CN104830923B - 一种利用嗜热乳杆菌从l-谷氨酸生物转化法生产l-谷氨酰胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用嗜热乳杆菌从L‑谷氨酸生物转化法生产L‑谷氨酰胺的方法，其特征在该方法是以L‑谷氨酸为反应底物，以嗜热乳杆菌全细胞为生化反应的酶进行生物转化生产L‑谷氨酰胺。本发明建立了一种直接以L‑谷氨酸为底物，通过嗜热乳杆菌（Lactobacillus thermophilus ）全细胞酶转化，直接生物合成L‑谷氨酰胺的方法。本发明方法生产周期短，原料成本和设备成本低廉，生产效率很高，产物积累浓度高，最终L‑谷氨酰胺的产物积累浓度可达150g/L，对L‑谷氨酸的分子转化率可达80%，具有极高的经济价值，产业化应用前景十分广阔。

Description

一种利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺 的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法。
背景技术
L-谷氨酰胺占人体游离氨基酸的61％，是人体最普遍的、不可缺乏的条件性必需氨基酸。
近二十年前，科学家们只知道L-谷氨酰胺的存在但并不是十分了解它的作用。一般将其视为治疗消化道溃疡药物之一。但是十多年来这种情况有了巨大的改变。由于一系列的突破性发现，科学家们认为L-谷氨酰胺是“不可缺乏的非必需氨基酸”，它已经成为发展新型药物、临床治疗及运动营养保健的重要材料。
目前，生产L-谷氨酰胺的方法有发酵法、酶法和化学合成法。化学合成法生产过程中要用易燃易爆的二硫化碳，工人工作条件难以令人满意，产品带有或轻或重的醋酸硫化物臭味；酶法需要制备谷氨酰胺合成酶，制备费用高，技术难度大；发酵法是现在较通用的L-谷氨酰胺生产方法，现有技术中主要是采用以葡萄糖为底物，黄色短杆菌为菌种直接发酵法生产L-谷氨酰胺，该方法原材料便宜易得，产品质量可靠稳定，但是，存在着生产周期长，效率低，产品收率低，产品不易分离提取等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高L-谷氨酰胺的生产效率，降低L-谷氨酰胺的生产成本，缩短生产周期，发酵过程产物积累浓度高，产物易分离提取的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法。
为实现上述发明目的所采取的技术方案为：
一种利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在该方法是以L-谷氨酸为反应底物，以嗜热乳杆菌全细胞为生化反应的酶进行生物转化生产L-谷氨酰胺。
上述嗜热乳杆菌全细胞的制备方法为：首先将斜面保存的嗜热乳杆菌进行摇瓶种子培养和发酵培养，然后离心分离，菌体破碎得到。
上述摇瓶种子培养和发酵培养所用的培养基组成为：酪朊水解物10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸二铵2g/L，吐温801.0mL/L，KH2PO46g/L,MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.15g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，L-谷氨酸钠25g/L。
上述发酵培养条件为：发酵液接种量为5％～15％，pH值为5.5～6.5，培养温度为40℃～45℃，通风量为0.2～1.5vvm，搅拌转速为100～200r/min，发酵时间为15～24h。
上述离心分离是指在4000～6000r/min，4～6℃下离心10～15分钟。
上述菌体破碎采用超声波破碎，超声波工作频率20～25KHz，功率为500W～800W，间歇时间为30s～35s，破碎时间为10～15min。
所述生物转化生产过程为：首先配制质量百分比浓度为15％～20％的L-谷氨酸的水溶液，然后加入其质量的30％～40％的硫酸铵，用碱调整pH值为5.8～6.0，最后加入L-谷氨酸质量的10％～15％的嗜热乳杆菌全细胞，在温度45℃～50℃，搅拌转速200～300r/min的转化条件下进行生物转化。
在生物转化过程中流加氨水。
在生物转化反应开始5h后，根据pH值的变化情况流加一定量的氨水，使反应体系的pH值保持在5.8～6.0。
在生物转化过程中，当转化体系连续3小时pH值的变化小于0.1时，反应终止。
本发明的设计原理为：
通常来说，L-谷氨酰胺的生物合成途径是首先由葡萄糖生物合成谷氨酸，再由谷氨酸生物合成L-谷氨酰胺，其中由L-谷氨酸生物合成L-谷氨酰胺有两个步骤：
