CN110669690B - 一种表达群体感应信号分子ai-2的植物乳杆菌菌株及其应用 - Google Patents
一种表达群体感应信号分子ai-2的植物乳杆菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种表达群体感应信号分子AI‑2的植物乳杆菌菌株及其应用,属于微生物技术领域。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LPChen,保藏编号为CCTCC NO:M 2019670。本发明还提供了包含所述菌株LPChen的益生菌制剂。基于所述菌株LPChen具有较强的空肠弯曲杆菌拮抗能力,所述菌株LPChen或所述益生菌制剂在制备防治空肠弯曲杆菌感染食品或者食品添加剂中的应用。同时所述菌株LPChen具有较强的耐酸性,制备药物适合制成口服给药剂型,胃酸不会影响药物活性。菌株LPChen的抑菌能力推测与AI‑2表达和生物膜形成有关,具有作为肠道益生菌应用的潜能。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种表达群体感应信号分子AI-2的植物乳杆菌菌株及其应用。
背景技术
乳酸菌是一类能够利用糖发酵产生乳酸菌的细菌。目前研究表明,益生乳酸菌具有很好的拮抗病原菌,调节肠道菌群平衡,提高免疫能力等功能,广泛的应用于食品、种植业、养殖业、医学等行业中,被公认为是安全的食品级微生物。
群体感应现象也称为微生物群体感应(Quorum sensing,简称QS)是细菌进行种内或种间信息交流的一种信号转导机制。近几年的研究发现,QS系统中的二类信号分子(Autoinducer-2,简称AI-2)在微生物细胞间交流中起到关键作用,广泛存在于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中。AI-2是一种呋喃酮类化合物,为对称的双五圆环结构的呋喃酮酰硼酸二酯,它是甲硫氨酸循环通路--甲基循环的一个副产品。Luxs/AI-2QS系统介导乳酸菌发挥益生特性已有一定研究。Buck等得出Luxs/AI-2QS系统在乳酸菌粘附肠表皮定植肠道过程中具有重要作用。据报道,一些G+细菌能够通过QS系统激活乳酸菌特异信号途径,增加细菌素(一种具有抑菌作用的多肽)产量,从而增加对同源种或近似种才有拮抗作用。
空肠弯曲杆菌(Campylobacter.jejuni)属于革兰氏阴性菌,是人畜共患菌,引起人类的腹痛、腹泻、血便或果酱样便;头痛、发热,甚至可进入血液,最为严重的将引起自身免疫性疾病—格林-巴利综合征,且感染率越来越高。因C.jejuni污染而造成食源性疾病已是食品安全中突出的问题。目前,防治C.jejuni的感染的药物最主要是抗生素,但引起不少问题,如菌株耐药性产生、抗生素残留造成重感染、破坏人的免疫系统和肠道微生物平衡等问题。因此,探索利用益生菌防治C.jejuni的感染是一个热门话题。
现有技术中已经有关于乳酸菌能够产生抗菌物质抑制C.jejuni的生长的报道,其抑制机理为粘附性高的乳酸菌可以通过空间位阻效应或者产生抑制物质来抑制C.jejuni对宿主细胞的粘附,减轻C.jejuni对肠道上皮的感染症状(CN107513553A)。公开号为EP3081636A1的欧洲专利还公开了唾液乳杆菌VH02和唾液乳杆菌VHO7产生抗弯曲杆菌化合物,其可以在冷却条件下以及在最佳生长条件下有效地降低或杀死空肠弯曲杆菌。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种新的对空肠弯曲杆菌具有较强拮抗能力的乳酸菌-表达群体感应信号分子AI-2的植物乳杆菌菌株LPChen。
本发明的目的还在于提供所述植物乳杆菌菌株LPChen作为肠道益生菌在制备防治空肠弯曲杆菌食品或者食品添加剂的应用。
本发明提供了一种表达群体感应信号分子AI-2的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株LPChen,所述菌株LPChen的保藏编号为CCTCC NO:M2019670。
本发明提供了一种用于防治空肠弯曲杆菌感染的益生菌制剂,包括所述植物乳杆菌菌株LPChen。
优选的,所述植物乳杆菌菌株LPChen的活菌浓度为108~109CFU/mL。本发明提供了所述的植物乳杆菌菌株LPChen或所述益生菌制剂在食品或者食品添加剂的应用。
