CN109161496A - 鼠李糖乳杆菌高密度菌液及其包埋菌粉的制备方法 - Google Patents

鼠李糖乳杆菌高密度菌液及其包埋菌粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

鼠李糖乳杆菌高密度菌液及其包埋菌粉的制备方法，利用酵母细胞破碎液作为激活剂制备鼠李糖乳杆菌高密度菌液及包埋菌粉，主要包括活化与发酵两大步骤，鼠李糖乳杆菌保藏编号为CGMCC No.15557，保藏日期为2018年04月08号。通过本方法制备的鼠李糖乳杆菌高密度菌液及包埋菌粉可以用于生产以制备鼠李糖乳杆菌功能为核心的食品添加剂、饲料添加剂，或食品和饲料的发酵剂。本制备方法简单，不改变现有发酵工序，容易操作；成本低，所用酵母菌粉相比其他水解微生物营养制剂成本低约3%左右；效率高，营养利用率及能量转换比例高；产物活性高，本株鼠李糖乳杆菌经本法发酵后，应用饲料生产中，能够起到部分替代抗生素的作用。

Description

鼠李糖乳杆菌高密度菌液及其包埋菌粉的制备方法
技术领域
本发明属于有益菌筛选技术领域，主要涉及一种鼠李糖乳杆菌高密度菌液及其包埋菌粉的制备方法。
背景技术
益生菌（probiotic）该词最早是起源于希腊语，是由Lilly和Sti11We11在1965年科学杂志上提出，“由一种微生物产生促进另一种微生物生长的物质” [15]。随着科学经济的迅猛发展和对益生菌知识的不断丰富，人们对益生菌又有了进一步的认知。1989年英国的Fuller R将其定义为：益生菌是额外补充的活性微生物，能改善肠道菌群的动态平衡，对宿主的健康产生良好的作用。此后在2001年，世界联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）定义：益生菌（probiotics）是一种活的微生物，当以适当剂量服用时能够对宿主（人或动物）产生有益健康的作用。目前人们对益生菌公认的定义是：益生菌指的是一类对宿主有益的微生物，能够定值依附于人体肠道内，维持肠道菌群的动态平衡，起到健康的功效。益生菌能够促进人体对营养物质的消化吸收，可以预防和治疗人体腹泻，此外益生菌还可以缓解乳糖不耐症等多种功效。因此，如今越来越多的人开始选择服用益生菌产品，益生菌及其产品受到前所未有的关注。目前我们将已知的益生菌分为以下三大类，第一是乳杆菌类，第二是双歧杆菌类，第三种是革兰式阳性球菌类。在2010年，国家卫生部办公厅组织制定了《可用于食品的菌种名单》，其中包括21种益生菌。其中双歧杆菌属占6种，包括长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）两歧双歧杆菌（B.bifidum）等；乳杆菌属14种，包括副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、干酪乳杆菌（L.casei）、植物乳杆菌（L.plantarum）、鼠李糖杆菌（L.rhamnosus）、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）等；此外还有嗜热链球菌（S.thermopHilus）。
发明内容
本发明的目的是，在于提供一种利用酵母细胞破碎液作为激活剂制备鼠李糖乳杆菌1.0320高密度菌液及包埋菌粉的方法。已发现的鼠李糖乳杆菌菌株，在生产过程中，营养要求苛刻，难以达到一定的密度，进而体现功能。鼠李糖乳杆菌1.0320为本实验室从传统马奶酒中获得一株具有高产细菌素、耐胆酸盐、高肠道粘附能力的鼠李糖乳杆菌。该菌所产细菌素对金黄色葡萄球菌(StapHylococcus aureus) ATCC25923、大肠杆菌(Escherichiacoli) ATCC25922均具有显著抑菌效果。
本发明所提供的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus) 1.0320株，是从传统马奶酒样品中分离出来的一株革兰氏阳性菌。该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No .15557，保藏日期为2018年04月08号。
一种鼠李糖乳杆菌高密度菌液的制备方法，其特征在于所述的鼠李糖乳杆菌是保藏编号为CGMCC No .15557的菌种，所述的制备方法包括如下步骤：
1）活化：从-80℃保存的鼠李糖乳杆菌的1.0320的菌种中挑取一部分并划线于固体MRS培养基中，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于MRS基础液体培养基中活化传代两次，培养12-16 h菌液出现浑浊，取0.1ml的菌液在MRS固体培养基的平板上三区划线，置于37 ℃过夜培养，挑取单菌落革兰氏染色进行镜检，无杂菌污染，为合格；
2）发酵：发酵液配比为1%酵母粉，2%乳糖，4.5%~5%脱盐乳清粉，葡萄糖10%，硫酸锰0.01%，硫酸镁0.01%，用氨水调整pH为6.6；接种量2%，培养12 h后，用氨水调整pH至6.3，加入1.2% 酵母细胞破碎液，继续发酵4-12 h，测定菌数1012 CFU/mL以上，使用蒸汽灭菌的纳滤陶瓷膜过滤去除45%水分，得高密度鼠李糖乳杆菌菌液。
所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的纳滤的技术条件是：温度35℃，压力2.0 Mpa。
所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的酵母细胞破碎液采用以下方法制备：使用啤酒酵母发酵后，经生理盐水清洗，离心获得106 CFU/mL以上浓度的酵母细胞，超声破碎，55℃灭菌25分钟后备用。
一种利用上述鼠李糖乳杆菌高密度菌液制备包埋菌粉的方法，其特征在于：将以上步骤获得的高密度鼠李糖乳杆菌培养液，根据质量比依次加入1.5%海藻多糖，搅拌30分钟，加入0.2%植物油搅拌40分钟，加入β环装糊精3%，搅拌60分钟；所得浓缩液高压低温喷粉，获得包埋粉，其中，低温喷雾条件为：进风温度110℃，出风温度45℃。
本发明具有以下优点：
本制备方法简单，不改变现有发酵工序，容易操作；成本低，所用酵母菌粉相比其他水解微生物营养制剂成本低约3%左右；效率高，营养利用率及能量转换比例高；产物活性高，本株鼠李糖乳杆菌经本法发酵后，应用饲料生产中，能够起到部分替代抗生素的作用。
附图说明
图1是该乳杆菌生长过程中pH的变化。
图2是该乳杆菌对Caco-2细胞的黏附作用。
具体实施方式
下面结合附图来对具体实施例来进一步描述。
实施实例1 高密度菌液的生产
本方法制备的高密度菌液，可以直接用作食品或饲料的发酵剂。用于食品发酵，能够延长食品的保质期，避免杂菌污染；用于饲料发酵，能够减少饲料中抗生素的使用。
1）活化：从-80℃保存的鼠李糖乳杆菌的的菌种中挑取一部分并划线于固体MRS培养基中，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于MRS基础液体培养基中活化传代两次，培养12-16 h菌液出现浑浊，取0.1ml的菌液在MRS固体培养基的平板上三区划线，置于37 ℃过夜培养，挑取单菌落革兰氏染色进行镜检，无杂菌污染，菌体形态丰满，为合格；
2）发酵：发酵液配比为1%乳糖， 5%脱盐乳清粉，葡萄糖10%，硫酸锰0.01%，硫酸镁0.01%，用氨水调整pH为6.6；接种量2%，培养12 h后，用氨水调整pH至6.3，加入1.2% 酵母细胞破碎液，继续发酵8 h，测定菌数1012 CFU/mL以上，使用蒸汽灭菌的纳滤陶瓷膜过滤去除45%水分，得高密度鼠李糖乳杆菌菌液。
纳滤的技术条件是：温度35℃，压力2.0 Mpa。
酵母细胞破碎液采用以下方法制备：使用啤酒酵母发酵后，经生理盐水清洗，3500rmp/min以上离心获得106 CFU/mL以上浓度的酵母细胞。在55℃，25KHz下，超声破碎10min。在经55℃灭菌25分钟。
2）保存和应用：经发酵获得的高密度菌液，按质量比1.5%加入海藻多糖，搅拌均匀后，-80℃快速冷冻保存。
所得的液体发酵剂或均属可达测定菌数1012 CFU/mL以上，高于其他鼠李糖乳杆菌发酵剂浓度，发酵活力高，发酵过程中耐酸、耐胆盐，具有良好的肠道粘附能力，细菌素产量超过其他细菌15%以上。可以用于生产不添加防腐剂的食品，也可以用于生产目的在于减少抗生素使用的饲料。
实施实例2 高密度菌粉的生产
实例1生产的高密度菌液，可以进一步加工成高密度菌粉，具体方法如下：
将从实例1获得的高密度鼠李糖乳杆菌培养液，根据质量比依次加入1.5%海藻多糖，搅拌30分钟，加入0.2%植物油搅拌40分钟，加入β环装糊精3%，搅拌60分钟；所得浓缩液高压低温喷粉，获得包埋粉，其中，低温喷雾条件为：进风温度110℃，出风温度45℃。
该乳杆菌生长过程中pH的变化如图1；该乳杆菌对Caco-2细胞的黏附作用如图2。