1.谷氨酸(GA)在谷氨酸激酶(glutamate kinase)和ATP参与下生成γ-谷氨酰磷酸；
2.γ-谷氨酰磷酸和NH4 +在谷氨酰胺合成酶(GM合成酶)和Mg2+参与下进一步生成谷氨酰胺。
从上面可以看出，谷氨酸激酶是谷氨酰胺生物合成中的关键酶，因为它催化了谷氨酰胺生物合成中的第一步。ATP分子中含有的两个高能磷酸键可以供给生物体活动时所需能量，也可供给磷酸基。
嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)ATCC8317同黄色短杆菌的GA激酶活性、ATP含量和GM产量之间的关系同表1所示：
表1：
①在540nm处测定的光密度代表所生成氧亏酸的量。
②用荧光素酶-荧光素仪和ATP光密度计测定的1*10-15g菌体中的ATP含量。
由表1可知，嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)ATCC8317细胞内谷氨酸激酶的活性和ATP含量比之直接发酵法生产谷氨酰胺的菌种黄色短杆菌毫不逊色。
基于上述理由，本发明建立了一种直接以L-谷氨酸为底物，通过嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)全细胞酶转化，直接生物合成L-谷氨酰胺的方法。本发明的技术优势体现在：
第一，本发明所用的嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)具有嗜热的特点，在菌体培养过程温度可达45℃～50℃，在此温度下大部分细菌都难以生长，这大大降低了发酵过程染菌的几率，从而大大降低了生产成本。
第二，本发明所用的嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)细胞内谷氨酸激酶的活性和ATP含量比直接发酵法生产谷氨酰胺的菌种黄色短杆菌高，具体见表1。在L-谷氨酰胺的合成代谢上，本发明比直接发酵法所能积累的L-谷氨酰胺产量更高，生产周期更短，底物的转化率更高，生产成本更低，具体见表2。
表2：
项目 直接发酵法 本发明
菌种 黄色短杆菌 嗜热乳杆菌
底物 葡萄糖 L-谷氨酸
底物转化率 30％～35％ 95％～98％
生产周期 40h～50h 18～20h
综上所述，本发明方法生产周期短，原料成本和设备成本低廉，生产效率很高，产物积累浓度高，最终L-谷氨酰胺的产物积累浓度可达150g/L，对L-谷氨酸的分子转化率可达80％，具有极高的经济价值，产业化应用前景十分广阔。
具体实施方式
1.嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)细胞的制备和收集破碎：
挑选1环斜面保存的嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)菌株，加入到体积100mL种子培养基中，在45℃～50℃，100～150r/min往复式摇床培养15～24h后得到一级种子液；再将一级种子液以5～15％的接种量接种发酵罐。发酵培养结束后将发酵液在4000～7000r/min，4℃下离心10～20分钟得到嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)湿菌体。
将湿菌体采用超声波破碎，超声波工作频率20～25KHz，功率为500W～800W，间歇时间为30s～35s，破碎时间为10～15min。
上述摇瓶种子培养基和发酵培养基由以下组分组成：
酪朊水解物10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸二铵2g/L，吐温801.0mL/L，KH2PO46g/L,MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O0.15g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，L-谷氨酸钠25g/L。
发酵罐培养制备嗜热乳杆菌的发酵工艺条件为：发酵液接种量为5％～15％，pH值为5.5～6.5，培养温度为40℃～45℃，通气量为0.2～1.5(v/v·min)，搅拌转速为100～200r/min，发酵时间为15～24h。
2.以嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)全细胞为酶，以L-谷氨酸为反应的底物，生物转化法生产L-谷氨酰胺：
