CN108285914B - 一种l-色氨酸的发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种L‑色氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：步骤1)制备L‑色氨酸发酵液，步骤2)菌株二次处理，步骤3)合并提取L‑色氨酸。本发明通过对菌株进行处理，提高了L‑色氨酸的发酵效率。

Description

一种L-色氨酸的发酵工艺
技术领域
本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种L-色氨酸的发酵工艺。
背景技术
L-色氨酸的分子式为C11H12O2N2，分子量为204.21，含氮13.72％。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味水中溶解度1.14g/L(25℃)溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。
L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料行业。
近年来，随着国内饲料工业的发展和L-色氨酸及其代谢产物研究的深入，尤其是随着我国老龄化程度不断加重，L-色氨酸在医药行业上的用途也不断扩大。目前，L-色氨酸逐渐成为一种国际市场发展潜力巨大、国内市场需求较大的产品。
目前，L-色氨酸的生产方法主要有4种：(1)蛋白质水解法：主要从含有相对丰富的L-色氨酸的废蚕丝、毛发和血粉等蛋白质原料通过酶水解或碱水解法来提取L-色氨酸。蛋白质水解法工艺复杂，生产周期长，产品成分复杂，现在使用较少。(2)化学合成法：化学合成主要以苯阱为原料或者以吲哚为原料合成，合成之后为DL-色氨酸，在经过拆分得到L-色氨酸。这种方法原料成本高，工艺复杂，工业推广差。(3)酶促转换法：利用微生物产生的L-色氨酸合成酶系转化前体合成L-色氨酸的方法。此法L-色氨酸合成酶受吲哚影响较严重，底物L-丝氨酸价格较高，吲哚水溶性较差，转化率不高。(4)发酵法：是指利用L-色氨酸高产菌种，采用葡萄糖等廉价碳源做原料，控制合适的发酵条件，从而获得L-色氨酸产品的一种方法。发酵法已经成为当前工业生产L-色氨酸最重要的方法。申请人之前的专利技术“一种工业化发酵高产L-色氨酸的方法”采用两种菌株混合发酵的方式，产酸率较单一菌株提高，但是存在培养工艺复杂、参数难以控制等缺陷。
发明内容
本发明需要解决的实际技术问题是，克服现有技术的不足之处，提供了一种L-色氨酸的发酵工艺。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的，
一种L-色氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：步骤1)制备L-色氨酸发酵液，步骤2)菌株二次处理，步骤3)合并提取L-色氨酸。
具体地，所述发酵工艺包括如下步骤：
步骤1)制备L-色氨酸发酵液：将产L-色氨酸的大肠杆菌培养至浓度为1×107cfu/mL的种子液，然后按照6-8％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，控制发酵温度36℃，溶氧控制20％，罐压为0.05MPa，并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为6.8-7；发酵至30h停止，得到L-色氨酸发酵液；
步骤2)菌株二次处理：利用高速碟片分离机离心处理L-色氨酸发酵液，收集上层料液和湿菌体分离；往湿菌体中添加1-2wt％电气石粉，100rpm搅拌10-15min，然后停止搅拌，加热至53-55℃，保温1-2min，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度36℃，100rpm搅拌培养4-6h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液；
步骤3)合并提取L-色氨酸：将步骤2)所得上层料液和滤液合并，用于提取L-色氨酸。
优选地，
所述发酵培养基组分为：葡萄糖20g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1.5g/L、柠檬酸1.5g/L、硫酸亚铁70mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锰7mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L。
优选地，
所述透析培养基为(质量百分比)：磷酸二氢钾1.0％，磷酸氢二钾1.0％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.01％，硫酸锰0.01％，硫酸镁0.01％。
优选地，
所述无机陶瓷膜的膜孔径50nm。
优选地，
所述高速碟片机的离心转速为3000rpm，离心时间为5min。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明针对发酵工序的进行改进，避免L-色氨酸浓度积累到引起反馈抑制，针对发酵后的废弃菌体进行二次产酸处理，增加了细胞膜的通透性，提高了菌株的产酸能力，发酵周期大大延长；
适当时间和温度的热处理可以提高菌株的产酸能力以及细胞膜通透性，配合透析培养基，使得L-色氨酸的产率大大提高；
电气石能够自动释放负离子，负离子具有较强的氧化性，还持续发生直流静电，释放矿物质和微量元素，对菌株繁殖起促进作用；本发明采用透析培养基对菌株进行培养，能改变细胞的生物膜结构，促进物质的利用和转运，同时使L-色氨酸积累引起的反馈抑制调节大大降低，产酸效率提高，而且后续的残糖少，不会造成菌株黏着絮凝成团，有利用后续的膜过滤分离。
说明书附图
图1：电气石粉添加量对L-色氨酸含量的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种L-色氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：
将大肠杆菌CCTCC M 2011316培养至浓度为1×107cfu/mL的种子液，然后按照6％(v/v)接种量接种到发酵培养基(葡萄糖20g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1.5g/L、柠檬酸1.5g/L、硫酸亚铁70mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锰7mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L)中，控制发酵温度36℃，溶氧控制20％，罐压0.05MPa，并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为6.8；发酵至30h停止，得到L-色氨酸发酵液；
利用高速碟片分离机离心处理L-色氨酸发酵液，收集上层料液和湿菌体分离；高速碟片机的转速为3000rpm，时间为5min；往湿菌体中添加1.5wt％电气石粉，100rpm搅拌15min，然后停止搅拌，加热至53℃，保温2min，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度36℃，100rpm搅拌培养6h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液；所述透析培养基为(质量百分比)：磷酸二氢钾1.0％，磷酸氢二钾1.0％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.01％，硫酸锰0.01％，硫酸镁0.01％，调整pH为6.8；所述无机陶瓷膜的膜孔径50nm；
将上层料液和滤液合并，用于提取L-色氨酸。
实施例2
一种L-色氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：
将tnaA、trpR和tyrR基因敲除或失活的大肠杆菌ATCC 27325培养至浓度为1×107cfu/mL的种子液，然后按照7％(v/v)接种量接种到发酵培养基(葡萄糖20g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1.5g/L、柠檬酸1.5g/L、硫酸亚铁70mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锰7mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L)中，控制发酵温度36℃，溶氧控制20％，罐压0.05MPa，并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为7；发酵至30h停止，得到L-色氨酸发酵液；
利用高速碟片分离机离心处理L-色氨酸发酵液，收集上层料液和湿菌体分离；高速碟片机的转速为3000rpm，时间为5min；往湿菌体中添加2wt％电气石粉，100rpm搅拌10min，然后停止搅拌，加热至55℃，保温1min，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度36℃，100rpm搅拌培养5h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液；所述透析培养基为(质量百分比)：磷酸二氢钾1.0％，磷酸氢二钾1.0％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.01％，硫酸锰0.01％，硫酸镁0.01％，调整pH为7；所述无机陶瓷膜的膜孔径50nm；
将上层料液和滤液合并，用于提取L-色氨酸。
实施例3
各因素对L-色氨酸产量的影响：
以实施例1为试验组，发酵培养基设定为100L，检测上层料液和滤液中L-色氨酸产量，检测方法采用HPLC方法测定，具体参照2007版英国药典；
设置对照组，其中，对照组1：对照组1为：只进行透析培养处理，不采用电气石粉和热处理，其余同实施例1；对照组2：发酵完成之后，进行电气石粉以及透析培养处理，不采用热处理，其余同实施例1；对照组3：发酵完成之后，进行热处理以及透析培养处理，不采用电气石粉处理，其余同实施例1；检测各组别滤液中L-色氨酸的含量，具体结果见表1：
表1
Figure BSA0000155258240000051
结论：如表1所示，对发酵废弃菌体进行透析培养处理，仍能产生较高浓度的L-色氨酸，与实施例1组、对照组1-3均能够产生一定量的L-色氨酸，但是采用电气石粉处理、热处理以及透析培养处理三者协同方式的产酸效果最好，明显优于采用单一方式处理或者两种方式处理。
实施例4
以实施例2为例，检测了电气石粉添加量对滤液中L-色氨酸含量的影响，分别设定添加量为0，0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％(重量比)。如图1所示，随着添加量的增大，滤液中L-色氨酸含量逐渐提高，当增大到1.5％后，再增加电气石粉的量，L-色氨酸含量增加并不明显，添加量超过2％后，L-色氨酸含量呈降低趋势，可能因为过多的添加量菌株繁殖产生了不利影响。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。