Claims (4)

1.一种鼠李糖乳杆菌高密度菌液的制备方法，其特征在于所述的鼠李糖乳杆菌是保藏编号为CGMCC No .15557的菌种，所述的制备方法包括如下步骤：
1）活化：从-80℃保存的鼠李糖乳杆菌的1.0320的菌种中挑取一部分并划线于固体MRS培养基中，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于MRS基础液体培养基中活化传代两次，培养12-16 h菌液出现浑浊，取0.1ml的菌液在MRS固体培养基的平板上三区划线，置于37 ℃过夜培养，挑取单菌落革兰氏染色进行镜检，无杂菌污染，为合格；
2）发酵：发酵液配比为1%酵母粉，2%乳糖，4.5%~5%脱盐乳清粉，葡萄糖10%，硫酸锰0.01%，硫酸镁0.01%，用氨水调整pH为6.6；接种量2%，培养12 h后，用氨水调整pH至6.3，加入1.2% 酵母细胞破碎液，继续发酵4-12 h，测定菌数1012 CFU/mL以上，使用蒸汽灭菌的纳滤陶瓷膜过滤去除45%水分，得高密度鼠李糖乳杆菌菌液。
2.如权利要求1 所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的纳滤的技术条件是：温度35℃，压力2.0 Mpa。
3.如权利要求1 所述的方法，其特征在于步骤2)中所述的酵母细胞破碎液采用以下方法制备：使用啤酒酵母发酵后，经生理盐水清洗，离心获得106 CFU/mL以上浓度的酵母细胞，超声破碎，55℃灭菌15分钟后备用。
4.一种利用鼠李糖乳杆菌高密度菌液制备包埋菌粉的方法，其特征在于：将从权利要求1获得的高密度鼠李糖乳杆菌培养液，根据质量比依次加入1.5%海藻多糖，搅拌30分钟，加入0.2%植物油搅拌40分钟，加入β环装糊精3%，搅拌60分钟；所得浓缩液高压低温喷粉，获得包埋粉，其中，低温喷雾条件为：进风温度110℃，出风温度45℃。
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