本发明提供了所述的植物乳杆菌菌株LPChen或所述益生菌制剂在生物膜制备中的应用。
本发明提供了所述的植物乳杆菌菌株LPChen或所述益生菌制剂在抑制空肠弯曲杆菌中的应用。
本发明提供了一种表达群体感应信号分子AI-2的植物乳杆菌菌株LPChen,所述菌株LPChen的保藏编号为CCTCC NO:M 2019670。抑菌实验结果表明,所述菌株LPChen具有较好的拮抗空肠弯曲杆菌的能力,比抗生素诺氟沙星的抗菌能力稍强;经检测群体感应信号分子AI-2发现,所述菌株LPChen具有高产信号分子AI-2的特性。
同时通过乳酸菌生物膜形成能力测定实验表明,本发明提供的所述菌株LPChen具有很好的生物膜形成能力,并能在人工胃液pH值为2.0中存活,具有较强的耐酸性能。
生物材料保藏说明
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株,于2019年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心,单位简称为CCTCC,地址为中国武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M2019670,菌株编号为LPChen。
附图说明
图1为V.harveyi BB170的形态学图片,其中图1-A为V.harveyiBB170的菌落形态,图1-B为与V.harveyi BB170的细胞形态,×1000;
图2为不同种类乳酸菌的细胞形态;
图3为不同种类乳酸菌的菌落形态;
图4为基于菌株LP-CHEN及其近缘种的16S rDNA基因构建的系统发育树;
图5为V.harveyi BB170生长曲线;
图6为V.harveyi BB170荧光强度曲线
图7为各乳酸菌培养18h上清液的相对荧光强度,不同字母表示差异性显著(p<0.05)。
具体实施方式
本发明提供了一种表达群体感应信号分子AI-2的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株LPChen,所述菌株LPChen的保藏编号为CCTCC NO:M2019670。菌株LPChen的单菌落形态为白色、表面光滑、湿润、表面光滑、边缘整齐、有光泽;细胞形态为短杆状。经过16S rDNA分子鉴定,发现LPChen菌株的16S rDNA序列同源性最高的为植物乳杆菌属(Lactobacillusplantarum),序列相似性高达100%。因此结合形态和分子鉴定,确定LPChen菌株分类属于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
在本发明中,所述植物乳杆菌菌株LPChen的培养方法,优选包括以下步骤:
植物乳杆菌LPChen按照2%(V·V-1)的接种量接种在液体MRS培养基中,在37℃下培养24h,连续培养三代后可用于后续实验。本发明对所述MRS培养基的配方没有特殊限制,采用本领域所熟知的MRS培养基配方即可。
本发明提供了一种用于防治空肠弯曲杆菌感染的益生菌制剂,包括所述植物乳杆菌菌株LPChen。所述植物乳杆菌菌株LPChen的活菌浓度优选为108~109CFU/mL,更优选为0.5×109CFU/mL。所述益生菌制剂还包括辅料。本发明对所述辅料的种类没有特殊限制,采用本领域所熟知的辅料种类即可。本发明对所述益生菌制剂的制备方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的益生菌制剂的制备方法即可。
基于植物乳杆菌菌株LPChen对空肠弯曲杆菌具有较强的拮抗作用,本发明提供了所述的植物乳杆菌菌株LPChen或所述益生菌制剂在食品或者食品添加剂的应用。
所述植物乳杆菌LPChen在食品或者食品添加剂的活菌浓度优选为108~109CFU/mL,更优选为0.5×109CFU/mL。
基于所述植物乳杆菌菌株LPChen具有较好的生物膜形成能力,本发明提供了所述的植物乳杆菌菌株LPChen或所述益生菌制剂在生物膜制备中应用。
在本发明中,采用植物乳杆菌菌株LPChen制备生物膜的方法优选包括以下步骤:
1)以1%接种量将植物乳杆菌菌株LPChen接种至MRS培养基中,置于37℃恒温培养箱培养至24h,去除发酵液,用生理盐水冲洗若干次,晾干;
2)将晾干后的植物乳杆菌菌株LPChen用质量浓度1%的结晶紫染液染色15min,倒出染液,重复冲洗直至去除冲洗液无色,晾干;
3)向晾干后的植物乳杆菌菌株LPChen加入脱色剂脱水,测定其OD600值。以OD600值表示生物膜的生成量。
