CN111826324A - 一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法 - Google Patents

一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法，将鼠李糖乳杆菌发酵培养液通过菌体浓缩富集再与保护剂混合均匀后，通过喷雾干燥制备得到菌粉制剂。其中发酵液鼠李糖乳杆菌活菌数可达1.0*1010CFU/mL以上，喷雾干燥所得菌粉活菌数达1.0*1011CFU/g以上。本发明的制备方法解决了高成本、低活菌、保质期短等问题，用海藻糖与海藻酸钠做保护剂，可以把菌粉与外界环境隔绝，同时很好的解决了因脱脂奶粉暴露空气中，吸潮、发粘等现象，且菌液干燥的过程即为菌体包被过程。制备的鼠李糖乳杆菌菌粉制剂，具有高活菌数、能耐胃酸、胆盐，且能有效抑制有害菌的生长，改善肠道微生态环境。

Description

一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法
技术领域
本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法，属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种鼠李糖乳杆菌液体发酵到菌粉的制备方法。
背景技术
鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，为革兰氏阳性菌，兼性厌氧菌，属于乳杆菌属，其在肠道黏着率高，定植能力强，并具有高效降胆固醇，促进细胞分裂，可起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿、提高机体免疫力及抗癌等重要的生理保健功能。并能抑制多种病原细菌，促进双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长和作用。
目前对鼠李糖乳杆菌的研究、报道主要集中在其功能特性、应用及其多种益生菌混合发酵上。如治疗胃肠道疾病(CN201610937698.9、)，治疗过敏性疾病(CN201910686679.7、CN201610143184.6)，生产乳酸、胞外粘多糖(CN200710176057.7、CN200510015062.0)等相关报道。但在鼠李糖乳杆菌菌体制备与生产工艺上却极少有相关报道，所以本发明在鼠李糖乳杆菌液体发酵的基础上，提供一种高活性、高活菌数的鼠李糖乳杆菌制备方法。
海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，具有耐酸、耐热、抗冷冻、抗辐射、防止蛋白质变性等功能。当生物细胞处于干燥、高温与高压等恶劣环境，海藻糖对生物和生物大分子有良好的非特异性保护作用。科学家们发现，沙漠植物卷叶柏在干旱时几近枯死，遇水后却又可以奇迹般复活，高山植物复活草能够耐过冰雪严寒，一些昆虫在高寒、高温和干燥失水等条件下不冻结、不干死，就是它们体内的海藻糖创造的生命奇迹。再者本发明采用海藻酸钠为包被保护材料，它具有浓缩溶液、形成凝胶和成膜的能力，通过与菌液混合均匀后，通过喷雾干燥，形成微小的球囊，起到包被保护菌体作用。同时很好的解决了因用脱脂奶粉而暴露空气中，吸潮、发粘等现象。菌液喷雾干燥过程即为菌体包被过程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法，该生产工艺很好地解决了高成本、低活菌、保质期短等问题；用海藻糖与海藻酸钠做保护剂，海藻糖起到生命之糖的作用，对菌体起到保护作用，海藻酸钠起到包被作用，可以把菌粉与外界环境隔绝，同时很好的解决了因脱脂奶粉暴露空气中，吸潮、发粘等现象，且菌液干燥的过程即为菌体包被过程。
本发明提供一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法，所述的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，分离自健康海参盲肠，由鼠李糖乳杆菌液体发酵扩培后通过浓缩富集，所得菌体浓缩液再与保护剂混合均匀后通过喷雾干燥制备得到干粉制剂。
