠杆菌工程菌TRFC为例）种子液按照1.5%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，接种密度OD600为0.4，温度36℃，搅拌转速为300-500rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液；
发酵过程中需要流加补料液，具体如下：
1）通过流加50%（蔗糖50g加水定溶至100ml即为50%溶液）的蔗糖溶液控制含糖量为3%，直至发酵结束；
2）通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束；
3）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以2ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；
4）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以15ml/h的流速往发酵罐中补料流加琥珀酸和柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束；所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L；
5）在发酵至30h左右，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L。
实施例3
4-羟基-3-甲氧基苯甲酸对发酵液中苏氨酸含量和糖酸转化率的影响。
在对比例1的基础上，验证4-羟基-3-甲氧基苯甲酸对苏氨酸发酵的影响， 设置发酵培养基中4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的添加量为：0，5，25，50，75,100，125,150,200，单位为mg/L，如图1所示，0-50mg/L的低浓度时，随着4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的添加量，苏氨酸产量有小幅的提高，当增加到75mg/L时，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的含量有明显的上调，继续增加4-羟基-3-甲氧基苯甲酸到100mg/L，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸仍有小幅的提升，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸添加量为125mg/L时，较100mg/L添加量反而降低了3%左右，当4-羟基-3-甲氧基苯甲酸添加量为150-200mg/L时，苏氨酸产量有明显的下降，可能原因是过大浓度的4-羟基-3-甲氧基苯甲酸对苏氨酸合成的其他酶或前体物质产生了抑制作用。如图2所示，糖酸转化率和苏氨酸产量曲线趋势几乎一致，说明4-羟基-3-甲氧基苯甲酸是通过提高糖酸转化率来增加苏氨酸的发酵产量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.苏氨酸高效发酵生产工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
步骤1）制备发酵培养基，步骤2）苏氨酸发酵，步骤3）浓缩离心，步骤4）结晶离心，步骤5）干燥破碎。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸0-200mg/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，VB1 2mg/L，VH 50μg/L；
步骤2）苏氨酸发酵：将L-苏氨酸生产菌株的种子液接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度36℃，搅拌转速为300rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集苏氨酸发酵液；
步骤3）浓缩离心：苏氨酸发酵液经陶瓷膜浓缩5-7倍，然后加等量的水，再用硫酸调pH4.0；加热至80℃，然后由卧螺离心机以5000rpm离心3min，收集上清液，
步骤4）结晶离心：将上清液经过双效蒸发器浓缩至原液体积的1/3，用间歇式单效浓缩结晶锅结晶，当锅内料液浓缩至波美度为28时开始加晶种；当锅内晶体大小在1.0mm时，用离心机离心，收集晶体；
步骤5）干燥破碎：将晶体采用70℃流化床干燥，破碎、整粒得到苏氨酸产品。
3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的浓度为100mg/L。
4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的浓度为75mg/L。
5.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的浓度为50mg/L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵还包括流加补料液的步骤。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述结晶过程中控制温度65℃，真空度0.08MPa。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4）中的离心具体为：离心机转速由400r/min以20r/s的速率升至900r/min，然后维持900r/min的转速离心150s。
9.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述流加补料液的步骤为：
1）通过流加50%的蔗糖溶液控制含糖量为3%，直至发酵结束；
2）通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束；
3）在发酵至20h，于每升发酵液中以2ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；
4）在发酵至20h，于每升发酵液中以15ml/h的流速往发酵罐中补料流加琥珀酸和柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束；所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L；
5）在发酵至30h，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L。
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