植物乳杆菌菌株LPChen具有较强的拮抗空肠弯曲杆菌的能力,且有很好的生物膜形成能力和高表达AI-2,并能在人工胃液2.0中存活。推测植物乳杆菌菌株LPChen的抑菌能力与AI-2表达有关,且与生物膜形成有关,具有作为益生菌应用的潜能。
本发明提供了所述的植物乳杆菌菌株LPChen或所述益生菌制剂在抑制空肠弯曲杆菌中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种表达群体感应信号分子AI-2的植物乳杆菌菌株及其应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
试剂种类海生培养基、酸水解酪蛋白(不含维生素)、MgSO4·7H2O、NaCl、KOH、磷酸氢二钾、丙三醇、L-精氨酸、牛肉膏、磷酸二氢钾、胰蛋白胨、硫酸镁、琼脂条、硫酸铜、葡萄糖,试剂均为分析纯。
主要仪器与设备的来源如下:
实施例1
菌种的活化与保藏
本发明以表1中不同种类的乳酸菌为候选菌种进行活化培养,用于后续筛选。
表1菌株名称、种属与来源
(1)乳酸菌的活化与保藏:乳酸菌按照2%(V·V-1)的接种量,接种在经过高温高压灭菌后的液体MRS培养基中,在37℃恒温培养箱中培养三代,将第四代生长到对数期的培养基与50%甘油分别取0.5mL,混合装入1.5mL EP管中,置于-20℃冰箱进行冷冻保藏。每次使用前按2%(V·V-1)的接种量,接种于新鲜MRS培养基中,每代于37℃恒温培养箱中培养24h,连续培养三代后可用于后续实验。
(2)哈氏弧菌的活化与保藏:将V.harveyiBB170按2%(V·V-1)的接种量,接种在无菌液体海生培养基中,于30℃,125r·min-1,振荡培养三代,将第四代生长到对数期的培养基与50%甘油分别取0.5mL,混合装入1.5mLEP管中,置于-20℃冰箱进行冷冻保藏。每次使用前,按2%(V·V-1)的接种量,接种于新鲜海生培养基中,每代于30℃振荡培养24h,连续培养三代后可用于实验。
将乳酸菌和哈氏弧菌在光学显微镜下细胞形态观察和菌落形态观察,并拍照记录。
菌落形态与细胞形态观察结果
1、哈维氏弧菌菌落及细胞形态
由图1-A可知,哈维氏弧菌(V.harveyi BB170)单菌落成乳白色、圆形、湿润、表面光滑、边缘整齐、有光泽。由图1-B所示,哈维氏弧菌为革兰氏阴性菌,杆状及弧状。
2、乳酸菌菌落及细胞形态
图2为乳酸菌的细胞形态图,10株乳酸菌为革兰氏阳性菌。其中R8、R4、R1、R10、R2这五株菌细胞形态为长杆状。R6、R9、LPChen这三株菌为短杆状。R7、R5这两株菌为球状。由图3可知,10株乳酸菌单菌落均为白色、表面光滑、湿润、表面光滑、边缘整齐、有光泽。
菌株LP-CHEN的16S rDNA基因经PCR扩增、纯化并测序(所用引物为本领域常规的植物乳杆菌的16S rDNA扩增用引物和扩增方法即可),其16S rDNA基因序列经BLAST后发现与乳杆菌属内菌种的同源性最高。利用MEGAX软件,同GenBank数据库中已知的乳杆菌属内模式菌株的16S rDNA基因序列进行序列比较,并以非同属的Escherchia coli模式菌株为外标,绘制出系统发育树,结果如图4所示。
由图4可知,菌株LP-CHEN同Lactobacillusplantarum模式株的亲缘关系最近,序列相似性100%,故鉴定LPChen为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
实施例2
哈氏弧菌菌体密度标准曲线的建立
(1)吸光值与时间之间的曲线绘制
从-20℃冰箱中取出V.harveyi BB170冻存液,按2%(V·V-1)的接种量,接种于液体海生培养基进行三代活化后,按2%(V·V-1)接种到液体AB培养基,分15个时间点取样(0~24h),利用分光光度计测定在600nm波长处的吸光值(OD600),得到吸光值与时间之间的曲线。
(2)荧光值与时间之间的曲线绘制
从-20℃冰箱中取出V.harveyi BB170冻存液,按2%(V·V-1)接种于液体海生培养基中进行三代活化后,按2%(V·V-1)接种到AB培养基,分15个时间点取样(0~24h),利用多功能酶标仪检测其荧光强度,绘制荧光值与时间之间的曲线。
(3)活菌数与时间之间的曲线绘制