配制质量百分比浓度为15％～20％的L-谷氨酸水溶液，然后加入L-谷氨酸质量30％～40％的硫酸铵，用碱调节pH值为5.8～6.0，再加入过程1中所得的湿菌体破碎液，加入量为L-谷氨酸质量的10％～15％，然后在温度45℃～50℃，搅拌转速200～300r/min的转化条件下开始生物转化。
3.转化过程中流加氨水：
生物转化反应开始5h后，根据pH值的变化情况流加一定量的氨水，使反应体系的pH值保持在5.8～6.0。
4.生物转化体系的终止
当转化体系连续3小时pH值的变化小于0.1，即连续3小时氨水流加量为0时，全细胞转化反应终止，将反应液加热煮沸后备用，留待产物提取。
5.L-谷氨酰胺的提取纯化，包括以下四个步骤：
⑴收集终止反应后的反应液，将反应液离心去除菌体，离心机转速为6000～8000转/min，离心时间为10～15min；
⑵将经过步骤⑴离心后的清夜真空减压浓缩，真空度为0.1MPa，温度为40～50min；
⑶把经过步骤⑵的浓缩液调节pH至L-谷氨酰胺的等电点5.65左右(pH为5.4～5.7)，进结晶锅结晶，结晶温度为4℃；
⑷把经过步骤⑶的晶体母液混合料通过离心进行母液分离，离心机转速为3000～4000转/min，离心时间为5～10min；
⑸把经过步骤⑷的L-谷氨酰胺晶体真空干燥，干燥真空度为0.1MPa，干燥温度为50～60℃，干燥后的L-谷氨酰胺成品为白色粉末状，纯度98.5％以上。

Claims (9)

1.一种利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在该方法是以L-谷氨酸为反应底物，以嗜热乳杆菌全细胞为生化反应的酶进行生物转化生产L-谷氨酰胺；
上述嗜热乳杆菌全细胞为将斜面保存的嗜热乳杆菌进行摇瓶种子培养和发酵培养，然后离心分离，菌体破碎而得到。
2.按照权利要求1所述的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于上述摇瓶种子培养和发酵培养所用的培养基组成为：酪朊水解物10 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1.0 mL/L，KH2PO4 6g/L, MgSO4·7 H2O 0.58 g/L，MnSO4·4H2O 0.15 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，L-谷氨酸钠25g/L。
3.按照权利要求1或2所述的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于上述发酵培养条件为：发酵液接种量为5%～15%，pH值为5.5～6.5，培养温度为40℃～45℃，通风量为0.2～1.5vvm，搅拌转速为100～200r/min，发酵时间为15～24h。
4.按照权利要求1所述的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于上述离心分离是指在4000～6000r/min，4～6℃下离心10～15分钟。
5.按照权利要求1所述的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于上述菌体破碎采用超声波破碎，超声波工作频率20～25KHz，功率为500W～800W，间歇时间为30s～35s，破碎时间为10～15min。
6.按照权利要求1所述的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于所述生物转化生产过程为：首先配制质量百分比浓度为15%～20%的L-谷氨酸的水溶液，然后加入其质量的30%～40%的硫酸铵，用碱调整pH值为5.8～6.0，最后加入L-谷氨酸质量的10%～15%的嗜热乳杆菌全细胞，在温度45℃～50℃，搅拌转速200～300r/min的转化条件下进行生物转化。
7.按照权利要求1或6所述的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征是：在生物转化过程中流加氨水。
8.按照权利要求7所述的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征是：在生物转化反应开始5h后，根据pH值的变化情况流加一定量的氨水，使反应体系的pH值保持在5.8～6.0。
9.按照权利要求7所述的利用嗜热乳杆菌从L-谷氨酸生物转化法生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于在生物转化过程中，当转化体系连续3小时pH值的变化小于0.1时，反应终止。
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