Claims (3)

1.一种L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述发酵工艺包括如下步骤：
步骤1)制备L-色氨酸发酵液：将产L-色氨酸的大肠杆菌培养至浓度为1×107cfu/mL的种子液，然后按照6-8％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，控制发酵温度36℃，溶氧控制在20％，罐压为0.05MPa，并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0wt％，通过流加氨水控制在pH为6.8-7；发酵至30h停止，得到L-色氨酸发酵液；
步骤2)菌株二次处理：利用高速碟片分离机离心处理L-色氨酸发酵液，收集上层料液和湿菌体分离；往湿菌体中添加1-2.5wt％的电气石粉，100rpm搅拌10-15min，然后停止搅拌，加热至53-55℃，保温1-2min，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度为36℃，100rpm搅拌培养4-6h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液；
步骤3)合并提取L-色氨酸：将步骤2)所得上层料液和滤液合并，用于提取L-色氨酸；
所述发酵培养基组分为：葡萄糖20g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1.5g/L、柠檬酸1.5g/L、硫酸亚铁70mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锰7mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L；
所述透析培养基为，质量百分比：磷酸二氢钾1.0％，磷酸氢二钾1.0％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.01％，硫酸锰0.01％，硫酸镁0.01％。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述无机陶瓷膜的膜孔径为50nm。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述高速碟片分离机的离心转速为3000rpm，离心时间为5min。
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