从-20℃冰箱中取出V.harveyi BB170冻存液,按2%(V·V-1)接种于液体海生培养基中进行三代活化后,按2%(V·V-1)接种到AB培养基,分15个时间点取样(0~24h),取100μL涂布到海生琼脂培养基,确定其不同时间下的活菌数量。
哈氏弧菌菌体密度标准曲线的建立结果
1、V.harveyiBB170生长曲线
采用可见光分光光度计和平板菌落计数法,绘制V.harveyi BB170生长曲线。利用可见光分光光度计测量0~24h内V.harveyi BB170在600nm处吸光值可确定V.harveyiBB170菌体密度,通过平板菌落计数法可得到V.harveyi BB170每个时间点的活菌数,通过这两种方法得到V.harveyiBB170生长曲线。由图5可知,两条曲线随着时间的增加,呈上升趋势,表示V.harveyi BB170不断生长。0~4h内活菌数在3.3~5.15×106CFU/mL范围内、吸光值在0.09~0.16范围内均为最低水平、且趋于稳定,表示在这个时间内V.harveyi BB170生长为最低水平。4h后V.harveyi BB170活菌数、吸光值开始增加,V.harveyiBB170在4h后快速增长。
2、V.harveyi BB170荧光强度曲线
利用荧光酶标仪化学发光模式,测量V.harveyiBB170菌株0~24h内荧光值强度与其对应在600nm处吸光值,由图6可知,V.harveyi BB170荧光强度与吸光值两条曲线趋势基本一致,因此可以通过荧光强度判断V.harveyiBB170生长情况。1~4h荧光强度在5000~8000范围内,吸光值在0.6~0.8范围内,为V.harveyi BB170最低生长水平,是测定乳酸菌中信号分子AI-2的最佳范围。
实施例3
高产信号分子AI-2的乳酸菌筛选
(1)乳酸菌上清液的制备
乳酸菌培养三代后,按2%(V·V-1)接种于液体MRS培养基中,37℃恒温培养18h后,将培养液移入无菌离心管中,于4200r·min-1条件下离心20min,上清液用0.22μL灭菌滤菌器过滤至1mL冻存管中,得到各乳酸菌的无菌上清液;按相同方法得到30℃振荡培养12h后的V.harveyiBB170无菌上清液,作为阳性对照;以无菌的AB培养基和MRS培养基,作为阴性和介质对照。
(2)上清液中信号分子AI-2的生物学检测
V.harveyi BB170冻存液以2%(V·V-1),接种于无菌液体AB培养基,在125r·min-1,30℃条件下培养12h左右至培养基混浊,然后与AB培养基以1:100的比例稀释,充分混匀备用。分别将各乳酸菌、V.harveyiBB170、AB培养基和MRS培养基的无菌上清液作为待测样品、阳性、阴性和介质对照,按体积比1:100的比例与稀释过的V.harveyi BB170培养液充分混合,置于30℃条件下振摇培养。V.harveyiBB170菌体密度最低点,取200μL每孔至96孔黑色酶标板中,用多功能酶标仪检测其荧光强度值,信号分子AI-2的浓度用相对荧光强度表示。
(3)计算公式
高产信号分子AI-2乳酸菌的筛选结果
V.harveyiBB170培养3.5h的荧光强度作为基准点,比较上清液pH为6.5时其相对荧光强度,各乳酸菌培养18h上清液的相对荧光强度结果见图7。由图7得知,10株乳酸菌的相对荧光强度差异比较大,并且各不相同。其中,菌株R7、R10、R3(LPChen)相对荧光强度显著(p<0.05)高于阳性对照,菌株R9、R2、R5的相对荧光强度同阳性对照的相对荧光强度相当。
实施例4
乳酸菌抑菌能力测定
乳酸菌上清液通过牛津杯法进行抑菌实验:首先,将灭菌好的2%琼脂固体培养基倒入直径为90mm的平板中,每板15mL左右,待平板凝固后,将4个无菌牛津杯以相同间隔垂直放置在同一个平板上;然后,将含有活化好的空肠弯曲杆菌加入至尚未凝固的布氏固体培养基,且浓度约106CFU·mL-1,再将含有空肠弯曲杆菌的布氏培养基小心倒入上述平板中,凝固后,取200μL乳酸菌上清液加入到牛津杯孔中,用镊子夹出牛津杯,30℃过夜培养后(约15h),用千分尺测量抑菌圈直径,取两次垂直测量值的平均数。每个样品做3个平行平板,3次重复试验。
判定标准:抑菌圈直径4mm判定为不敏感;抑菌圈直径5~10mm判定为低度敏感;抑菌圈直径11~15mm判定为中度敏感;抑菌圈直径大于15mm判定为高度敏感。
乳酸菌拮抗空肠弯曲杆菌性质结果见表3。
表3乳酸菌拮抗C.jejuni能力
表3为LPChen菌株(植物乳杆菌)拮抗空肠弯曲杆菌杆菌的能力,由表3可知,LPChen菌株具有较强的抑制空肠弯曲杆菌杆菌生长方面的能力,明显比R8强,比R1菌株和抗生素诺氟沙星(2.8mg/mL)的抗菌能力稍强一点。