具体地，本发明的一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法技术方案如下：
第一步，菌种活化与种子液制备
从-80℃冰箱取出2mL菌种冻存管，接种于装液量900mL/1L的液体MRS培养基，于恒温摇床180rpm/min，30-40℃厌氧培养18-24h。
第二步，发酵液制备
将上述鼠李糖乳杆菌种子液按5％接种量接种进入一级发酵液，装液量为90L/100L，30-40℃，180rpm/min，厌氧条件下培养18-24h。后将一级发酵液移种进入二级发酵液，装液量为1000L/1500L，30-40℃，180rpm/min，厌氧条件下培养18-36h。
所述一级发酵液与二级发酵液培养基配置如下：葡萄糖30-50g/L、酿酒酵母提取物10-20g/L、磷酸氢二钾2-5g/L、硫酸锰0.05-0.1g/L、氯化铵2-5g/L、碳酸钙5-10g/L，培养基于121℃灭菌20min，通水冷却至30-40℃备用。
第三步，发酵液浓缩、包被
上述发酵液经10nm规格陶瓷膜过滤设备处理，得到菌体浓缩液，其固含量为10-30％；再按菌体浓缩液所得重量，加入5-10％脱脂奶粉、1-5％海藻糖作为保护剂及0.2-0.5％海藻酸钠作为包被剂，溶解、混合均匀。
第四步，喷雾干燥
采用离心式喷雾干燥设备，条件设置为进风温度110-120℃，出风温度60-80℃，该条件下得到的干粉即为菌粉。
其中，第一步所述菌种分离自海参肠道，选取健康的海参解剖，无菌取其肠道，纵向剪开肠道，使用磷酸盐缓冲物冲洗肠道内部数次，去除肠道中粪便污水等内容物；用无菌剪刀将清洗的肠道剪碎，加入少量无菌生理盐水震荡混匀，得到菌液原液，将原液10倍梯度稀释至10-5，分别涂布于MRS培养基上，30℃厌氧培养3d，挑取单菌落，划线纯化，直至得到纯的单菌落。
第二步所述发酵培养后鼠李糖乳杆菌活菌数可达1.0*1010CFU/mL以上。
第四步所得菌粉活菌数1.0*1011CFU/g以上，水分在5-9％。
采用上述方案后，本发明的技术方案中至少有以下优点：
1.在本发明中采用发酵培养基成本低，约370元/吨左右，发酵制备的活菌数高，大于100亿CFU/mL。
2.采用陶瓷膜过滤富集菌体，去除大部分水分，达到提高菌体浓度及缩短干燥时间，节约时间及能耗成本。
3.浓缩菌液在喷雾干燥设备干燥过程即为菌体包被过程，从而减少再包被步骤。
4.喷雾干燥前采用海藻糖作为保护剂，海藻糖起到生命之糖的作用，对菌体起到保护作用，以海藻酸钠作为包被剂，海藻酸钠起到包被作用，保证了菌体在喷雾过程中能耐受高温，提高存活率。喷雾干燥后形成微胶囊，使菌体与外界环境空气隔绝，增加菌粉稳定性及保质期。同时很好的解决了脱脂奶粉暴露空气中，吸潮、发粘等现象。
5.制备的鼠李糖乳杆菌菌粉制剂，具有高活菌数、能耐胃酸、胆盐，且能有效抑制有害菌的生长，改善肠道微生态环境。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1：鼠李糖乳杆菌海参肠道分离、鉴定
选取健康的海参解剖，无菌取其肠道，纵向剪开肠道，使用磷酸盐缓冲物冲洗肠道内部数次，去除肠道中粪便污水等内容物；用无菌剪刀将清洗的肠道剪碎，加入少量无菌生理盐水震荡混匀，得到菌液原液，将原液10倍梯度稀释至10-5，分别涂布于MRS培养基上，30℃厌氧培养3d，挑取单菌落，划线纯化，直至得到纯的单菌落。经过16S rRNA测序鉴定与菌株生理生化试验鉴定，其中一株为鼠李糖乳杆菌。
实施例2：鼠李糖乳杆菌不同培养温度的生长情况
以MRS液体培养基作为发酵液，以对数生长期的鼠李糖乳杆菌发酵液按2％接种量接入装液量400mL/500mL的MRS液体培养基，分别在25℃、30℃、35℃、40℃与45℃下静置培养24h，每隔8h取样检测菌液OD600nm，检测结果如下表1所示。
表1不同温度培养鼠李糖乳杆菌生长情况(OD600nm值)
Figure BDA0002618781500000031