实施例5
乳酸菌生物膜形成能力测定
参考Bryan F等人生物膜检测实验方法,做了改进如下:先将新鲜的MRS培养基按每孔200μL加入至无菌96孔细胞培养板中,将活化到二代的LPChen菌株种子液,R1和R8菌株种子液分别稀释100倍,以1%接种量接种到每个孔中,置于37℃恒温培养箱培养至24h,去除发酵液,每孔用生理盐水轻轻冲洗,重复清洗多次。晾干酶标板后,再用浓度为1%的结晶紫染液对96孔板进行染色,15min后,倒出染液,再用生理盐水重复冲洗96孔板数次直至孔板透明,停止冲洗。待酶标板再次晾干后,每孔再加入200μL脱色剂,使用酶标仪测定其OD600值。以OD600值表示生物膜的生成量,结果见表4。
表4两株乳酸菌菌株的生物膜形成能力
由表4可知,LPChen和R1这两株乳酸菌的生物膜形成能力还是比较强,与R1菌株相比,LPChen菌株形成生物膜的能力更加突出,而R8菌株的生物膜形成能力比较差。
实施例6
乳酸菌耐酸性测定
选取乳杆菌数量级为109CFU/mL的PBS溶液进行本实验,离心(5000r/min,10min,4℃),加入等体积的模拟人工胃液,设置空白对照组,对照组直接使用109CFU/mL的PBS菌体溶液,37℃水浴培养两个小时,完成后采用梯度稀释法进行平板菌落计数,中间需要注意的是平均每隔30min摇晃1次,结束后使用梯度稀释法进行平板菌落计数。
表5植物乳杆菌菌株LPChen在人工模拟的胃肠道中存活性
由表5可知,R1、R3和R8菌株的胃肠道中存活率都相当高,可见植物乳杆菌菌株R3(LPChen)具有很好的耐酸性,在人工胃液中可存活2h。
由上述实施例可知,本发明提供的植物乳杆菌菌株LPChen具有较强的拮抗空肠弯曲杆菌能力,同时AI-2表达能力较强,且有很好的生物膜形成能力。推测,植物乳杆菌菌株LPChen的抑菌能力与AI-2表达有关,且与生物膜形成有关。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 衡阳师范学院
<120> 一种表达群体感应信号分子AI-2的植物乳杆菌菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1418
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctaaaaggt taccccaccg actttgggtg ttacaaactc tcatggtgtg acgggcggtg 60
tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatggtgat ccgcgattac tagcgattcc 120
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tcatgatgca agcaccaatc aataccagag ttcgtcga 1418
Claims (6)
1.一种表达群体感应信号分子AI-2的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LPChen,其特征在于,所述菌株LPChen的保藏编号为CCTCC NO:M 2019670。
2.一种用于防治空肠弯曲杆菌感染的益生菌制剂,其特征在于,包括权利要求1所述植物乳杆菌菌株LPChen。
3.根据权利要求2所述的益生菌制剂,其特征在于,所述植物乳杆菌菌株LPChen的活菌浓度为108~109CFU/mL。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌菌株LPChen或权利要求2或3所述益生菌制剂在食品或者食品添加剂中的应用。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌菌株LPChen或权利要求2或3所述益生菌制剂在生物膜制备中的应用。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌菌株LPChen或权利要求2或3所述益生菌制剂在制备抑制空肠弯曲杆菌的药物中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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