由表1可知，25-40℃之间鼠李糖乳杆菌都能生长，但其最适生长温度在35-40℃之间，当温度达到45℃时基本处于生长缓慢或停滞生长阶段。
实施例3：鼠李糖乳杆菌抑菌试验
抑菌试验采用管碟法，用鼠李糖乳杆菌发酵培养48h，菌液通过10000r/min，离心10min，取上清液，放置4℃冰箱备用。取1mL病原菌悬液加入50℃100mL MRS琼脂培养基中摇匀(菌终浓为105CFU·mL-1)，倒入培养皿中(厚度约为3mm)，待冷却凝固后将牛津杯置于平板中，往牛津杯中各加入0.20mL上清液，置于37℃下培养24h，其中弧菌采用30℃培养，观察有无抑菌圈产生，并用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。结果如下表2所示。
表2鼠李糖乳杆菌对病原菌抑制结果表(24h)
Figure BDA0002618781500000041
抑菌圈直径(mm)：不敏感：0，低敏感：<10，中敏感：10-14，高敏感：15-20，极敏感：>20
由表2数据可知，鼠李糖乳杆菌发酵上清液对上述9种常见病原菌具有良好的抑菌效果，且对枯草芽孢杆菌也有一定的抑制效果。
实施例4：鼠李糖乳杆菌药物敏感性试验
采用药敏纸片琼脂扩散法，吸取1mL活菌数约为108CFU·mL-1的菌液，加入15mLMRS琼脂培养基中(50℃)，混合均匀后倾注倒入灭菌培养皿中，冷却凝固后贴上药敏纸片，静置15min后，将平皿置于30℃恒温培养箱中厌氧培养24h，观察并测量抑菌圈直径。结果如下表3所示。
表3鼠李糖乳杆菌XX-11对10种药敏纸片的敏感性
Figure BDA0002618781500000042
由表3可知，鼠李糖乳杆菌对痢特灵、复方新诺明与诺氟沙星有一定程度的耐药性，而对青霉素、氯霉素、庆大霉素、四环素、链霉素与红霉素等7种药物表现敏感。
实施例5：鼠李糖乳杆菌液体发酵
菌种活化与种子液制备：从-80℃冰箱取出冻存管，划线接种试管MRS斜面培养基上，36℃厌氧培养24h。活化后的鼠李糖乳杆菌接种于MRS种子液培养基，装液量900mL/1L，36℃，180rpm/min条件下培养24h。
发酵液制备：将上述鼠李糖乳杆菌种子液按5％接种量接种进入一级发酵液，装液量为90L/100L，36℃，180rpm/min，厌氧条件下培养18h。后将一级发酵液移种进入二级发酵液，装液量为1000L/1500L，36℃，180rpm/min，厌氧条件下培养24h。发酵培养后鼠李糖乳杆菌活菌数检测结果为：1.6*1010CFU/mL。
实施例5中所述一级发酵液与二级发酵液培养基配置如下：葡萄糖40g/L、酿酒酵母提取物20g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铵2g/L、碳酸钙10g/L，培养基于121℃灭菌20min，通水冷却至36℃备用。
实施例6：喷雾干燥制备菌粉
实施例5中发酵液经陶瓷膜设备浓缩得到固含量20％的浓缩发酵液，再按其质量的百分比，加入5％脱脂奶粉、1％海藻糖与0.2％海藻酸钠，经过充分搅拌，混合均匀。喷雾操作条件设置为进风温度110℃，出风温度80℃，该条件下得到的干粉即为菌粉。经检测所得菌粉活菌数2.8*1011CFU/g，水分8％。
实施例7：喷雾干燥制备菌粉
实施例5中发酵液经陶瓷膜设备浓缩得到固含量20％的浓缩发酵液，再按其质量的百分比，加入10％脱脂奶粉、5％海藻糖与0.5％海藻酸钠，经过充分搅拌，混合均匀。喷雾操作条件设置为进风温度110℃，出风温度60℃，该条件下得到的干粉即为菌粉。经检测所得菌粉活菌数4.2*1011CFU/g，水分8％。
实施例8：喷雾干燥制备菌粉
浓缩发酵液与保护剂混合步骤及添加量同实施例7。喷雾操作条件设置为进风温度120℃，出风温度80℃，该条件下得到的干粉即为菌粉。经检测所得菌粉活菌数1.5*1011CFU/g，水分6.8％。
对比例1：不包被喷雾干燥
在实施例5中发酵液经陶瓷膜设备浓缩得到固含量20％的浓缩发酵液，不添加任何保护剂直接喷雾干燥，喷雾操作条件设置为进风温度110℃，出风温度80℃，该条件下得到的干粉即为菌粉。经检测所得菌粉活菌数0.5*1011CFU/g，水分6％。
实施例9：鼠李糖乳杆菌菌粉耐酸耐胆盐试验
耐酸性试验：采用模拟人工胃酸方法检测凝结芽孢杆菌干粉的耐酸性能，人工胃酸配置方法：0.2g氯化钠与0.35g胃蛋白酶溶解于适量蒸馏水中，用1mol/L盐酸调节pH值为2.0，用100mL容量瓶定容至刻度。
试验样品采用实施例6、实施例7、实施例8得到的菌粉与对比例1得到的菌粉按1％的添加量加入模拟人工胃酸的无菌三角瓶中，37℃恒温水浴1h，后检测每组样品活菌数。以0h活菌数作为对照，计算存活率。
耐胆盐试验：试验样品采用实施例6、实施例7、实施例8得到的菌粉与对比例1得到的菌粉按1％的添加量加入含有0.7％猪胆盐浓度的无菌水中，37℃恒温水浴2h，后检测每组样品活菌数。以0h活菌数作为对照，计算存活率。
表4：鼠李糖乳杆菌菌粉耐酸耐胆盐能力检测数据(存活率％)
Figure BDA0002618781500000061
人体胃液通常pH值维持在2.5-3.5之间，通常食物在胃内停留时间为2-4h。而人体小肠中胆汁盐含量在0.03％-0.3％范围内波动，食物在小肠中停留时间为1-4h。由表4可知实施例6-8组有经过包被处理的菌粉对pH 2.0胃酸及0.7％胆盐的耐受能力比没有包被的菌粉更强。其中pH2.0胃酸下处理2h存活率在76％以上，0.7％猪胆盐下处理2h存活率在98％以上，具体如表4所示。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (4)

1.一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于：
第一步，菌种活化与种子液制备
从-80℃冰箱取出2mL菌种冻存管，接种于装液量900mL/1L的液体MRS培养基，于恒温摇床180rpm/min，30-40℃厌氧培养18-24h；
第二步，发酵液制备
将上述鼠李糖乳杆菌种子液按5％接种量接种进入一级发酵液，装液量为90L/100L，30-40℃，180rpm/min，厌氧条件下培养18-24h；后将一级发酵液移种进入二级发酵液，装液量为1000L/1500L，30-40℃，180rpm/min，厌氧条件下培养18-36h；
所述一级发酵液与二级发酵液培养基配置如下：葡萄糖30-50g/L、酿酒酵母提取物10-20g/L、磷酸氢二钾2-5g/L、硫酸锰0.05-0.1g/L、氯化铵2-5g/L、碳酸钙5-10g/L，培养基于121℃灭菌20min，通水冷却至30-40℃备用；
第三步，发酵液浓缩、包被
上述发酵液经10nm规格陶瓷膜过滤设备处理，得到菌体浓缩液，其固含量为10-30％；再按菌体浓缩液所得重量，加入5-10％脱脂奶粉、1-5％海藻糖作为保护剂及0.2-0.5％海藻酸钠作为包被剂，溶解、混合均匀；
第四步，喷雾干燥
采用离心式喷雾干燥设备，条件设置为进风温度110-120℃，出风温度60-80℃，该条件下得到的干粉即为菌粉。
2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，第一步所述菌种分离自健康海参肠道，选取健康的海参解剖，无菌取其肠道，纵向剪开肠道，使用磷酸盐缓冲物冲洗肠道内部数次，去除肠道中粪便污水等内容物；用无菌剪刀将清洗的肠道剪碎，加入少量无菌生理盐水震荡混匀，得到菌液原液，将原液10倍梯度稀释至10-5，分别涂布于MRS培养基上，30℃厌氧培养3d，挑取单菌落，划线纯化，直至得到纯的单菌落。
3.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，第二步所述发酵培养后鼠李糖乳杆菌活菌数可达1.0*1010CFU/mL以上。
4.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，第四步所得菌粉活菌数1.0*1011CFU/g以上，水分在5-9％。
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